Potencial de cicatrizacin de la herida del extracto

etanlico de la hoja de Kalanchoe pinnata Lam. Un

estudio preliminar
El extracto de K. pinnata se evalu en cuanto a su actividad de
cicatrizacin de heridas utilizando el modelo de herida por extirpacin
en ratas. En el da 11, los animales tratados con el extracto etanlico de
hojas mostraron una reduccin del 86,33% en el rea de la herida, en
comparacin con el control tratado con vaselina (69,36%) y el estndar
tratado con mupirocina (85,49%). El contenido de hidroxiprolina de los
animales tratados con el extracto fue mayor, en comparacin con el
control y los grupos estndar. El anlisis histolgico tambin fue
consistente con la propuesta de que el extracto de hoja de K. pinnata
exhibe un potencial significativo de cicatrizacin de heridas. El aumento
de la tasa de contraccin de la herida y el contenido de hidroxiprolina en
los animales tratados con el extracto apoya las afirmaciones hechas por
los curanderos tradicionales de los beneficios obtenidos del uso
medicinal de K. pinnata.

Palabras clave: Herida por extirpacin, Hydroxyproline, Kalanchoe

pinnata

Kalanchoe pinnata (Lam.) es una planta suculenta nativa de Madagascar.

En la medicina tradicional, las especies de Kalanchoe se han utilizado
para tratar enfermedades como infecciones, reumatismo e inflamacin.
El extracto de Kalanchoe tambin tiene efecto inmunosupresor.
Kalanchoe pinnata se ha registrado en Trinidad y Tobago como un
tratamiento tradicional para la hipertensin y para el tratamiento de
clculos renales. Kalanchoe pinnata es comnmente conocida como
"Hierba maestra" o una "cura para todo" por una gran comunidad de
practicantes de hierbas en la regin del Caribe. Los compuestos de
bufadienolide aislados de K. pinnata incluyen la briofilina A que mostr
una fuerte actividad promotora antitumor, en comparacin con la
briofilina C que era menos activa. Sin embargo, la briofilina C mostr
propiedades insecticidas significativas.

La cicatrizacin de heridas es el proceso natural del cuerpo para

regenerar el tejido drmico y epidrmico. Cuando un individuo es herido,
un conjunto de eventos tiene lugar de manera predecible para reparar el
dao. Despus de la lesin, se produce una respuesta inflamatoria y las
clulas por debajo de la dermis comienzan a aumentar la produccin de
colgeno. Ms tarde, el tejido epitelial se regenera. Hay tres etapas en el
proceso de curacin de heridas: inflamacin, proliferacin y
remodelacin. El tratamiento de las heridas crnicas puede implicar el
uso de terapia antibitica agresiva, terapia antiinflamatoria o una
combinacin de ambas. Estas clases de frmacos exhiben su efecto
teraputico modulando la duracin de la fase inflamatoria.

Los mtodos actuales usados para tratar heridas incluyen

desbridamiento, irrigacin, antibiticos, injertos de tejido, enzimas
proteolticas y corticosteroides, que poseen inconvenientes importantes
y efectos secundarios no deseados. En las aldeas la gente usa extractos
de planta para tratar sus heridas sin ningn conocimiento experimental.
No hay base experimental para demostrar la actividad cicatrizante de K.
Pinnata. Por lo tanto, este estudio se ha llevado a cabo para evaluar la
actividad cicatrizante de K. pinnata en ratas.

Materiales y mtodos

Material de la planta y preparacin del extracto

Las hojas de K. pinnata fueron recogidas de un productor local. Estaban

frescas y libres de infestacin por hongos. Las hojas fueron identificadas
por la Sra. Yasmin S, taxonomista de plantas en el Herbario Nacional,
Universidad de las Indias Occidentales, San Agustn, Trinidad y Tobago.
Se deposit un espcimen de muestra para uso futuro. (Nmero del
espcimen: TRIN 36533).

