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Equipo 8
Rubro Valo Calificaci
Seccin 2
6QM1 r n
Hiptesis y diseo 3%
Alumnos: experimental
Objetivos 1%
Registro de datos 3%
Profres. Manejo de datos 4%
QBP. Odilia Garca Discusin de 5%
Aquino resultados
QBP. Susana Alfaro Conclusiones 3%
Aguilar Bibliografa 1%
Total
16 de Abril de 2013
Prctica. Oxidacin de azufre y de ion ferroso por bacterias quimiolitotrficas.
Hiptesis
Dado que Thiobacillus thiooxidans es una bacteria quimiolitotrfica oxidante del azufre
(sulfuro oxidante) que transforma el azufre en cido sulfrico, y que crece mejor en un
medio acido (pH 2.0-6.0) [1].
Si se coloca a Thiobacillus thiooxidans en un medio donde hay 500 mg de azufre como
sustrato, y condiciones de agitacin que favorezcan el contacto bacteria-azufre-oxgeno
ENTONCES se encontrar tras un periodo de incubacin que una parte de ese azufre
elemental ha sido transformado en cido sulfrico (detectable como acidez titulable y
sulfatos precipitables)
Diseo experimental.
Se determin la oxidacin de azufre y del in ferroso por bacterias quimiolitotrficas,
inoculando tres medios de cultivo con diferentes fuentes de energa, en condiciones de
agitacin y en cultivos estacionarios, comparndolos con los testigos correspondientes,
los cuales no contenan el inoculo de las bacterias quimiolitotrficas, ya que la oxidacin o
productos que se obtuvieran serian por la oxidacin abitica de los compuestos. Se
determin el azufre residual para que, indirectamente, el clculo del azufre utilizado por un
cultivo de bacteria quimiolitotrfa Thiobacillus thiooxidans as como su acidez, ya que se
sabe que en el ciclo de estas bacterias, existe produccin de sulfatos y sulfitos [1], que en
medio acuoso dar cido sulfrico y la determinacin de azufre a sulfatos, en un medio
que contena azufre elemental como fuente de energa.
Se determin el tiosulfato residual de la bacteria quimiolitotrfa Thiobacillus thioparus en
un medio que contena tiosulfato de fierro como fuente de energa, as como la acidez
titulable y el pH.
Se determin la oxidacin del in ferroso en un medio de cultivo que estaba inoculado
con la bacteria quimiolitotrfa Thiobacillus ferrooxidans, y el cual tena como fuente de
energa sulfato ferroso.
Todos los cultivos se compararon con los testigos correspondientes, los cuales no
contenan el inoculo de la bacteria correspondiente, igualmente se encontraban en
condiciones de agitacin, as como estacionarios.
Los fundamentos de las determinaciones realizadas fueron:
ACIDEZ TITULABLE (Formacin de cido sulfrico por actividad bacteriana) Mtodo:
valoracin cido-base (reaccin de neutralizacin). Se basa en la titulacin del cido, en
este caso H2SO4, presente en la muestra, utilizando una solucin valorada de NaOH,
hasta alcanzar el equilibrio qumico de la reaccin. El punto final de la neutralizacin
estequiomtrica se pone de manifiesto con el cambio en la coloracin de la fenolftalena al
pH ms cercano al punto de equivalencia. [2].
DETERMINACIN DE AZUFRE DE SULFATOS.- Mtodo: reaccin de precipitacin. La
formacin de BaSO4 (precipitado), es una prueba comn en la determinacin del in
sulfato (SO4=). El mtodo consiste en la generacin de un precipitado mediante la
siguiente reaccin:
SO4= + BaCl2 BaSO4 (pp) + 2Cl-
MnO4 MnO2
Objetivo general.
Cuantificar los productos procedentes del metabolismo de los microorganismos
quimiolittrofos.
Determinar si existe alguna diferencia en la actividad metablica de los
microorganismos quimiolittrofos al colocarlos en condiciones de alta aireacin y
superficie de contacto (cultivo agitado) y un cultivo estacionario.
Objetivos particulares.
