CARACTERIZACIN BIOQUMICA DE ESCHERICHIA COLI Y BACILLUS CEREUS.

Arroyo Rincn Ana Maria 1527168, Tobar Suarez Alexander 1525020, Ortiz Escobar Felipe
1523241

RESUMEN

Las pruebas bioqumicas consisten en identificar distintos microorganismos presentes, estas

pruebas han sido ampliamente utilizadas para identificar y diferenciar bacterias, se fundamentan
en demostrar las capacidades de los microorganismos. Entre las pruebas bioqumicas ms
utilizadas estn, TSI, Urea de Christensen, Lisina descarboxilasa, Movilidad, Citrato de Simmons,
Prueba de indol, Reaccin de rojo metilo, Voges Proskauer, Glucosa, Arabinosa, Xilosa,
reduccin de nitrato, hidrlisis de la gelatina, degradacin de la casena, hidrlisis del almidn.
El objetivo de esta prctica es realizar las diferentes pruebas bioqumicas con dos
microorganismos, Bacillus cereus y Escherichia coli.

PALABRAS CLAVES: Pruebas bioqumicas, Escherichia coli, Bacillus cereus.

OBJETIVO
Objetivo general:
1. Realizar pruebas bioqumicas a E. coli y B. cereus.

Objetivo especfico:
1. Estudiar los microorganismos y sus caractersticas segn las reacciones de las pruebas
bioqumicas.

INTRODUCCIN

Las pruebas bioqumicas se utilizan con frecuencia para identificar bacterias y levaduras ya que
las diferentes especies producen distintas enzimas. B. cereus son microorganismos ubicuos que
estn presentes en prcticamente todos los ambientes. Casi todas las infecciones se originan a
partir de una fuente ambiental por ejemplo tierra contaminada. Son Bacilos Gram positivos
mviles, formadores de esporas. Las personas de riesgo son las que consumen comida
contaminada con la bacteria (por ejemplo arroz, carne, vegetales, salsas), las que reciben
inyecciones intravenosas y pacientes inmunodeprimidos (Murray, Rosenthal, Pfaller, 2014).
Las enterobacterias son el grupo ms frecuente de bacilos gramnegativos que se cultivan en el
laboratorio clnico y junto con los estafilococos y los estreptococos son las bacterias que ms a
menudo producen enfermedades. La taxonoma de las Enterobacteriaceae es compleja y
rpidamente cambiante desde la aparicin de tcnicas que miden la distancia evolutiva. La
familia de las Enterobacteriaceae tiene las siguientes caractersticas. Son bacilos gramnegativos,
ya sea mviles con flagelos, peritricos o no mviles; se multiplican en medios con peptona o
extracto de carne sin que se aada cloruro de sodio u otros suplementos; se multiplican bien en
agar de MacConkey; proliferan en medios aerobios y anaerobios (son anaerobios facultativos);
fermentan en vez de oxidar glucosa, a menudo produciendo gas; catalasa positiva, oxidasa
negativa y reducen nitrato a nitrito (Brooks, Butel, Carroll, Mietzner, Morse, 2011).

METODOLOGA

Pruebas bioqumicas a colonias de E. coli: (Todas las siembras se incubaron por 24 horas a
36C)
TSI: En un medio estril se tom E. coli con un asa esterilizada, se sembr verticalmente en el
centro del agar TSI, luego se tom E. coli con un asa diferente y sembr por agotamiento en el
mismo agar.

Lisina descarboxilasa: En un medio estril se tom E. coli con un asa esterilizada, se sembr por
agotamiento en agar lisina descarboxilasa.

Citrato de Simmons: En un medio estril se tom E. coli con un asa esterilizada, se sembr por
agotamiento en agar citrato de Simmons.

Urea de Christensen: En un medio estril se tom E. coli con un asa esterilizada, se sembr por
agotamiento en agar urea de Christensen.

Movilidad: En un medio estril se tom E. coli con un asa recta esterilizada, se sembr
verticalmente en el centro del agar SIM.

Prueba de indol: En el tubo con medio SIM despus de incubado, se le agrego 3 gotas de reactivo
de Kovacs.

Reaccin del rojo de metilo: Se tom E. coli con un asa estril, se sembr en tubo con caldo MR
VP en un medio estril. Despus del tiempo de encubado se adicionaron 5 gotas de rojo de
metilo.

