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Universidade Federal do Maranho

Centro de Cincias Exatas e Tecnologia


Curso: Engenharia Qumica
Disciplina: Bioqumica de Alimentos
Docente: Prof. Dr . Alexandra Martins dos Santos Soares
Discente: Rodrigo Pereira Vieira
Matrcula: 2014005307

Estudo Dirigido

Questes:

1) Qual a importncia do entendimento sobre o metabolismo para o


desenvolvimento de processos de produo de alimentos produzidos por
microrganismos?
2) Como funciona e quais so as aplicaes do espectrofotmetro?
3) Quais seriam os passos necessrios para se obter um extrato rico em protena?
Justifique suas escolhas.
4) Descreva detalhadamente o processo de quantificao de protenas pelo mtodo
de Bradford.
5) Defina e explique, mencionando aplicaes:
a) Dilise
b) Liofilizao
c) Eletroforese
d) Cromatografia (explicar os tipos de cromatografia vistos em aula)

Respostas:

1) As reaes qumicas que fazem parte do metabolismo microbiano so, em


muitos casos, essenciais para que haja modificaes benficas em um alimento,
de modo a transform-lo em um novo alimento. Importantes exemplos dessa
relao entre alimentos e microrganismos so os alimentos fermentados, como
vinhos, queijos, pes e cervejas, cuja fabricao depende de processos
fermentativos realizados por microrganismos. Dessa forma, a adio de
determinados microrganismos e o estmulo atividade biolgica de
microrganismos preexistentes constituem prticas necessrias obteno de
alguns produtos alimentcios. Alm disso, o estudo das transformaes qumicas
decorrentes da presena desses seres fundamental para que se compreenda o
processo de deteriorao dos alimentos, que modifica caractersticas como cor,

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sabor, odor, textura e aspecto e est relacionado proliferao de
microrganismos que utilizam aquele alimento como fonte de energia.

2) A espectrofotometria consiste em uma tcnica analtica que permite a


identificao e a determinao da concentrao de componentes de uma soluo
a partir da medida da absoro e de transmisso de luz, com base nas leis de
Lambert e Beer, que relacionam a variao da intensidade de um feixe de luz
monocromtico espessura do meio absorvente e concentrao da substncia
absorvente, respectivamente. Com base nesses princpios, essa tcnica
empregada em anlises qualitativas (identificao de substncias) e quantitativas
(determinao das concentraes de substncias) em diversas aplicaes, que
incluem anlises clnicas e processos industriais. O espectrofotmetro o
aparelho utilizado nessa tcnica, e os seus principais componentes so a fonte de
luz, o colimador, o monocromador, a fenda seletora, o compartimento de
amostras, a cubeta, a clula fotoeltrica e o amplificador. A fonte fornece feixes
de luz, cujas direes so alteradas pelo colimador para que incidam sobre o
monocromador, que fraciona a luz em feixes monocromticos (caracterizados
por diferentes comprimentos de onda). Em seguida, a fenda seletora, de acordo
com a posio para a qual foi ajustada, permite a passagem apenas de
determinado comprimento de onda para o compartimento de amostras, onde se
encontra a cubeta, que consiste em um recipiente transparente que contm a
soluo a ser analisada. Parte da luz do feixe transmitida e outra parte
absorvida; a frao transmitida detectada pela clula fotoeltrica, que emite um
sinal eltrico proporcional intensidade luminosa do feixe transmitido. Esse
sinal eltrico passa pelo amplificador e o valor resultante visualizado. A partir
dos valores observados, constri-se uma curva-padro que relacione os valores
da absorbncia e da concentrao, o que possibilita que seja encontrado um fator
de converso que relacione essas duas grandezas e que, consequentemente, a
concentrao de uma soluo seja calculada diretamente a partir do seu
comportamento tico.