Microorganism Cultivos
os cultivados
Agitados Estacionario
Con inoculo Sin inoculo Con inoculo Sin inoculo
Thiobacillus thiooxidans Medio de cultivo A
1.- Azufre residual
a) mg de papel 0.8411 0.8373 0.8408 0.8548
b) mg de papel + muestra 1.3623 1.3389 1.3372 1.3627
2.- Acidez titulable
a) Volumen total 40 42 45 40
(mL)
b) Gasto de NaOH/alcuota (mL) 7.05 1.35 1.6 1.5
3.- Azufre de sulfato formado
a) Alcuota para 0.2 1 1 1
determinacin
(mL)
b) Absorbancia obtenida 0.393 0 0.037 0
4.- pH 1.7 4.3 3.6 4.7
Thiobacillus thioparus Medio de cultivo B
1.- Tiosulfato residual
a) Volumen total 44 43.5 43.5 39
(mL)
b) Gasto de yodo/alcuota 0.1 11.5 1.2 13.4
2.- Acidez titulable
a) Gasto de 8.6 1.8 3 1.8
NaOH/alcuota
(mL)
3.- pH 1.21 5.24 2.11 5.74
Thiobacillus ferrooxidans Medio de cultivo C
1.- In ferroso
a) Volumen total 45 40 44 48
(mL)
b) Gasto de KMnO4 3.1 15.5 9.2 15.7
2.- pH 1.37 1.94 1.83 1.8
Tabla 1. Determinacin indirecta del crecimiento de bacterias quimiolitotrfos en
condiciones de agitacin y estacionarias.
Se obtiene mediante un mtodo gravimtrico, obteniendo las diferencias entre los pesos
de los papeles y el peso de los papeles despus del filtrado.
Cultivos
Agitados Estacionario
Con Sin Con Sin
inoculo inoculo inoculo inoculo
mg de papel 841.1 837.3 840.8 854.8
mg de papel +
muestra 1362.3 1338.9 1337.2 1362.7
mg de azufre
(diferencia) 521.2 501.6 496.4 507.9
Los mg de azufre utilizado se calculan al restar los mg de azufre de los cultivos sin inoculo
a los mg de azufre con inoculo. Para los tratamientos en agitacin e tiene que:
mg de azufre utilizado=512.1501.6
mg de azufre utilizado=10.5
mg de azufre utilizado=496.4507.9
mg de azufre utilizado=11.5=0
Los mg de H2SO4 formados se determinaron por medio de una titulacin cido base, por lo
que el clculo de mg de H2SO4 se obtiene con la siguiente frmula:
Alcuota
Donde:
VT = Volumen total obtenido
N NaOH= normalidad del hidrxido de sodio (0.1 N)
Gasto de NaOH= mL de NaOH utilizados para la titulacin
Pmeq= Peso miliequivalente del H2SO4 = 46
Alcuota= alcuota de muestra titulada
400.17.0546
mg H 2 SO 4=
5
mg H 2 SO 4=259.44
Cultivos
Agitados Estacionario
Con Sin Con Sin
inoculo inoculo inoculo inoculo
mg de H2SO4 259.44 52.164 66.24 55.2
Para obtener los mg de H2SO4 formado se debe de tomar en cuenta los mg de H 2SO4
formados en los tratamientos sin inoculo. Para el tratamiento con agitacin se tiene:
mg H 2 SO 4=259.4452.164
mg H 2 SO 4=207.276
mg H 2 SO 4=66.2455.2
mg H 2 SO 4=11.04
Cultivos
Agitados Estacionario
mg de H2SO4
formados 207.76 11.04
g de S de Absorbancia a 445
SO4 nm
0 0
24 0.012
72 0.123
120 0.215
168 0.28
192 0.33
216 0.382
240 0.458
0.5
0.45
0.4 f(x) = 0x - 0.02
0.35
0.3
0.25
Absorbancia a 445 nm
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 50 100 150 200 250
g de S de SO4
y=0.0019 x0.0166
Donde
x = g de S de SO4
y= absorbancia obtenida.