Reaccin de Voges Proskauer: Se tom E. coli con un asa estril, se sembr en tubo con caldo
MR VP en un medio estril. Despus del tiempo de encubado se adicionaron 5 gotas de sulfato
de Cobre.

Pruebas bioqumicas a colonias de Bacillus cereus. (Todas las siembras se incubaron por 24
horas a 36C)

Agar almidn: Se tom B. cereus con un asa estril, se sembr en agar almidn en una lnea
horizontal. Despus del tiempo de encubado se cubri la superficie con lugol.

Agar Gelatina: Se tom B. cereus con un asa estril, se sembr en agar gelatina en una lnea
horizontal. Despus del tiempo de encubado se aadi 5 gotas de cloruro de mercurio al 15%,
pasados 5 minutos se lav con agua.

Agar Leche: Se tom B. cereus con un asa estril, se sembr en agar leche en una lnea
horizontal. Despus del tiempo de incubado se aadi 2 mL de reactivo de Griess.

Caldo glucosa: Se tom B. cereus con un asa estril, se sembr en un caldo glucosa.

Caldo arabinosa: Se tom B. cereus con un asa estril, se sembr en un caldo arabinosa.

Caldo xilosa: Se tom B. cereus con un asa estril, se sembr en un caldo xilosa.

Caldo nitrato: Se tom B. cereus con un asa estril, se sembr en un caldo de nitrato. Despus
del tiempo de encubado se agreg 3 gotas de reactivo de Griess.

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 RESULTADOS

Tabla 1. Resultados obtenidos de las pruebas bioqumicas realizadas al microorganismo E. coli.

(+) Positivo (-) Negativo. *Separacin del agar, **No 2 .
TSI Voges Rojo
Urea Lisina Movilidad Citrato Indol
( ) P Metilo

E.
coli - -* +** + - + - +

Tabla 2. Resultados obtenidos de las pruebas bioqumicas realizadas al microorganismo B.

cereus. (+) Positivo (-) Negativo. *Sin gas.
Agar Agar Agar
Glucosa Arabinosa Xilosa Nitrato
Gelatina Almidn leche

B.
cereus + + + +* - - +

Caracterizacion bioquimica de Esherishia coli:

Figura 1.TSI no inoculado Figura 2.TSI inoculado Figura 3. Urea no inoculada Figura 4. Urea inoculada

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Figura 5. Lisina no inoculada. Figura 6. Lisina inoculada. Figura 7. Citrato no inoculado. Figura 8. Citrato inoculado.

Figura 9. RM sin reactivo Figura 10. RM con reactivo Figura 11. VP sin reactivo. Figura 12. VP con reactivo.

Figura 13. SIM no inoculado. Figura 14. SIM inoculado. Figura 15. SIM con reactivo de Kovacs.

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Caracterizacin bioqumica de Bacillus cereus:

Figura 16. Glucosa no inoculada. Figura 17. Glucosa inoculada. Figura 18. Arabinosa no inoculada Figura 19. Arabinosa
inoculada.

Figura 20. Xilosa no inoculada. Figura 21. Xilosa inoculada Figura 22. Nitrato sin reactivo. Figura 23. Nitrato con reactivo

Figura 24. Agar gelatina. Figura 25. Agar gelatina con reactivo.

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 Figura 26. Agar almidn inoculado. Figura 27. Agar almidn con reactivo.

Figura 28. Agar leche inoculado. Figura 29. Agar leche con reactivo.

DISCUSIN

Caracterizacin bioqumica de Escherichia coli:

El TSI es un medio de cultivo diferencial basado en la capacidad de los bacilos Gram negativos
de fermentar carbohidratos, de producir H2S y producir gas. En la prueba TSI (Figura 2) se
observa un desplazamiento total del agar, esto ocurre porque el E. coli es un microorganismo
aerogeno, que produce gas, en la (Figura 2) tambin se observa una coloracin amarilla en todo
el tubo lo cual ocurre debido a que el E. coli vuelve el medio cido, y da la certeza que E. coli
fermenta glucosa y lactosa (Winn, Allen, Janda, Koneman, Procop, Schrenckenberger, Woods,
2008).

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En la prueba de urea (Figura 4) se puede observar que no hubo cambio a color rojo, ya que en
esta prueba los microorganismos que hidrolizan la urea a travs de la enzima ureasa, liberan
amonaco lo cual produce un cambio de color rojo en el medio. Esta prueba se manifest negativa
con un color amarillo, lo que quiere decir que no hay actividad de la enzima ureasa en el
microorganismo E. coli (Rojas et al, 2006). En esta prueba tambin hubo una separacin lo que
indica una produccin de gas por parte de la E. coli.