Las hojas (400 g) se lavaron minuciosamente con agua del grifo seguido
de agua desionizada, y se secaron a la sombra en una habitacin alejada
de la luz directa del sol. Se prepar un polvo fino triturando las hojas
secas en un mezclador. Se disolvi polvo fino (300 g) en 600 ml de
etanol y se mantuvo durante 24 horas a temperatura ambiente (28C).
El extracto etanlico se filtr y se mantuvo para secar en un bao de
agua mantenido a 40 C. Se obtuvo extracto etanlico transparente (15
g) y se utiliz para los estudios.

Animales

Ratas machos Sprague Dawley consanguneos sanos que pesaban 180-

200g de peso corporal utilizados para el estudio se alojaron
individualmente y se mantuvieron con alimento normal y agua ad
libitum. Las ratas se anestesiaron antes y durante la infliccin de las
heridas experimentales. Las intervenciones quirrgicas se llevaron a
cabo en condiciones estriles utilizando anestesia con ketamina (120 mg
/ kg de peso corporal). Los animales fueron observados de cerca por
cualquier infeccin y si mostraban signos de infeccin fueron separados,
excluidos del estudio y reemplazados. El estudio fue aprobado por el
comit de tica para la experimentacin animal (ECAE3-2009) por la
Facultad de Ciencias Mdicas de la Universidad de las Indias
Occidentales, St. Augustin. Se utiliz el modelo de herida por excisin
para evaluar la actividad cicatrizante del extracto de hojas de K. pinnata.
Se realiz un estudio de toxicidad aguda para seleccionar la dosis. A las
ratas macho se les aplic dosis crecientes (0,25, 0,5, 0,75 y 1,0 g / kg de
peso corporal) de extracto durante 14 das. Las dosis de hasta 1,0 g / kg
de peso corporal no produjeron ningn signo de toxicidad y mortalidad.
Los animales eran fsicamente activos.

Modelo de herida por escisin

Los animales fueron anestesiados antes y durante la creacin de las

heridas. Las ratas fueron infligidas con heridas de escisin como las
descritas por Morton y Malone. El pelaje dorsal de los animales se afeit
con una afeitadora elctrica y el rea de la herida que se creara se
esboz en la parte posterior de los animales con azul de metileno
usando un estencil circular de acero inoxidable estril. Se hizo una
herida de un rea circular de un espesor total de 250 mm2 y 2 mm de
profundidad a lo largo de las marcas usando pinzas dentadas, una
cuchilla quirrgica y tijeras puntiagudas. Los animales se dividieron
aleatoriamente en los siguientes tres grupos de 6 animales cada uno:
Los animales del Grupo 1 (estndar) se aplicaron tpicamente con
ungento de mupirocina (base de ungento al 2%, fabricado por
Glenmark Pharmaceuticals, India); Los animales del grupo 2 (control) se
aplicaron con vaselina (100%, fabricados por Unilever Pharmaceuticals,
CT) y los animales del grupo (3) (experimental) se trataron tpicamente
con el extracto etanlico de K. pinnata usando como base gelatina de
petrleo, a una dosis de 100 mg/kg de peso corporal hasta el da 11.
Esto se realiz diariamente y se tuvo especial cuidado para evitar la
variacin en la dosis. La tasa de cierre de la herida se determin
trazando la herida en das alternos (da 1, 3, 5, 7, 9, etc.) usando papel
de transparencia y un marcador permanente. Las reas de heridas
registradas se midieron usando un papel milimetrado.

Estimacin de hidroxiprolina
Para la estimacin de la hidroxiprolina se utiliz el tejido de granulacin
seco del grupo control y tratado. La hidroxiprolina presente en el
hidrolizado cido neutralizado se oxid posteriormente con perxido de
sodio en presencia de sulfato de cobre, seguido de formacin de
complejos con para-dimetilaminobenzaldehdo para desarrollar un color
rosa y que se midi a 540 nm mediante espectrofotmetro.

Estudio histolgico

Se obtuvo tejido de granulacin de los animales del grupo de ensayo y

de control del da 11 para el estudio histolgico. Para la mejor
apreciacin de la deposicin de colgeno, se utilizaron manchas de
hemotoxina y eosina y manchas Van Gieson. Las fibras se tieron de rojo
en el reactivo de Van Gieson y prpura en Hemotoxylina y Eosina.

