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Prctica N4: Cuantificacin de cidos Nucleicos y Efecto hipercrmico

del ADN

Despus de haber realizado la extraccin de ADN, y/o ARN para diversas


aplicaciones, se requiere conocer la cantidad y la calidad del cido nucleico obtenido.
Generalmente, se realiza mediante la medicin de la cantidad de irradiacin ultravioleta
absorbida por las bases o por la intensidad de fluorescencia por bromuro de etidio.
El efecto hipercrmico es el incremento de absorbancia en un material. La
hipercromicidad del ADN ocurre cuando el dplex se desnaturaliza, dando dos cadenas
sencillas que absorben ms en el ultravioleta. Esta caracterstica del ADN es una forma
de seguir el proceso de desnaturalizacin de la molcula: a medida que el proceso
avanza, se observa un incremento en la absorbancia.
Objetivos:
1. Identificar los mtodos de cuantificacin de cidos nucleicos
2. Adquirir conocimiento bsico para el manejo y funcionamiento del
espectrofotmetro para realizar la medicin del cido nucleico en estudio
3. Entender y verificar el efecto hipercrmico del ADN
Experimento I: Cuantificacin de cidos Nucleicos
Objetivos:
1. Realizar la medicin y cuantificacin del ADN por espectrofotometra
2. Conocer la calidad y cantidad del ADN obtenido en la extraccin realizada en clase
Teora:
Para cuantificar la cantidad de material obtenido despus de una extraccin de
cidos nucleicos o determinar la concentracin de ADN de alto peso molecular,
plsmidos o productos de PCR, o la sntesis qumica de un oligonucletido se debe
tomar una lectura a 260 nm y 280 nm. La lectura a 260nm permitir calcular la
concentracin de cidos nucleicos en la muestra. Con este mtodo pueden ser detectarse
concentraciones tan bajas como 2.5g/ml.
A pH neutro, una solucin de ADN a 1 mg/ml tiene una absorcin mxima a
260nm de 20 cuando se lee en una celda de 1cm (este valor es para ADN con G+C de
50%, sin embargo para muchas aplicaciones no es necesario considerarlo a menos que
sea muy extremo). En principio se toma como referencia que una Abs260 igual a1.0
corresponde a: una solucin de dsADN con una concentracin de 50 g /ml, una solucin
de ARN con una concentracin 40 ug/ml o una solucin de ssADN con una concentracin
de 20 ug/ml (cuando se trata de oligonucletidos).
La proporcin de la lectura entre 260 y 280 (DO 260/DO280) proporciona una
estimacin de la pureza del cido nucleico. Es as como preparaciones puras de ADN
tienen DO 260/DO280 entre 1.65-1.9. Cuando se trata de ARN el valor OD 260/OD280 es
muy cercano a 2.0. Si hay contaminacin con protenas o fenol u otras soluciones
empleadas durante la extraccin, el valor de la proporcin es menor a 1.6 y no es posible
cuantificar de manera precisa el ADN. Si no es posible cuantificarlo por este mtodo por
la poca cantidad de ADN obtenido (<250 ng/ml) o el ADN est contaminado con otras
sustancias que absorben radiacin ultravioleta, se puede realizar utilizando
fluorescencia inducida por luz UV emitida por el bromuro de etidio que se intercala en el
ADN, debido a que la cantidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN en
la muestra. De esta manera, puede estimarse la cantidad de cido nucleico, comparando
la fluorescencia producida por mi muestra en estudio, con una serie de estndares o
patrones.
Materiales y Reactivos
1. Buffer TE (Tris-HCl 10mM, pH 8; EDTA 1 mM)
2. ADN obtenido con anterioridad
3. Micropipetas y puntas estriles
4. Guantes
5. Espectrofotmetro
6. Cubetas de cuarzo
7. Toallas de papel o servilletas
8. Tubos eppendorf 1.5 ml
Procedimiento
1. Preparar 1ml de solucin de ADN diludo 1/100 en buffer TE.
2. Colocar la solucin de ADN en la cubeta de cuarzo y realizar la medicin a 260 nm y a
280 nm
3. Usar TE como solucin blanco si el ADN fue rehidratado con este buffer o agua
destilada, si fue esta la solucin de hidratacin
4. Realizar los clculos respectivos considerando:(A260) unidad = dsADN50 g /ml y el
factor de dilucin
Experimento II: Efecto hipercrmico
Objetivos:
1. Verificar el proceso de desnaturalizacin del ADN por incremento de la
absorbancia a 260 nm.
2. Identificar y determinar el punto de fusin (Tm) en una curva de desnaturalizacin
trmica (fusin) de una molcula de ADN
Teora:
Las disoluciones de la forma de doble hlice del ADN experimentan cambios
significativos en varias de sus propiedades fsicas cuando se someten a: a) pHs
