Cultivos Tropicales, 2002, vol. 23, no. 3, p.

97-100

INFLUENCIA DE DIFERENTES VARIABLES EXPERIMENTALES

EN LA COMPOSICIN DEL COMPLEJO DE BIOFLAVONOIDES
DEL LIMN (CBL)
O. Cartaya, Ins Reynaldo y Clara Nogueiras
ABSTRACT. This work was aimed at studying the influence
of different experimental variables: residue/water (w/v)
proportion, extraction temperature and time on yield and LBC
composition through a 23 factorial experimental design, each
experiment evaluating yield, total and reducing sugar contents,
total flavonoid concentration and total acidity. It was evident
the relationship existing between the variables evaluated and
experimental conditions selected as well as the interaction that
may exist among these experimental variables, which enabled
to select maximum yield and composition conditions to
obtain LBC.
RESUMEN. En este trabajo se estudi la influencia de las va-
riables experimentales: proporcin (m/v) residuo/agua, la tem-
peratura y el tiempo de extraccin en el rendimiento y la com-
posicin del CBL a travs de un diseo experimental factorial 23.
Para cada experiencia se evalu el rendimiento, el contenido
de azcares totales y reductores, la concentracin de
flavonoides totales y la acidez total, evidencindose la rela-
cin que existe entre las variables evaluadas y las condiciones
experimentales seleccionadas, as como la interaccin que pue-
de existir entre estas variables experimentales, lo que posibili-
t seleccionar las condiciones de mximo rendimiento y com-
posicin en la obtencin del CBL.

Key words: flavonoids, experimentation Palabras clave: flavonoides, experimentacin

INTRODUCCIN rendimiento y la composicin del complejo de

bioflavonoides del limn.
El complejo de bioflavonoides del limn (CBL) se
extrae de la corteza de los frutos de este cultivo. La com- MATERIALES Y MTODOS
posicin de la corteza de los frutos ctricos es muy varia-
da y se destacan entre sus constituyentes los flavonoides, Se utilizaron frutos maduros de limn (Citrus limon L.
polisacridos, cidos orgnicos, aceites esenciales y Burm) de la variedad Chivo rugoso; el jugo de los frutos
azcares (1); la concentracin de estos compuestos de- se extrajo manualmente y los residuos fueron molidos
pende y vara de acuerdo con mltiples factores, entre para obtener el CBL.
ellos la especie, el grado de madurez del fruto y las zo- Se realizaron ocho experimentos por triplicado, se-
nas de cultivo (2). gn el diseo experimental factorial 23 (Tabla I) (4), donde
La actividad biolgica del CBL depende en gran me- las variables codificadas se ajustaron a dos niveles: alto (+1)
dida de su composicin qumica y especialmente de la y bajo (-1).
concentracin de sus constituyentes bioactivos funda-
mentales: azcares, flavonoides y cidos orgnicos (3); Tabla I. Diseo de los experimentos
sin embargo, se conoce muy poco acerca de cmo influ-
yen las condiciones experimentales en el contenido de Experimentos Residuo/agua Temperatura Tiempo
(X1) (g/L) (X2) (oC) (X3) (min)
los principales constituyentes del CBL, o cul combina-
1 100 27 30
cin de las variables experimentales es la necesaria para
2 200 27 30
lograr un mximo contenido de los constituyentes de 3 100 100 30
mayor significacin biolgica en el CBL, por lo que en 4 200 100 30
este trabajo se estudia la influencia que ejercen diferen- 5 100 27 90
tes variables experimentales: la relacin (m/v) residuo/agua, 6 200 27 90
el tiempo de extraccin y la temperatura del medio en el 7 100 100 90
8 200 100 90
Ms.C. O. Cartaya, Investigador; Dr.C. Ins Reynaldo, Investigador Ti-
tular del Departamento de Fisiologa y Bioqumica Vegetal, Instituto La mezcla se filtr al final del proceso y el filtrado se
Nacional de Ciencias Agrcolas, Gaveta Postal 1, San Jos de las Lajas,
La Habana; Dr.C. Clara Nogueiras, Profesor Titular, Facultad de Qumi-
liofiliz para evaluar el rendimiento.
ca, Universidad de La Habana A las muestras se les determinaron el contenido de
ocartaya@inca.edu.cu azcares totales por el mtodo de fenol-sulfrico (5), los

