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Laboratorio de microbiologa II

EL USO DE LAS COLORACIONES EN LABORATORIO DE

MICROBIOLOGIA
INTRODUCCION
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el
microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio
que la rodea, conociendo que el protoplasma bacteriano tiene el mismo ndice de refraccin
que el agua, es indispensable emplear procedimientos de tinsion que permitan visualizarlas
Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la
presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas,
paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

OBJETIVOS

-Conocer la morfologa bacteriana y los mtodos de coloracin.

-Realizar coloraciones para diferenciar microorganismos.

-identificar microorganismos segn su morfologa y la afinidad al tipo de coloracin que

adquirio.

FUNDAMENTO TEORICO

Las bacterias son difciles de observarse al microscopio, por eso es indispensable emplear
procedimientos de coloraciones o tinciones biolgicas para visualizarlos adecuadamente y
demostrar los detalles finos de su estructura, tales como: flagelos, esporas, capsulas,
grnulos, metacromos, etc. Sin embargo, los colorantes deben emplearse en solucin
generalmente acuosa; los cuales previamente han sido disueltos empleando alcohol. Tambin
es necesario el empleo de mordientes, los cuales son sustancias que actan entre el tejido y
el colorante formando sales, permitiendo que la coloracin que de fuertemente fijada. E el
mordiente puede ser colocado sobre el preparado antes o despus de la accin de el
colarante principal: como el fenol, el oxalato de amonio, se mezclan con el cristal de violeta
en el mtodo gram, las estructuras bacterianas se colorean por diversos procedimientos con
colorantes propios para cada componente celular.

TIPOS
a) Simples: utilizacin de un solo tinte con el cual podemos evaluar
solamente la morfologa. Las tinciones simples es cuando toda la muestra
se tie del mismo color y se utiliza un solo colorante.
b) Compuestas especiales: constituidas por 2 ms tintes o reactivos y
sirven para clasificar las bacterias u observar sus caractersticas especiales.
c) Positivas: se observa teida la clula sobre un fondo claro.
d) Negativas: El fondo se tie de oscuro para observar la clula o
estructuras refringentes.
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Tinciones compuestas.
1. Tincin de Gram
Principio: Composicin de la pared celular de las bacterias, las bacterias G+
est compuesta por varias capas de peptidoglicanos, las bacterias G- tienen
una membrana externa con un componente estructural nico que son los
lipopolisacridos. Las bacterias G+ retienen el cristal-violeta despus de la
decoloracin y aparecen de color azul intenso (purpura), las bacterias G- no
son capaces de retener el cristal-violeta despus de la decoloracin y son
teidas de rojo con safranina.
Pasos:
a. Preparar la extensin del cultivo: En un portaobjetos limpio, libre de
grasa, y con un asa bacteriolgica colocar una pequea cantidad de la
colonia bacteriana.
a. Muestra solida: colocar solucin salina previamente a colocar la colonia,
igual en muestra semislida. Muestra liquida: colocar la colonia
directamente.
b. Dejar secar al aire, luego fijar la preparacin pasando la placa
rpidamente por el mechero (2 3 veces) La fijacin, procedimiento que
permite preservar estructuras celulares, se puede llevar a cabo con
diferentes tratamientos: fijacin por calor o fijacin qumica. La fijacin por
calor es la ms utilizada para la observacin de bacterias. Este
procedimiento consiste en pasar el portaobjetos, con la suspensin
bacteriana extendida y seca, a travs de una llama de un mechero. La
fijacin por calor preserva la morfologa externa de los microorganismos
pero no las estructuras internas. La fijacin qumica con agentes como
etanol, formaldehdo y cido actico entre otros muchos, se utiliza para
preservar las estructuras celulares.
c. Agregar violeta cristal durante 20 a 30 segundos (Colorante primario),
enjugar con agua seguidamente.
d. Agregar yodo Gram durante 40 a 60 segundos (mordente), enjuagar con
agua seguidamente
e. Agregar alcohol acetona y enjuagar con agua inmediatamente
(decoloracin, disuelve lpidos de la pared de G- )
f. Agregar safranina durante 20 segundos, enjuagar con agua
seguidamente.

Gram(+) Gram(-)
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2.Tincin de cido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen)

Principio: Se trata de un procedimiento de tincin diferencial, conocido
como mtodo de Ziehl-Neelsen, que tiene gran relevancia por su aplicacin
clnica. Permite poder distinguir aquellos microorganismos cuya coloracin
resiste la accin de alcoholes y cidos suaves (cido-alcohol resistentes) de
otros que no resisten la decoloracin (no cido-alcohol resistentes).
Representacin esquemtica de la composicin de la pared celular de las
micobacterias. Imagen en color en: www.medigraphic.com/rid Dentro de las
bacterias cido alcohol resistentes encontramos dos importantes patgenos:
Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, microorganismos
responsables de la tuberculosis y la lepra respectivamente. Estas bacterias
pertenecen al Phyllum Actinobacteria, un grupo grande y complejo de
bacterias gram positivas, que incluye a la Familia Mycobacteriaceae
caracterizada por contener en sus paredes celulares un alto contenido
lipdico, ceras con una gran diversidad de cidos miclicos, molculas de 60
a 90 tomos de carbono. La presencia de estos lpidos, en la cara externa de
la pared, hacen que estas bacterias sean muy resistentes a la accin de
compuestos qumicos presentes en su entorno, caracterstica que se utiliza
para aislar estos microorganismos: uno de los medios ms frecuentes es el
Loewenstein-Jensen con verde malaquita que permite el crecimiento
selectivo de estos microorganismos.
Procedimiento
a. Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequea porcin de
un cultivo bacteriano con el asa de siembra estril.
b. Hacer el frotis, formando una pelcula homognea sobre el portaobjetos
con el asa de siembra. Dejar secar.
c. Fijar la preparacin, pasando a travs de la llama del mechero el
portaobjetos.
d. Cubrir con unas gotas de fuchina fenicada y aplicar calor con un hisopo
de lana
e. de vidrio, mantener 5 minutos desde el comienzo de la emisin de
vapores
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f. Lavar el exceso de colorante con agua.

g. Aadir unas gotas de cido ntrico al 33% durante 30-40 segundos. Lavar
el exceso de colorante con agua.
i. Lavar la preparacin con alcohol de 96 durante 30 segundos.
j. Lavar con abundante agua.
k. Cubrir con el colorante de contraste, azul de metileno durante 1 minuto.
l. Lavar el exceso de colorante con agua.
m. Dejar secar al aire.
n. Aadir una gota de aceite de inmersin.
o. Observar con objetivo de inmersin (100 x).

Estas bacterias son resistentes al tratamiento con alcoholes y cidos suaves

conservando el colorante fundamental, mientras que organismos que no
posean esta caracterstica son rpidamente decolorados y pueden teirse
con el colorante de contraste en este caso azul de metileno.
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TINCIN DE SCHAEFFER-FULTON
Las esporas son formas de resistencia bacteriana. Tienen forma esfrica u
oval. Al microscopio las esporas sin teir se observan como grnulos
brillantes. Segn su localizacin se distinguen tres tipos de esporas:
Centrales, Subterminales, Terminales
Realizar el frotis
a. Cubrir el frotis con verde de malaquita
b. Calentar 5 minutos a emisin de vapores
c. Enjuagar con agua de la llave
d. Cubrir con la Safranina dejar actuar 1 minuto
e. lavar con agua de la llave y dejar secar al aire.