3) O primeiro passo necessrio para a obteno do extrato o rompimento das


clulas que constituem o tecido que contm a protena desejada; a soluo obtida
nessa primeira etapa denominada extrato bruto. Esse extrato pode ser
submetido a centrifugao diferencial para que organelas especficas sejam
isoladas. Posteriormente, o extrato (ou preparao de organelas) deve ser
submetido a processos de fracionamento, que separam as protenas em diferentes
fraes de acordo com propriedades como tamanho e carga. Uma importante
tcnica empregada com esse objetivo a adio de sulfato de amnio, que se
baseia no efeito de salting out, que consiste na reduo da solubilidade de
protenas na presena de alguns sais; dessa forma, a adio desse sal provoca a
precipitao seletiva de certas protenas, o que possibilita que, por meio de
centrifugao de baixa rotao, as protenas que precipitaram sejam separadas
daquelas que permaneceram em soluo. A soluo protica resultante pode ser
submetida tcnica de dilise (que se baseia na separao de substncias atravs
de uma membrana semipermevel, de acordo com seu tamanho molecular) para
que o sulfato de amnio seja removido. Os procedimentos de fracionamento

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prosseguem com a utilizao de tcnicas cromatogrficas ou eletroforticas. As
tcnicas cromatogrficas separam as protenas de acordo com propriedades
como tamanho, carga e afinidade de ligao, que influenciam a velocidade de
migrao de uma soluo protica tamponada (fase mvel) ao longo de uma
coluna de material poroso com propriedades qumicas adequadas (fase
estacionria); as tcnicas eletroforticas, por sua vez, fundamentam-se nas
diferenas entre os movimentos de diferentes protenas quando submetidas a
determinado potencial eltrico, de acordo com caractersticas como a forma e a
razo carga-massa dessas protenas.

4) O mtodo de Bradford consiste em um ensaio colorimtrico para quantificao


de protenas que apresentam aminocidos de cadeias laterais bsicas ou
aromticas; essa tcnica baseada na converso da colorao do corante
Coomassie Brilliant Blue, que apresenta, em ambiente cido, a colorao
avermelhada tpica da sua forma catinica protonada a uma forma no protonada
de colorao azulada. O reagente Coomassie Brilliant Blue pode ser preparado
por meio da dissoluo do corante homnimo em etanol, seguida de agitao da
soluo resultante e da adio de cido fosfrico concentrado. Esse reagente
deve ser adicionado a solues de contedo protico conhecido, que sero
submetidas a espectrofotometria para que seja traada a curva-padro (que
relaciona a absorbncia concentrao de protena) e o fator de converso que
relaciona essas duas grandezas entre si seja determinado. importante lembrar
que o comprimento de onda de 595 nm (que corresponde ao mximo de
absoro da forma no protonada do corante) deve ser selecionado no
espectrofotmetro e que o aparelho deve ser zerado com o contedo do tubo
branco (de concentrao nula). Aps a construo da curva-padro e o clculo
do fator de converso, obtm-se a equao que correlaciona a absorbncia e a
concentrao de protena; ento, o reagente deve ser adicionado soluo cujo
contedo protico deve ser quantificado. Essa soluo , ento, submetida a
espectrofotometria para que sua absorbncia seja determinada, o que possibilita
o clculo da sua concentrao.

5) a) A dilise consiste em um procedimento que separa solutos de acordo com o


seu tamanho. Nesse procedimento, a soluo colocada em uma bolsa (ou um
tubo) composta por uma membrana semipermevel, suspensa em um volume
muito maior de uma soluo de fora inica adequada; dessa forma, h troca de
substncias de pequeno tamanho molecular (inferior ao do poro da membrana)
entre as duas solues, at que as concentraes dessas substncias no interior
da bolsa membranosa e no seu exterior se equilibrem. Essa tcnica pode ser
utilizada, por exemplo, para remover sulfato de amnio (utilizado para precipitar
seletivamente determinadas protenas) de solues proticas.

b) A liofilizao um mtodo utilizado na preparao de protenas desidratadas.


Trata-se de uma tcnica necessria para a manuteno das propriedades dessas
protenas por longos perodos a temperaturas ambientes, pois solues proticas
que no so submetidas a esse processo sofrem desnaturao facilmente, em

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decorrncia da ocorrncia de reaes como hidrlise e desamidao, o que pode
resultar em perda da eficcia clnica dessas protenas e em aumento do risco de
efeitos colaterais negativos. Essa tcnica se inicia com uma etapa de
congelamento, em que o produto a ser liofilizado imobilizado e sua atividade
bioqumica interrompida, seguida de desidratao por sublimao e, em
seguida, de dessoro. As etapas de secagem so realizadas a baixas
temperaturas e presses reduzidas.

