INFORME DE PRACTICA II

EXTRACCION DE ADN EN HISOPADO BUCAL

1. RESUMEN

Se realiz la extraccin de ADN a partir de una muestra de sangre

total y la otra de hisopado de la mucosa bucal. Para esto se trabaj
con la tcnica de SALTING OUT (sacando con sal) en ambas
muestras. Con la finalidad de poder evidenciar en ambos casos el
ADN extrado mediante sta tcnica.

2. INTRODUCCION

ADN es la abreviatura del cido desoxirribonucleico (en ingls,

DNA). Constituye el material gentico de los organismos. Es el
componente qumico primario de los cromosomas y el material
del que los genes estn formados. La extraccin de ADN requiere
una serie de etapas bsicas. En primer lugar tienen que romperse
la pared celular y la membrana plasmtica para poder acceder al
ncleo de la clula. A continuacin debe romperse tambin la
membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por ltimo hay que
proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo
hay que hacer que precipite en alcohol.
Por eso que en este informe de laboratorio mostramos, su
definicin y algunos conceptos y conocimientos que debemos
tener y estn relacionados a este tema; y tambin contiene la
prctica de laboratorio que realizamos y los clculos
correspondientes.

3. MATERIALES

Hisopado de mucosa bucal

Reactivo de lisis celular (R1)
Reactivo de lisis nuclear (R2),
Reactivo de precipitacin deprotenas (R3)
Trulas
Suero fisiolgico 0,9%
Gradilla
Tubos eppendorf
Micropipetas
1 centrifuga
1 vortex
Etanol al 70%
4. METODOS

1. Colocar el hisopo en el tubo eppendorf

2. Agregar 300 ul de buffer de Lisis + 2 ul de proteinasa K y
mezclar con la pipeta.
3. Incubar a 65C por 10 minutos
4. Pasado el tiempo retirar los hiposos del tubo con una pinza
tratando de que la mayor cantidad de lquido quede en el tubo.
5. Agregar 4 ul de RNAsa al tubo
6. Incubar a 37C por 30 minutos
7. Una vez terminada la incubacin, agregar 160 ul de MPC
(precipitante de protenas) , cerrar bien el tubo y llevarlo a vortex
por 10 segundos ( turbidez )
8. Centrifugar por 5 minutos a 13 000 rpm
9. Se debe obtener dos fases en el tubo
10. Retirar a un tubo nuevo el sobrenadante (transparente).
11. Agregar Isopropanol frio (aproximadamente 800 ul) y mezclar
por inversin unos minutos
12. Centrifugar a 13 000 rpm por 10 minutos (se observara un
pellet)
13. Eliminar el isopropanol por decantacin y proceder al lavado
del ADN
14. Agregar 500 ul de Etanol 75 y centrifugar nuevamente a 13
000 rpm de 1 2 minutos
15. Eliminar el Etanol y dejar secar en un termoblock a 65 por
unos minutos (tubo abierto)
16. Una vez que se evaporo todo el Etanol, resuspender en ADN en
100 ul de Agua ultrapura e incubar en calor de 3 4 minutos y
congelar hasta su uso.

5. RESULTADOS

Se obtiene un precipitado muy ligeramente coloreado. El cual fue

almacenado para realizar estudios posteriores

6. DISCUSIN
Se incubo la muestra de ADN a 65C, para permitir que el calor
suavice los fosfolpidos (grasas) en las membranas que rodean la
clula y el ncleo. Tambin desnaturalizan a las enzimas
desoxirribonucleicas (ADN asas) las cuales, si estn presentes
junto al ADN, pueden cortar el ADN en pedazos tan pequeos que
lo hara imposible de ver. Si las enzimas se desnaturalizan y el ADN
se desenrolla, ste pierde su forma y se vuelve inactivo. Las
enzimas se desnaturalizan a 60 Celsius y el ADN se desnaturaliza
a 80 Celsius. Por lo tanto la incubacin se realiz con el fin de
 poder desnaturalizar las enzimas presentes juntos al ADN y de
esta manera evitar que se dae el ADN por las enzimas DNasas. Al
realizar el procedimiento adecuadamente, resulta que las fibrillas
de ADN comenzaron a verse, de un color blanco precipitado por
sobre el isopropanol (mezcla heterognea). Para conservar el ADN
se procedi a realizarlos pasos finales de la tcnica. La molcula
de ADN se precipita en el alcohol fuera de la solucin, unindose
de tal forma que puede ser visto. Adems de permitirnos ver el
ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los
cuales son dejados en la solucin acuosa.

7. BIBLIOGRAFIA

Ral P. Ferreira. Extraccin de ADN micro escalado por salting

out departamento
biologamoleculaygentica.http://www.hospitalameijeiras.sld.cu/hh
a/mpm/documentos/biologia%20molecular%20y
%20genetica/gp/extraccion%20de%20dna%20micro%20escalado
%20por%20salting%20out.pdf
Biologa Molecular y Herencia. Robert A. Wallace, Jack L. King,Gerald P.
Sanders., 1a edicin. Editorial Trillas. Mxico 1991: pgina97, 98.