97
 O. Cartaya, Ins Reynaldo y Clara Nogueiras

azcares reductores (6), en ambos casos se utiliz Al ampliar el tiempo de extraccin, aumenta el ren-
glucosa como patrn, la concentracin de flavonoides dimiento del CBL, pues es mayor el tiempo de interaccin
totales (7), utilizando hesperidina como patrn y la entre el soluto y el solvente, posibilitando la degradacin
acidez soluble total se determin por anlisis progresiva de los residuos, lo cual facilita la salida de los
volumtrico; en todos los casos, las mediciones se rea- diferentes compuestos presentes en los residuos de limn.
lizaron por triplicado y los resultados obtenidos se ex- Con el aumento de la temperatura, tambin se eleva
presaron en mg/g de masa seca de los residuos de el rendimiento de la extraccin. Esto puede explicarse
limn. debido a que en los residuos de limn existen compues-
Los resultados del diseo experimental para cada tos como los azcares, pectinas, cidos orgnicos y
constituyente del CBL se ajustaron a un polinomio lineal a flavonoides, los cuales son ligeramente solubles en agua (8)
travs del paquete estadstico Statgraphics Plus versin 2. y al aumentar la temperatura se favorece el movimiento
trmico de las partculas pequeas, favoreciendo la rup-
RESULTADOS tura de las estructuras celulares y con ello se facilita la
salida y disolucin de los compuestos presentes en los
El rendimiento es un parmetro que permite evaluar residuos de limn, lo cual est de acuerdo con la teora
la eficiencia del proceso extractivo. Los resultados (Tabla II) cintico molecular y el movimiento browniano, lo que trae
muestran que existe una variacin notable del rendimien- consigo un aumento del rendimiento de la extraccin.
to con las variables ensayadas, ya que se obtuvieron va- Tambin, al aumentar la proporcin (m/v) residuo/
lores que oscilan entre 89,6 mg/g (experimento 8) y agua, es mayor el rendimiento. Este resultado indica que
25.3 mg/g (experimento 1). al aumentar esta variable, es mayor el volumen de resi-
duo para la extraccin y, por consiguiente, mayor la can-
Tabla II. Rendimiento obtenido del CBL de la varie- tidad de compuestos que se pueden extraer. Este hecho
dad Chivo rugoso conduce a que se obtenga mayor masa del CBL al con-
cluir el tiempo de agitacin.
Experi- Residuo/agua Temperatura Tiempo Rendimiento
mentos (X1) (g/L) (X3) (min) (mg/g)
En la Tabla III se muestra el contenido de azcares
(X2) (C)
1 100 27 30 25.3 totales en los CBL en los experimentos realizados; sus valo-
2 200 27 30 26.13 res oscilan entre 11.70 mg/g (experimento 1) y 89.76 mg/g
3 100 100 30 48.33 (experimento 8).
4 200 100 30 72.27
5 100 27 90 44.93 Tabla III. Contenido de azcares totales del CBL
6 200 27 90 75.1 Experi- Residuo/agua Temperatura Tiempo Azcares
7 100 100 90 82.9 mentos (X1) (g/L) (X2) (C) (X3) (min) totales (mg/g)
8 200 100 90 89.6 1 100 27 30 11.70
2 200 27 30 21.06
La influencia de las variables experimentales sobre 3 100 100 30 17.42
el rendimiento se determin por ajuste de los datos obte- 4 200 100 30 50.19
5 100 27 90 63.28
nidos a un polinomio lineal, donde cada uno de los coefi- 6 200 27 90 60.64
cientes del polinomio caracteriza uno de los factores o 7 100 100 90 87.33
interacciones entre ellos; as, el signo positivo o negativo 8 200 100 90 89.76
de un coeficiente indica una proporcionalidad directa o Los resultados en el contenido de azcares totales
inversa respectivamente del factor al cual caracteriza, se ajustaron a un modelo similar al planteado para el ren-
mientras que el valor absoluto permite seleccionar qu dimiento (Ec. 2); a partir de los datos presentados se
variables experimentales o interacciones son las ms in- evidencia que las variables: tiempo de extraccin, tempe-
fluyentes (7). ratura, interaccin tiemp.*prop. (m/v) residuo/agua, pro-
Como puede observarse (Ec. 1), las variables ms porcin (m/v) residuo/agua y la interaccin tiemp.* prop. (m/v)
influyentes en el rendimiento del CBL en orden decre- residuo/ agua, en ese orden fueron las ms influyentes.
ciente resultaron: el tiempo, la temperatura y la propor-
cin (m/v) residuo/agua. (Ec. 2) Azcares totales= 50.1733+5.24X 1+ 11.0017X 2+
25.0808X 3+3.5617X 1X2+
(Ec.1) Rendimiento= 17.9837+ 2.5755 X1+5.1682 X2 + 5.2908X1X3
5.3204 X3