c) A eletroforese consiste em uma tcnica de preparao de protenas que se


baseia no movimento de protenas submetidas a determinado potencial eltrico.
A eletroforese de protenas geralmente realizada em gis de polmeros
reticulados de policrilamida, que atuam como peneiras moleculares que retardam
a migrao das protenas de acordo com a sua razo carga-massa e sua forma.
Os gis tambm minimizam movimentos proticos no relacionados ao campo
eltrico e minimizam correntes de conveco relacionadas a pequenas diferenas
de temperatura. As protenas podem ser visualizadas aps a eletroforese por
meio da adio de corantes como o azul Coomassie; diferentes bandas
representam diferentes protenas ou subunidades de protenas. Essa tcnica pode
ser utilizada para estimar a quantidade de diferentes protenas presentes em uma
mistura, o grau de pureza de uma preparao protica ou a massa molecular de
uma protena (as molculas menores se movem mais rapidamente atravs do gel,
sendo, portanto, encontradas mais prximas da sua base aps a eletroforese).

d) A cromatografia uma tcnica utilizada para a identificao e a separao de


compostos com base em diferenas de propriedades como tamanho, carga e
afinidade de ligao; as diferenas que substncias distintas apresentam em
relao a essas propriedades influenciam a sua velocidade de migrao atravs
de uma coluna de material slido poroso. A soluo tamponada que contm as
substncias de interesse chamada de fase mvel, enquanto a coluna de material
poroso chamada de fase estacionria. H diferentes tipos de cromatografia, que
diferem entre si de acordo com as propriedades moleculares em que se baseiam.
A cromatografia de excluso por tamanho se fundamenta nas diferenas de
tamanho entre as protenas; a fase estacionria composta por grnulos de
polmeros reticulados com cavidades de tamanho adequado para que apenas as
menores molculas sejam capazes de atravess-las, o que retarda o movimento
dessas molculas e faz com que as protenas grandes atravessem a coluna mais
rapidamente. Esse tipo de cromatografia tambm pode ser utilizado para estimar
o tamanho molecular de uma protena. A cromatografia de afinidade, por sua
vez, explora a afinidade de ligao de determinadas protenas a grupos qumicos
(ligantes) presentes nos grnulos da fase estacionria; dessa maneira, as
protenas que apresentam essa afinidade se ligam matriz medida que se
deslocam atravs da coluna e no emergem do lado oposto. Ento, realiza-se
uma lavagem para retirar as protenas que no se ligam coluna e as protenas
ligadas so eludas com o auxlio de solues que apresentam altas
concentraes de sais (que enfraquecem as ligaes entre as protenas e a matriz)
ou de ligantes livres (que competem com os ligantes presenta nos grnulos e
liberam as protenas que haviam se ligado fase estacionria). Um terceiro tipo

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dessa tcnica a cromatografia de troca inica, que se baseia nas diferenas de
sinal e de magnitude das cargas eltricas das protenas em determinado pH. A
fase estacionria, nesse caso, composta por uma resina sinttica que apresenta
grupos carregados (aninicos ou catinicos) ligados; diferentes protenas
apresentam afinidades distintas por esses grupos e, consequentemente, diferentes
velocidades de migrao atravs da matriz. A cromatografia lquida de alto
desempenho consiste em um aperfeioamento dos mtodos cromatogrficos;
consiste na utilizao de bombas de alta presso com o objetivo de acelerar o
movimento das molculas proticas atravs das colunas, reduzindo o seu tempo
de trnsito e, consequentemente, limitando a disperso das bandas proticas por
difuso, o que melhora a sua resoluo.

Referncias:

BRUNO, A. N. Biotecnologia I: Princpios e Mtodos. Artmed, 2014.

FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos Alimentos. 1


edio. Atheneu, 2014.

NELSON, D. L; COX, M. M. Princpios de Bioqumica de Lehninger. 6 edio.


Artmed, 2014.

TATTINI JR, V.; PARRA, D. F.; PITOMBO, R. N. de M. Influncia da taxa de


congelamento no comportamento fsico-qumico e estrutural durante a
liofilizao da albumina bovina. Revista Brasileira de Cincias Farmacuticas,
vol. 42, n. 1, jan./mar. , 2006.

<www.ufrgs.br>. Acesso em 08/04/2017.

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