Anlisis estadstico

Se compararon las medias de medicin de la superficie de la herida

entre grupos a intervalos de tiempo diferentes mediante ANOVA de una
va, prueba descriptiva, seguida de la prueba post-hoc de Tukey. Los
datos se analizaron utilizando el SPSS (Versin 16.0, Chicago, EE.UU.) y
el valor de P se fij en <0.05 para todos los anlisis.

Resultados

El anlisis fitoqumico de K. pinnata, por mtodos cualitativos, mostr la

presencia de la gran familia de metabolitos secundarios de plantas
conocidos como glucsidos cardicos. El anlisis diferencial de la super
familia de glucsidos cardicos indic la presencia de los subgrupos;
Cardenlidos y bufadienlidos. En el 11 da despus de la herida, hubo
un aumento significativo en la actividad cicatrizante en los animales
tratados con el extracto etanlico de K. pinnata (Figura 2b) en
comparacin con los animales que recibieron el tratamiento de control
(Figura 1b) y el tratamiento estndar (Figura 3b). Se observ una
reduccin progresiva significativa en el rea de la herida de los animales
tratados con el extracto el da 11 (86,3%) en comparacin con el testigo
(68,0%) y el estndar (85,5%). Hubo un aumento significativo del
contenido de hidroxiprolina en los animales tratados con extracto (22 mg
/ g de tejido) en comparacin con los controles (19 mg / g de tejido), sin
embargo, se observ ms contenido de hidroxiprolina con tratamiento
estndar (35 mg / g de tejido).
El anlisis histolgico de las muestras de tejido de granulacin revel
que el grupo control exhiba generalmente fibras de colgeno ms
dispersas y escasamente dispersas, as como reas focales de
vascularizacin con diminutos vasos sanguneos (Figura 4a). Los
fibroblastos, caracterizados por ncleos vesiculados, tambin eran
evidentes entre las fibras de colgeno, mientras que algunos
fibroblastos en forma de huso se distribuan en reas focales circulares.
Las fibras de colgeno apenas se distinguan en la seccin de Van
Giesonstained (figura 4b). El tejido de granulacin estndar tena,
adems de escasas fibras de colgeno difuso, pocos miocitos
esquelticos (Fig. 5a). Sin embargo, se observaron vasos sanguneos
ms grandes y una mayor concentracin de hebras de fibras de
colgeno en orientacin variable en secciones teidas con el reactivo de
Van Gieson (figura 5b). El tejido de granulacin experimental tena la
mayor concentracin de fibrocitos y densos haces ondulados de fibras
de colgeno (Figuras 6a y b). Las secciones a travs de folculos pilosos
tambin fueron evidentes.

Discusin

Los animales tratados con extracto etanlico de K. pinnata mostraron

aumentos significativos en la tasa de contraccin de la herida. Tambin
hubo una disminucin significativa en el edema en el sitio de la herida 3
das despus de la aplicacin inicial con el extracto, en comparacin con
los animales tratados con mupirocina. El tejido de granulacin formado
en la penltima parte de la fase proliferativa est compuesto
principalmente de fibroblastos, fibras de colgeno (Tipo III), clulas
inflamatorias, fibronectina y nuevos vasos sanguneos pequeos. El
tejido de granulacin de los animales tratados con el extracto mostr un
patrn ms denso de deposicin de colgeno y un nmero menor de
clulas inflamatorias en comparacin con los animales del grupo de
control.

El contenido de hidroxiprolina del tejido de granulacin fue

significativamente mayor en animales tratados con extracto etanlico en
comparacin con los controles. El aumento del contenido de
hidroxiprolina en el tejido de granulacin indica una mayor sntesis de
colgeno. El colgeno, el principal componente estructural del tejido de
granulacin, fortalece y apoya el tejido de la matriz extracelular, y
eventualmente reemplaza a la matriz temporal de fibrinfibronectina. El
aminocido hidroxiprolina, es una parte integral de la fibra de colgeno y
se utiliza como un marcador bioqumico para colgeno de tejido.