Anlisis de varianza para una regresin completa Anlisis de varianza para una regresin completa
Fuente Suma de Grados Cuadrado F P Fuente Suma de Grados Cuadrado F P
cuadrados de libertad medio cuadrados de libertad medio
Modelo 1479.6 3 493.198 60.35 0.0 Modelo 19637.3 5 3927.46 84.22 0.0
Errores 163.453 20 8.17267 Errores 839.373 18 46.6319
Total 1643 23 Total 20476.7 23
r2 (ajustado para GL)=0.9703 ES=2.8588 F crtica= 1.15 r2 (ajustado para GL)=0.9876 ES=6.8287 F crtica= 1.97

98
 influencia de diferentes variables experimentales en la composicin del complejo de bioflavonoides del limn (CBL)

Al analizar cada una de estas variables por separa- Al aumentar el tiempo de extraccin, la proporcin
do, el tiempo de extraccin result ser la variable ms (m/v) residuo/agua y la temperatura, es mayor el conteni-
significativa. Al aumentar el tiempo de extraccin, es do de azcares reductores en el CBL, lo cual se funda-
mayor el contenido de azcares en el CBL, ya que existe menta con los planteamientos expuestos para estas va-
una gran interaccin entre el agua y el residuo, lo que riables en el contenido de azcares totales.
posibilita la mayor solubilidad de los diferentes azcares El contenido de cidos orgnicos (Tabla V) vara desde
presentes en los residuos. 12.22 mg/g (experimento 4) a 27.39 mg/g (experimento 5).
Por su parte, un aumento de la temperatura provoca
una mayor concentracin de los azcares, ya que la Tabla V. Contenido de cidos orgnicos en el CBL
solubilidad de los azcares aumenta con la temperatura, Experi- Residuo/agua Temperatura Tiempo Azcares
por elevarse el punto de saturacin de la solucin. mentos (X1) (g/L) (X2) (C) (X3) (min) orgnicos (mg/g)
Otra de las variables encontradas como significati- 1 100 27 30 22.47
va, aunque en menor proporcin, es la proporcin (m/v) 2 200 27 30 15.16
residuo/agua, ya que se aumenta el volumen de residuos 3 100 100 30 13.34
para la extraccin, por lo que debe existir mayor cantidad 4 200 100 30 12.22
5 100 27 90 27.39
de azcares y de esta forma se favorece su extraccin
6 200 27 90 21.49
hasta que se alcance el punto de saturacin de la solu- 7 100 100 90 16.85
cin. 8 200 100 90 15.59
En la Tabla IV se muestra el contenido de azcares
reductores en los ocho experimentos realizados segn el Como puede observarse (Ec. 4), las variables e
diseo experimental; los valores encontrados oscilan en- interacciones ms influyentes, en orden decreciente, fue-
tre 3.56 mg/g (experimento 1) y 36.32 mg/g (experimento 8). ron: la temperatura, el tiempo de extraccin y la propor-