extremados, 2) Temperatura, c) disminucin de la constante dielctrica del medio
acuoso por incorporacin de alcoholes, cetonas, etc y d) exposicin a la urea, amidas y
otros solutos similares. La viscosidad de las disoluciones de ADN disminuye, la
absorcin luminosa a 260 nm aumenta, la rotacin ptica se torna ms negativa y la
densidad de flotacin aumenta. Este cambio fsico del ADN se denomina
desnaturalizacin. Durante la desnaturalizacin no se rompen enlaces covalentes pero la
estructura duplo-helicoidal se desenrolla y se separa debido a que se interrumpe
cualquiera de las dos fuerzas responsables de mantener la estructura de doble hlice: los
puentes de hidrgeno y las interacciones del apilado entre bases sucesivas.
El cambio fsico ms fcil de utilizar como medida de la desnaturalizacin es el
incremento de la absorcin luminosa observada a 260 nm, el efecto hipercrmico. Las
bases purnicas y pirimidnicas (que son aromticas) as como sus correspondientes
nucletidos absorben la luz UV a 260 nm, sin embargo el ADN dplex nativo absorbe
mucho menos luz a 260 nm de lo que podra predecirse por la suma de la luz absorbida
por sus mononucletidos constituyentes. Al desnaturalizar el ADN por calor, se observa
que a cierta temperatura la absorbancia aumenta abruptamente en un 25 a 30% (hasta
un 40%) segn la muestra. El total de luz absorbida por un ADN completamente
desnaturalizado es casi igual al de un nmero equivalente de los correspondientes
mononucletidos libres. El porcentaje de incremento de absorcin se halla directamente
relacionado con el contenido de pares A-T, cuanto mayor la proporcin de pares A-T,
mayor el incremento de absorcin lumnica. Es decir, distintos ADNs aumentan la
absorbancia abruptamente a distintas temperaturas dependiendo del nmero de
puentes de hidrgeno.
El efecto hipercrmico se utiliza para cuantificar la cantidad de ADN que se tiene
en forma de doble hebra o de cadena sencilla. Al representar la temperatura frente a la
absorcin a 260 nm se observa una curva sigmoidea, con lo que se deduce que las
fuerzas que estabilizan la estructura helicoidal son cooperativas, es decir, cuesta mucho
romper las primeras interacciones estabilizantes, pero una vez conseguido el resto se
rompe muy fcilmente. Hay un umbral mnimo de energa a partir del cual el proceso de
desnaturalizacin es muy rpido.
El punto de fusin del ADN
La desnaturalizacin trmica del ADN recibe el nombre de fusin (melting). Las
muestras de distintos tipos de clulas poseen distintos puntos de fusin caractersticos,
definidos como Tm o Temperatura del punto medio de su curva de fusin, es decir, es
aquella donde el ADN est 50% desnaturalizado.
Tm aumenta de modo lineal con el contenido en pares G-C que son ms estables
que pares A-T. Cuanto ms pares G-C ms estable la estructura y mayor la energa
trmica necesaria para provocar su disrupcin.
Materiales y Reactivos:
1. Muestra de ADN
2. Bao de agua caliente
3. Cocinilla
4. Termmetro
5. Espectrofotmetro
6. Papel milimetrado
Procedimiento:
1. Diluir la muestra de ADN 1/100 para 1ml de solucin. Medir la absorbancia a 260 nm
(medida M1) utilizando TE como blanco.
2. Incubar la solucin de ADN hasta que alcance aproximadamente una temperatura de
90 C (unos 5 min) y valorar la absorbancia (medida M2).
3. Dejar enfriar lentamente hasta la temperatura ambiente, o bien meter
inmediatamente el tubo en hielo, y valorar la absorbancia tras unos minutos
(medida M3).
4. Con los datos proporcionados en clase de absorbancias a 260 nm a distintas
temperaturas de una muestra de ADN realizar la curva de desnaturalizacin trmica
para hallar el punto de fusin (Tm) de dicha muestra.
Cuestionario
1. Por qu se toman medidas en el espectrofotmetro a 280 nm?
2. Con que tipo de lmpara en el espectrofotmetro espera poder realizar la medicin?
3. Porque se utilizan cubetas de cuarzo para realizar esta medicin?
4. En qu consiste el equipo cuantificador de cidos nucleicos o Nanodrop?
5. Investigue que otros mtodos se utilizan en la actualidad para realizar la
cuantificacin de cidos nucleicos y cules son sus ventajas.
6. Por qu ocurre el hipocromismo del ADN?
7. Explique las etapas de desnaturalizacin del ADN.
Bibliografa
Ausubel F, Brent R, Kingston R, Moore D, Seidman J, Smith J y Struhl K, editores.
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