Para el tratamiento en agitacin con inoculo se tiene que:
0.393+0.0166
g de S de SO4=
0.0019
g de S de SO 4=215.57
Para este tratamiento se debe de tomar en cuenta que la alcuota tomada fue de 0.2 mL
por lo que al resultado de g de S de SO 4 se debe de multiplicar por el inverso de la
alcuota. Para el tratamiento en agitacin y con inoculo se obtiene:
215.571
g de S de SO 4=
0.2
g de S de SO 4=1077.85
mg de S de SO 4=1.077
0.037+ 0.0166
g de S de SO 4=
0.0019
g de S de SO 4=28.21
mg de S de SO 4=0.02821
Para los tratamientos sin inoculo de ambas condiciones (agitados y estacionarios) el valor
de absorbancia obtenida es igual a 0, por lo que las concentraciones de g de S de SO 4
es igual a 0.
Cultivos
Agitados Estacionario
S de SO4 formado
(mg) 1.077 0.02821
Los mg de tiosulfato residual se determino mediante una titulacin, por lo que el clculo
de mg de tiosulfato residual se obtiene con la siguiente frmula:
Alcuota
Donde:
440.010.1112
mg S 2 O3=
5
mg S 2 O3=0.9856
Cultivos
Agitados Estacionario
Con Sin Con Sin
inoculo inoculo inoculo inoculo
mg de Tiosulfato
residual 0.9856 112.056 11.69 117.06
Para obtener los mg de tiosulfato oxidado se debe de tener en cuenta que los medios se
prepararon con Na2S2O3, por lo que se debe de calcular un factor gravimtrico que nos
permita el calcular solamente el tiosulfato oxidado.
Si se tienen 0.25 g de Na2S2O3 con un peso molecular de 158 g/mol, cuantos gramos se
tienen de S2O3 si su peso molecular es de 112 g/mol:
mg S 2 O3 oxidado=1770.9856
mg S 2 O3 oxidado=176.01
Cultivos
Agitados Estacionario
Con Sin Con Sin
inoculo inoculo inoculo inoculo
mg de Tiosulfato
oxidado 176.01 64.94 165.31 59.94
Para obtener los mg de tiosulfato oxidado se debe de tomar en cuenta los mg de tiosulfato
oxidado en los tratamientos sin inoculo. Para el tratamiento con agitacin se tiene:
mg S 2 O3 oxidado=176.0164.94
mg S 2 O3 oxidado=111.07
mg S 2 O3 oxidado=165.3159.94
mg S 2 O3 oxidado=105.37
Cultivos
Agitados Estacionario
mg de Tiosulfato
oxidado 111.07 105.37
Los mg de H2SO4 formados se determinaron por medio de una titulacin cido base, por lo
que el clculo de mg de H2SO4 se obtiene con la siguiente frmula:
Alcuota
Donde:
440.18.646
mg H 2 SO 4=
5
mg H 2 SO 4=348.128
Cultivos
Agitados Estacionario
Con Sin Con Sin
inoculo inoculo inoculo inoculo
mg de H2SO4 348.128 72.036 120.06 64.584
Para obtener los mg de H2SO4 formado se debe de tomar en cuenta los mg de H 2SO4
formados en los tratamientos sin inoculo. Para el tratamiento con agitacin se tiene:
mg H 2 SO 4=276.092
mg H 2 SO 4=120.0664.584
mg H 2 SO 4=55.476
Cultivos
Agitados Estacionario
mg de H2SO4
formados 276.092 55.476
1.- In frrico.
Los mg de in frrico formado se determino mediante una titulacin con KMnO 4, por lo
que el clculo de mg de in frrico se obtiene con la siguiente frmula:
Alcuota
Donde:
450.13.156
mg Fe=
10
mg Fe=78.12
Cultivos
Agitados Estacionario
Con Sin Con Sin
inoculo inoculo inoculo inoculo
mg de Fe 78.12 347.2 226.688 422.016
Para obtener los mg de Fe formado se debe de tener en cuenta que los medios se
prepararon con FeSO4*7H2O, por lo que se debe de calcular un factor gravimtrico que
nos permita el calcular solamente el ion Fe.