cin (m/v) residuo/agua, as como la interaccin porporcin
Tabla IV. Contenido de azcares reductores del CBL
(m/v) residuo/agua* temperatura.
Experi- Residuo/agua Temperatura Tiempo Azcares
(Ec. 4) Acidez= 18.0633-1.9492X1-3.5642X2+2.2642X3+
mentos (X1) (g/L) (X2) (C) (X3) (min) reductores (mg/g)
1.3517X1X2
1 100 27 30 3.56
2 200 27 30 11.96 Anlisis de varianza para una regresin completa
3 100 100 30 5.7
4 200 100 30 21.66 Fuente Suma de Grados Cuadrado F P
5 100 27 90 18.19 cuadrados de libertad medio
6 200 27 90 26.23 Modelo 19637.3 5 3927.46 84.22 0.0
7 100 100 90 28.62 Errores 839.373 18 46.6319
8 200 100 90 36.32 Total 20476.7 23
r2(ajustado para GL)=0.9776 ES=6.8287 F crtica= 1.97
Como se aprecia en dicha tabla, al igual que en el
Al analizar el comportamiento de la concentracin
rendimiento y contenido de azcares totales en el CBL
de cidos orgnicos con la temperatura, se observa
en los experimentos realizados, los resultados eran de
que un aumento de esta provoca una disminucin de
esperarse, si se tienen en cuenta las diferentes condicio-
los cidos orgnicos en el CBL, lo cual se evidencia en
nes experimentales.
el anlisis de los experimentos 1 y 3. Tambin al au-
El modelo obtenido se muestra en la ecuacin 3.
mentar la proporcin (m/v) residuo/agua, disminuye el
Las variables e interacciones ms influyentes, en orden
contenido de los cidos orgnicos en el CBL experi-
decreciente, fueron: el tiempo de extraccin, la propor-
mentos 1 y 2.
cin (m/v) residuo/agua, la temperatura as como las
Los efectos de la temperatura y la proporcin (m/v)
interacciones temperatura* tiempo, tiempo* proporcin (m/v)
residuo/agua en la obtencin del CBL pueden deberse en
residuo/agua y proporcin (m/v) residuo/agua* temperatura.
gran medida a la posible degradacin de los cidos org-
(Ec. 3) Azcares reductores= 19.03+ 5.0133X1+4.045X2+ nicos con el aumento de la temperatura (9, 10).
8.3108X3+0.9017X1X2+ Por el contrario, con el aumento del tiempo de ex-
1.0775X1X3+1.0875X2X3 traccin aumenta el contenido de los cidos en el CBL,
siendo este aumento ms marcado en los experimentos
Anlisis de varianza para una regresin completa realizados a menor temperatura, lo que se evidencia en
los experimentos 5 y 8 con 27.39 y 14.59 mg/g respecti-
Fuente Suma de Grados Cuadrado F P
cuadrados de libertad medio vamente.
Modelo 2729.33 6 454.89 198.07 0.0 En la Tabla VI se muestra el contenido de
Errores 39.0426 17 2.2966 flavonoides obtenido en los diferentes experimentos
Total 2768.37 23 realizados.
r2(ajustado para GL)=0.9809 ES=1.5154 F crtica= 1.96

