Transferencia de energa de fluorescencia por resonancia (RET)

La transferencia de energa de fluorescencia por resonancia (RET) se basa en la

transferencia de energa entre un grupo donante y un aceptor. Deriva de la capacidad del donante
fluorescente de excitar al aceptor, si ambos se encuentran a una distancia apropiada (entre 1 y 10
nm). La excitacin de molculas de aceptor puede ocurrir por transferencia directa de energa de
las molculas donor excitadas y sta se manifiesta como una reduccin en la intensidad de
emisin de la fluorescencia del donor y un correspondiente incremento en la intensidad de
emisin del aceptor de fluorescencia (Figura 6). El fluorforo donante excitado presenta
fluorescencia a una determinada longitud de onda. La aproximacin estrecha de un segundo fluorforo
con una banda de absorcin que se superpone con la banda de emisin del donante, conduce a la
excitacin del aceptor por el donante y la fluorescencia resultante es de mayor longitud de onda .

Fuente luminosa

Longitud de onda
de excitacin del
donante

Fluorescencia del donante

Donante
excitado

RET Fluorescencia del aceptor

Donante Aceptor
excitado excitado

Figura 6. Transferencia de energa de fluorescencia por resonancia

Anlisis estructural de las protenas

Hay slo tres aminocidos aromticos que absorben luz en la regin del ultravioleta
cercano ( > 240 nm) y son: fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr) y triptfano (Trp). El espectro de
emisin de fluorescencia de las protenas est determinado por la presencia en la cadena proteica
de dichos aminocidos. Adems existen cofactores como FMN, FAD, NAD y porfirinas que
tambin presentan fluorescencia cuando estn presentes en las protenas. Los cambios de la
fluorescencia intrnseca pueden ser usados para monitorear cambios estructurales en la protena.
Los tres aminocidos aromticos tienen distinta absorcin y emisin de fluorescencia,
como se resume en la tabla 1.

ex (nm) em (nm) F
Trp 295 353 0,20
Tyr 275 304 0,14
Phe 260 282 0,02

Tabla 1. Caractersticas de fluorescencia de los aminocidos aromticos

 La fluorescencia de una protena es una sumatoria de las fluorescencias de los distintos
residuos aromticos que posee, pero generalmente se estudia entre 280-295 nm siguiendo la
fluorescencia del triptfano. Generalmente, se mide la emisin de fluorescencia del triptfano
por su mayor rendimiento cuntico y su vida media ms prolongada. Adems, la proximidad de
estos tres aminocidos en la estructura de una protena permite que ocurra transferencia de
energa por resonancia (RET) entre Phe y Tyr y entre Tyr y Trp, siendo la fluorescencia del Trp la
nica que no se transfiere. Las protenas usualmente tienen un nmero limitado de Trp y ste est
generalmente en el sitio activo de las protenas.
La tirosina, como el triptfano, tiene una fuerte banda de absorcin a 280 nm. Es un
emisor ms dbil que el triptfano, pero puede contribuir significativamente a la fluorescencia de
la proteena, ya que normalmente est en un nmero mayor. La fluorescencia de la tirosina puede
ser fcilmente transferida si se encuentra cerca del triptfano.
La fenilalanina, con slo un anillo bencnico y un grupo de metileno es dbilmente
fluorescente. La sensibilidad experimental (el producto de rendimiento cuntico y absortividad
molar) es especialmente baja para este residuo. La fluorescencia de la fenilalanina se observa
slo en ausencia de tirosina y triptfano.
Los espectros de fluorescencia y el rendimiento cuntico son generalmente ms
dependientes del medio ambiente que los espectros de absorcin y los coeficientes de extincin
molar. En las protenas los residuos de Trp se encuentran generalmente formando parte del
ncleo hidrofbico de las mismas y por lo tanto est en regiones donde las molculas de agua
tienen poco acceso, el espectro de emisin del mismo, se corre hacia el ultravioleta (corrimiento
hacia el azul) con el mximo de emisin generalmente en 330 nm. Esto se debe a que la energa
emitida es mayor que cuando la cadena lateral se encuentra en contacto con el solvente, donde
parte de la energa absorbida es transferida a las molculas de agua y por lo tanto la longitud de
onda del mximo de emisin es mayor (340-350). Esto tambin sucede cuando una protena se
desnaturaliza. Por ejemplo, cuando al pptido MccJ25-Trp se lo resuspende en concentraciones
crecientes de dioxano, se ve un corrimiento hacia menores longitudes de onda y un aumento de
la fluorescencia (Figura 7).

100 %

80 %

40 %
20 %
0%

333 nm 351 nm

Figura 7. Efecto del solvente en la fluorescencia del triptofano de la MccJ25-Trp.

 Los rendimientos qunticos de los tres aminocidos aromticos decaen cuando se
incorporan a una protena. En la Tabla 2 se comparan las caractersticas de la fluorescencia de los
aminocidos libres e insertos en una protena. Tambin contiene datos que muestran la
sensibilidad de la fluorescencia de estos residuos a la polaridad de su entorno.

Aminocido) Protena
Solvente
em (nm F em (nm) F
H2O 340 0,12 333 0,02
Trp
DMSO 340 0,81 333 0,67
H2O 303 0,21 --- ---
Tyr
DMSO 306 0,27 309 0,06
Phe DMSO 282 0,02 284 0,006

Tabla 2. Caractersticas de la fluorescencia de los aminocidos libres e insertos en una protena.

DMSO = dimetil sulfxido, un solvente orgnico.

La fluorescencia de los residuos aromticos vara en forma un tanto impredecible entre

las diversas protenas. Si se compara el estado plegado con el desplegado, el rendimiento
quntico puede aumentar o disminuir. La intensidad de fluorescencia no tiene mucho valor en s
misma, pero la magnitud de la intensidad, sin embargo, puede servir como una sonda de
perturbacin del estado plegado. La longitud de onda de emisin es un mejor indicador del
medio ambiente del fluorforo.
Por otro lado la fluorescencia del triptfano es quencheada por iodo, acrilamida, grupos
disulfuros, aminos y carboxilos y residuos de histidina cercanos.