La curacin de la herida, exhibida por el extracto, puede atribuirse a la

presencia de glucsidos esteroidales. Se ha demostrado que K. pinnata
tiene una cantidad significativa de bufadienlida, una aglicona esteroidal
que existe en la planta como glucsido esteroideo. Los bufadienlidos
han sido documentados por exhibir propiedades antitumorales,
insecticidas y cardioprotectoras, pero en virtud de la fraccin esteroidal
de la aglicona, se propone que la bufadienlida aglicona pueda ser
metabolizada por las clulas del sitio de la herida para producir un
agente teraputico activo que pueda exhibir una actividad
inmunosupresora. El estrs oxidativo severo en el sitio de la herida
puede conducir a la citotoxicidad.

Esta citotoxicidad conduce a la necrosis de las clulas, por ejemplo los

fibroblastos y otros tipos de clulas sensibles a especies reactivas de
oxgeno. El tejido necrtico tiene que ser eliminado por la actividad de
desbridamiento activamente realizada por la poblacin de neutrfilos
presentes. El estrs oxidativo en el sitio de la herida exacerba el proceso
intrnseco de heridas crnicas al prolongar el proceso inflamatorio. Se ha
demostrado que las biomolculas de flavonoides y otros polifenoles
presentan una actividad antioxidante significativa y son beneficiosos
para reducir la concentracin de ROS en el sitio de la herida. Por lo
tanto, la modulacin del perodo de la fase inflamatoria por el efecto
combinado de la actividad inmunosupresora y antioxidante puede
representar el modo de accin teraputico bsico del extracto etanlico
de K. pinnata.

Los datos del presente estudio demuestran que el extracto etanlico de

Kalanchoe pinnata facilita la cicatrizacin significativa de la herida, sobre
la base de los parmetros examinados. Su actividad de promocin de
cicatrizacin de heridas podra deberse a una actividad antioxidante
potencial proporcionada por los derivados polifenlicos que fueron
identificados cualitativamente. Los hallazgos en la actualidad son
preliminares y justifican un estudio en profundidad. Se requiere una
investigacin adicional para determinar si los bufadienolidos, aislados de
K. pinnata, pueden presentar efectivamente la actividad sugerida por los
resultados observados aqu.

Figuras 1-3 - Efecto del extracto etanlico de K. pinnata en la herida de

escisin. [a = da 1, b = da 11, 1: control de vaselina tratada, 2: tratado
con extracto, 3: tratado con mupirocina. Nota: 70, 87 y 86% de cierre de
herida en 1b, 2b y 3b, respectivamente]

Figura. 4- (a): Seccin del tejido de granulacin de una rata de control

teida con hematoxilina y eosina (H & E) [Haba numerosos Fibroblastos
(FB) y Macrfagos (M); Las fibras de colgeno (CF) se dispersaron de
forma difusa] (b): Seccin del tejido de granulacin de una rata de
control teida con Van Gieson [Las fibras de colgeno (FQ) son apenas
perceptibles dentro del estroma. Numerosas clulas inflamatorias
pueblan el rea] (40X)

Figura. 5- (a): Seccin del tejido de granulacin estndar de una rata

teida con H & E [Se observan unos pocos miocitos esquelticos (M)] (b):
Seccin del tejido de granulacin estndar de una rata teida con Van
Gieson [ Notese la mayor concentracin de hebras de fibras de colgeno
(C) en diferentes orientaciones. La vascularizacin con vasos sanguneos
ms grandes (BV) tambin se hace evidente] (40X)

Figura. 6- (a): Seccin de tejido de granulacin experimental de una rata

teida con H & E [Ms fibroquitos (FC) y densos conjuntos de colgeno
(FC) son evidentes. Pocos macrfagos (M) estn presentes. La poblacin
de macrfagos es significativamente baja] (b): Seccin de tejido de
granulacin experimental de una rata teida con Van Gieson [Fibras
densas de colgeno ondulado (CF) son bastante evidentes] (40X)