La prueba lisina/hierro (Figura 5) se observa una coloracin prpura en todo el tubo, no hubo
cambios, lo cual indica que hay descarboxilacin de la lisina, esto quiere decir que este
microorganismo, E. coli, tiene la capacidad enzimtica para descarboxilar un aminocido para
formar una amina, con la consiguiente, alcalinidad. La prueba tambin se muestra negativa para
produccin de sulfuro de hidrgeno porque no se form sulfuro de hierro (color negro en el fondo)
(MacFaddin, 2003).

El citrato, en esta prueba se determina la capacidad que tiene un microorganismo de utilizar el

citrato de sodio como nica fuente de carbono para el metabolismo. Como se puede observar en
la (Figura 8), el medio de cultivo sigue igual, esto ocurre porque para la E. coli el citrato no es la
nica fuente de carbono para el metabolismo y crecimiento (Rojas et al, 2006).

La prueba de rojo de metilo (Figura 10), se manifest positiva ya que se mantuvo una coloracin
roja en el caldo, lo cual tambin indica que este es un medio cido. Esto ocurre porque la E, coli
tiene la capacidad de producir y mantener estables los productos terminales cidos de la
fermentacin de glucosa (MacFaddin, 2003).

En la prueba de Voges Proskauer (Figura 12) no se observ ningn cambio despus de la

incubacin por 20 min, permaneci el color prpura del reactivo. Pues el objetivo de esta prueba
es detectar la produccin de acetona el cual cambia a diacetilo en presencia de KOH y O2 el
cual se convierte en un complejo rojo en presencia de -naftol y creatinina. La produccin de
acetona es una va alternativa del metabolismo del cido pirvico, por esto esta prueba fue
negativa para cepas de E. coli, es decir este microorganismo no es capaz de producir un producto
neutro (MacFaddin, 2003).

En el agar SIM se realizaron dos pruebas, la primera la movilidad (Figura 14), en la cual se
manifest con un movimiento dbil, ya que todava se observa la trayectoria con la que fue
sembrada con el asa, sin embargo se observa la turbidez en el tubo, esto es porque este
microorganismo E. coli, posee la capacidad de moverse gracias a sus flagelos peritricos que
rodean su cuerpo, pues esta prueba determina la movilidad de los bacilos fermentadores y
aunque fue mnima fue positiva para este microorganismo. La segunda prueba, indol (Figura 15),
esta tambin se observa positiva, es decir el microorganismo tiene la capacidad de producir la
enzima triptofanasa que desdobla el aminocido triptfano en indol, cido pirvico y amonio
(Winn et al., 2008).

Segn todas las pruebas bioqumicas realizadas y la tabla de caracterizacin bioqumica de

microorganismos encontrada en el laboratorio, Escherichia coli es efectivamente el
microorganismo estudiado en la prctica.

Caracterizacin bioqumica de Bacillus cereus:

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Los resultados obtenidos en los medios donde se us B. cereus muestran las cualidades de esta
bacteria. El B. cereus es una bacteria perteneciente a la familia de las bacillaceae, la cual est
integrada por grmenes de forma bacilar voluminosos, esporulados, con espora elipsoidal central
o subterminal. Esta bacteria es normalmente mvil dado a sus flagelos peritricos, esta bacteria
es anaerobia facultativa, Gram positiva (Murray et al., 2014).

La prueba de reduccin de nitrato se observa positiva (figura 23) ya que hay un color rosado
fuerte en el caldo. La reduccin de nitrato a nitrito por lo comn se produce en condiciones de
anaerobiosis, en las cuales el microorganismo obtiene su oxgeno del nitrato. El oxgeno acta
como aceptor de aceptor de hidrgeno, es decir el protn y el aceptor final de electrones. Esta
respiracin anaerobia es un proceso de oxidacin por el cual el nitrato proporciona oxgeno para
que sirva como aceptor de electrones para suministrar energa (MacFaddin, 2003).

Tambin fermenta glucosa como se ve claramente en la (figura 17), en esta prueba se observ
un color amarillo que tambin indica que B.cereus es capaz de producir cido a partir de la
glucosa en condiciones anaerbicas ya que no hay produccin de gas.