99
 O. Cartaya, Ins Reynaldo y Clara Nogueiras

Tabla VI. Contenido de flavonoides totales en el CBL do se utilizan 200 g/L de proporcin (m/v) residuo/ agua,
100C como temperatura de extraccin y 90 minutos para
Experi- Residuo/agua Temperatura Tiempo Flavonoides la extraccin.
mentos (X1) (g/L) (X2) (C) (X3 ) (min) totales (mg/g) Este trabajo constituye la primera informacin, en
1 100 27 30 23.20
Cuba, sobre una metodologa para la obtencin del CBL;
2 200 27 30 28.10
3 100 100 30 25.88 adems, si consideramos que los frutos cultivados en
4 200 100 30 28.05 Cuba constituyen una fuente potencial para la obtencin
5 100 27 90 24.27 del CBL, la facilidad de obtencin, el carcter de com-
6 200 27 90 24.86 puesto natural y la actividad biolgica en potencia de este
7 100 100 90 37.90 producto; convierte su posible aplicacin en una alterna-
8 200 100 90 41.16 tiva a tener en cuenta por la industria farmacutica en la
formulacin de medicamentos.
Como puede observarse (Ec. 5), la variable ms in-
fluyente fue la temperatura; al aumentar la temperatura
es mayor el contenido de flavonoides en el CBL, lo cual REFERENCIAS
puede deberse a que un aumento de la temperatura faci-
1. Kesterson, J. W. /et al./ La industrializacin de los frutos
lita la disolucin de los flavonoides (11).
ctricos. En: Los Ctricos, 1999, p. 78-81.
(Ec. 5) Flavonoides totales= 28.3046+3.19375X2 2. Reynaldo, I. /et al./. Flavonoids found in several citrus
species cultivated in Cuba and Spain for their industrial
Anlisis de varianza para una regresin completa
application. Cultivos Tropicales, 1999, vol. 20, no. 3,
Fuente Suma de Grados Cuadrado F P p. 73-75.
cuadrados de libertad medio 3. Cartaya, O. y Reynaldo, I. Obtencin del complejo de
Modelo 244.801 1 244.801 84.99 0.03 bioflavonoides del limn a partir de cuatro variedades.
Errores 1080.14 22 49.0972 Cultivos Tropicales, 1999, vol. 20, no. 3, p. 55-57.
Total 1324.94 23 4. Sevilla, E. Apuntes sobre modelacin estadstica y dise-
r2(ajustado para G.L)=0.9747 ES=7.0069 F crtica= 2.18 o de experimentos. La Habana : Editorial Pueblo y Edu-
cacin, 1987.
Es de destacar que aunque otras variables no resul- 5. Dubois, N. /et al./. Colorimetric method for determination
taron significativas para el modelo, los mayores conteni- of sugar and related substances. Anal Chem., 1956,
dos de flavonoides en el CBL se obtuvieron a altas tem- vol. 28, p. 350-356.
peraturas, cuando se utiliz el mayor tiempo de extrac- 6. Nelson, N. J. A photometric adaptation of the Somogyi
cin y esto se evidencia en los experimentos 3 y 7 as method for the determination of glucoses. J. Biol.
como en 4 y 8, donde se aumenta el tiempo de extrac- Chemistry, 1944, vol. 153, p. 375-380.
7. Davis, W. B. Determination of flavanones in Citrus fruit.
cin en 60 minutos y permanecen fijas el resto de las
Anal. Chem., 1947, vol. 19, p. 476-478.
condiciones experimentales. 8. Silvendran, R. R. Cell- wall chemistry and architecture in
Al comparar los niveles de los compuestos presen- relation to sources of dietary fibre. Europ. J. Clinical Nutrit.,
tes en el CBL con actividad biolgica, el contenido de 1995, vol. 49, p. 27-41.
flavonoides es uno de los mayoritarios, lo cual es muy 9. Mc Mullen, M. D. /et al./. Quantitative trait loci and metabolic
beneficioso, ya que son los compuestos ms importan- pathways. Proc Acad. Sci. USA., 1999, vol. 95, no. 5,
tes en el CBL debido a sus mltiples propiedades p. 1996-2000.
farmacolgicas(12, 13). 10. Moledina, K. H. y Flink, J. M. Determination of Ascorbic
En todas las experiencias realizadas, no se han te- acid in plant food products by high performance liquid
chromatography. Lebensm. Wiss. u. Tecnol., 2000,
nido en cuenta las interacciones entre las variables ex-
vol. 15, p. 351-358.
perimentales, a pesar de que resultaron significativas para 11. Bahar, B. y Siddequi, A. A. Bioactive Naturally Occuring
el modelo planteado, pues son interacciones de variables Flavonoids. Hamdard Medicus, 1999, vol. 52, no. 1.
que reafirman el sentido y la magnitud de las variables 12. Yamamoto, K. y Osawa, T. Isolation of eriocitrin (eriodictyol
descritas anteriormente. 7-rutinoside) fom lemon fruit (Citrus limon Burm f.) and
De forma general, las variables experimentales pro- its antioxidative activity. Food Sci. Technol. Int. Tokyo,
porcin (m/V) residuo/agua, la temperatura y el tiempo 1997, vol. 3, p. 84-89.
de extraccin resultaron influyentes en el rendimiento y 13. Bombardelli, E. y Morazzoni, P. The flavonoids: New
la composicin del CBL excepto en el caso de los perspectives in biological activities and therapeutics.
Chem. Oggi, 1999, vol. 25, p. 28.
flavonoides, obtenindose los mayores rendimientos y
niveles en los principales constituyentes con actividad Recibido: 9 de octubre del 2001
biolgica en el CBL, en las condiciones ensayadas, cuan- Aceptado: 23 de marzo del 2002

100