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LABORATORIO MICROBIOLOGA

REP-PCR para Acinetobacter baumannii-complex

Genes

Se amplifican genes aleatorios repetitivos.

Primers para la amplificacin en PCR

Primer Longitud (bp) Secuencia 5


3
REP 1 5`IIIICGICGICATCIGGC 3`
REP 2 5` ICGICTTATCIGGCCTAC
3`

(Higgins, 2012)

Extraccin de ADN
1. Realizar una suspensin bacteriana turbia o bien cargada colocando una buena asada de la bacteria en un
tubo tipo eppendorf de 1.5ml adecuadamente rotulado que contenga 500uL de agua esterilizada.
2. En un termobloque, colocar los tubos eppendorf con las suspensiones bacterianas y configurarlo a una
temperatura de 100C y con una agitacin constante de 1000 rpm durante 10 minutos.
3. Dejar enfriar los tubos.
4. Centrifugar los tubos durante 1 minuto a 14000 rpm.
5. Cuidadosamente, sacar los tubos de la centrfuga y pasar el sobrenadante (contiene el DNA) a un nuevo
tubo eppendorf bien rotulado utilizando una pipeta.
6. Desechar el pellet.
7. Almacenar a -20C.
(Adwan, 2014; Capocefalo, Ridley, & Tranfield, 2016)

Programacin de PCR

1. Para cada muestra: 25 l de volumen final

REP-PCR

Iquique N 14-285 y Yaguachi


Telfono: 022568041 - 022552715 022565858
www.inspi.gob.ec
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Reactivo Concentraci Volume


n n
1 GoTaq 2x 17 l
2 Agua --- 7 l
3 Primer 1 10 uM 2 l
4 Primer 2 10 uM 2 l
5 MgCl 5 uM 4 l
6 ADN >30 ug/ul 2 l

2. Programar el termociclador siguiendo las indicaciones del usuario durante los


siguientes periodos:

Etapa Temperatura Tiempo


Denaturacin inicial 94C 10 minutos
30 ciclos Denaturacin 94C 1 minutos
Hibridacin 47,5C 1 minutos
Extensin 72C 2 minutos
Extensin final 72C 16 minutos
Conservacin 4C

Electroforesis

1. Despus del ciclado de PCR, Realizar la corrida electrofortica del producto de PCR
(4l) en un gel de agarosa al 1,75% durante 6 horas a 60v.
2. Revelar el gel en el fotodocuemntador y codificar la foto de acuerdo al cdigo
respectivo.

Bibliografa
Crnich. (2014). Comparison of pulsed-gel electrophoresis and a commercial repetitive-element PCR
method for assessment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus clustering in different
health care facilities. Journal of Clinical Microbiology, 2027-2032.

Higgins, P. (2012). Interlaboratory reproducibility of DiversiLab rep-PCR typing and clustering of


Acinetobacter baumannii isolates. Journal of medical microbiology.

Iquique N 14-285 y Yaguachi


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