El B. cereus no fermenta la arabinosa (Figura 19), al ver que el medio de cultivo no sufre ningn
cambio al realizar la incubacin, persiste el color naranja, entonces la arabinosa no es una fuente
de carbono del B. cereus (MacFaddin, 2003).

En el caldo xilosa (Figura 21), el resultado muestra que la prueba fue negativa ya que no hubo
cambio de color en el caldo, confirmando que el B. cereus no fermenta la xilosa. Cuando la xilosa
se fermenta, el rojo de fenol cambia de color a amarillo, indicando que hubo una alteracin en el
pH en donde a pH inferiores a 6,8, el cultivo vira a amarillo, a pH superiores a 8 el cultivo se torna
de color violeta, los pH entre 6,8 y 8 dan tonalidades graduales de color naranja (Dibico.com), es
decir como resultado, el caldo xilosa estaba alrededor de un pH de 8.

Se realizaron otras tres pruebas respecto a su caracterizacin bioqumica. En el agar gelatina

(Figura 25) se observ una zona clara alrededor del cultivo, esto quiere decir que este
microorganismo es capaz de hidrolizar la gelatina. La gelatina es una protena fibrosa, ciertos
microorganismos tienen habilidad para romper la molcula mediante la exoenzima gelatinasa,
liberando aminocidos que se usan como nutrientes. (Alarcn, 2001)

En el agar almidn (Figura 27) se observ despus de usar el lugol, una coloracin azul donde
no haba cultivo, en el cultivo se present una coloracin amarilla, lo cual es positivo y determina
que B. cereus es capaz de hidrolizar almidn. Lo que pasa aqu es que cuando el almidn
(amilasa) es hidrolizado por la accin de amilasas, se degrada a maltosa y glucosa, los cuales
son utilizados por el microorganismo como fuente de carbono y de energa (Alarcn, 2001).

En el agar leche (Figura 29), despus de haber aplicado el reactivo se observ una mnima
coloracin rosada, lo cual indica que el microorganismo es capaz de hidrolizar casena (Winn et
al., 2008). La casena es una protena encontrada en la leche; como todas las protenas, est
compuesta de aminocidos que son utilizados por los microorganismos como fuente de energa
y carbono. Cuando la casena es mezclada con un medio de cultivo, el medio pierde su
transparencia y se vuelve turbio debido a que la casena reacciona con los iones de
calcio. Cuando la enzima caseinasa cataliza la hidrlisis de la casena, los aminocidos
resultantes se disuelven y se torna de nuevo un color transparente alrededor de la colonia del
microorganismo. Con este se detecta la degradacin de la protena (Alarcn, 2001).

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 CONCLUSIONES

Las pruebas bioqumicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una va

metablica (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un
medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.
A partir de las pruebas bioqumicas de identificacin bacteriana, mediante estndares
establecidos, podemos conocer qu bacteria tenemos en una muestra problema basndonos en
sus reacciones metablicas las cuales son caractersticas de cada microorganismo.

Se identific cules son las caractersticas de la E. coli y el B. cereus, como aprovechan el medio
en el que se encuentran, realizando reacciones para as obtener su fuente de energa.

REFERENCIAS

Alarcn, Luis Alberto. (2001) Manual de prcticas de Microbiologa bsica y Microbiologa de

alimentos. Programa de Nutricin., UACJ, pag 35 39

Dibico. (n.d.). Caldo rojo de fenol con xilosa. Retrieved November 26, 2016, from
http://www.dibico.com/fichast/1224.pdf

Brooks, G. F., Butel, J. S., Carroll, K. C., Mietzner, T. A., & Morse, S. A. (2011). JAWETZ,
MELNICK & ADELBERG Microbiologa Mdica (25th ed.). Mexico, D.F.: Mc Graw Hill.

MacFaddin, J. F. (2003). Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia

clnica. Ed. Mdica Panamericana.

Pascual Anderson, Mara del Rosario, Caldern, Vicente (1999). Microbiologa Alimentaria:
Metodologa Analtica para Alimentos y Bebidas, Ediciones Daz de Santos, pag 93

Rojas N, Chaves E, Garca F. (2006) Bacteriologa Diagnstica, Costa Rica, Universidad de

Costa Rica, Facultad de Microbiologa.

Winn, W. C., Allen, S. D., Janda, W. M., Koneman, E. W., Procop, G. W., Schrenckenberger, P.
C., & Woods, G. K. (2008). Diagnstico microbiolgico. Texto y atlas en color. Sexta edicin.
Buenos Aires: Editorial Panamericana.