Si se tienen 2.1 g de FeSO 4*7H2O con un peso molecular de 278 g/mol, cuantos gramos
se tienen de Fe si su peso molecular es de 55 g/mol:
mg Fe formado=42378.12
mg Fe formado=344.88
Cultivos
Agitados Estacionario
Con Sin Con Sin
inoculo inoculo inoculo inoculo
mg de Fe formado 344.88 78.5 196.312 0.984
Para obtener los mg de Fe formado se debe de tomar en cuenta los mg de Fe formado en
los tratamientos sin inoculo. Para el tratamiento con agitacin se tiene:
mg Fe formado=344.8878.5
mg Fe formado=266.38
mg Fe formado=196.3120.984
mg Fe formado=195.328
Cultivos
Agitados Estacionario
mg de Fe formado 266.38 195.328
Se muestran los datos de todos los clculos en la siguiente tabla:
Discusin de resultados.
La variable analizada en los experimentos es la agitacin de uno de los medios y el hecho
de que el otro estuviera en condiciones estacionarias. El microorganismo utilizado y las
dems condiciones de cultivo, adems del medio utilizado fue el mismo.
Lo que se realiz fue determinar indirectamente el crecimiento de los microorganismos
quimiolittrofos mediante la estimacin de los sustratos residuales o de los productos
oxidados.
Se montaron de igual forma matraces de los medios estacionarios y agitados pero sin
inoculo, esto con el fin de obtener la cantidad de productos oxidados solo por los
microorganismos, ya que la oxidacin abitica de las formas de azufre reducido puede
ocurrir en forma espontnea pero es un proceso muy lento. [11]
Por lo cual se resto la cantidad de productos oxidados y sustratos residuales obtenidos en
los matraces sin inoculo a los inoculados en tratamientos iguales, es decir: agitados o
estacionarios.
Se determin el crecimiento de Thiobacillus thiooxidans, el cual es un microorganismo
quimiolitotrfo, perteneciente a las bacterias oxidadoras del azufre, por lo tanto va a
utilizar al azufre elemental que estaba en el medio como un donador de electrones,
oxidndolo hasta sulfatos, estos sulfatos al ionizarse se transforman en cido sulfrico. [3]
Conclusiones.
La cantidad de productos oxidados y metabolitos solubles en el medio, generados
a partir del metabolismo de los organismos quimiolittrofos son directamente
proporcionales al crecimiento de dichos microorganismos (biomasa).
La agitacin favorece la aireacin y la superficie de contacto de los
microorganismos con las partculas minerales.
En condiciones de agitacin los microorganismos quimiolittrofos empleados
produjeron mayor cantidad de metabolitos solubles en el medio.
El metabolismo de Thiobacillus thiooxidans y Thiobacillus thioparus produce la
acidificacin del medio de cultivo al llevar a cabo la oxidacin de un compuesto
mineral.
Los microorganismos quimiolittrofos utilizados utilizan como donador de
electrones el CO2 y como aceptor final de electrones el O2.
Bibliografa.
[1] Cook, Thomas M. (1964) Growth of Thiobacillus thiooxidans in shaken culture. J.
Bacteriol. 88:620623.
[2] UNAM (2001), Diccionario enciclopdico de hidrologa y ciencias afines, pp. 260
[3] Curtis, H. 2000. Biologa. Editorial Mdica Panamericana. 7Edicin. Espaa. Pg. 471
[4] De la Lanza, G. et al. Diccionario de hidrologa y ciencias afines. Editorial P y V. Pg.
260.
[5] Blasxo, M. Microbiologa del suelo. Editorial Instituto Interamericano de Ciencias
Agrcolas. Costa Rica. Pg. 183.
[6] Atlas, R., Bartha, R. Ecologa microbiana y microbiologa ambiental. Editorial Pearson
Addison Wesley. 4 Edicin. Madrid. 2002. Pg. 422-433.
[7] Hernndez, A. 2003. Microbiologa industrial. Editorial EUNED. Costa Rica. Pg. 44.
[8] Valcarcl, M. 2000. Principles of Analytic Chemistry. Editorial Springer. Espaa. Pg.
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[9] Christen, H. 1977. Qumica general. Editorial Revert. Espaa. Pg. 31.
[10] Gennaro, A. 2000. Remington. Farmacia. Editorial Mdica Panamericana. 2Edicin.
Pg. 346
[11] Sylvia, D., P. Hartel.2005. Principles and Aplications of soli microbiology. Editorial
Pearson Prentice Hall. 2Edicin. EUA. Pg. 136, 158.