PRCTICA N04

ESPECTROFOTOMETRA

I.- GENERALIDADES:

Son mtodos de anlisis cualitativos y cuantitativos, basados en la interaccin de la luz con los
tomos y las molculas de las sustancias problemas que se quieren analizar, pudindose
identificar compuestos desconocidos por su espectro de absorcin caracterstico en el UV, VIS o
IR. As como tambin se pueden determinar las concentraciones de compuestos conocidos
midiendo la absorcin de luz a una o ms longitudes de onda, generalmente a la longitud de
onda de mxima absorcin.
A fin de que la presente prctica facilite el entender, aplicar y explicar el mtodo en la
determinacin de los metabolitos bioqumicos indicadores del estado de salud del hombre se
explica algunas de las propiedades de la luz
La luz se manifiesta mediante radiaciones electromagnticas la cual puede considerase como
corpuscular o en la forma de onda.
Algunas propiedades fsicas de la luz se entienden mejor mediante sus caractersticas de onda.
Otras propiedades pueden explicarse a travs de su naturaleza corpuscular o de partculas.
Las caractersticas de una onda son:

: longitud de onda: distancia a la que se mueve la

onda durante un ciclo. Unidades:

A (armstrongs) = 10-10 m
cm (centmetro) = 10 7 nm
nm (nanmetro) = 10-9 m = 10 -6 mm = 10-7 cm
m (milimicras ) = 10 -6 mm
: perodo: tiempo que se requiere para que un ciclo
completo pase por un punto.
Unidad: seg/ciclo o s/ciclo
: frecuencia de oscilacin: nmero de ciclos que se
presenta en cada segundo.
Unidad ciclos/seg Hz.

La relacin entre la longitud de onda () y la frecuencia () para una onda de luz es:
= C
 C es la velocidad de luz (3,0 x 108 m/s 3,0 x 1010 cm/s)
La relacin entre la frecuencia y el perodo es inverso: v = 1/T
La luz por su naturaleza corpuscular o de partculas puede considerarse como una corriente de
paquetes de energa que se desplazan a gran velocidad (3,0 x 10 10 cm/s).
Estos paquetes de energa se denominan fotones.
La frecuencia ( ) de la teora ondulante puede relacionarse con la energa de los fotones (E) de
la teora de las partculas mediante la Ecuacin de Planck.

E = h

h es la constante de Planck cuyo valor es de 6,63 x 10 -34 joule . s

El nmero de onda es una caracterstica de onda que es proporcional a la energa y se define

como el nmero de ondas por centmetro:

= 1/

Unidad: cm -1

La radiacin electromagntica se divide en regiones denominadas:

Ondas de radio, Microondas, Infrarrojo, Visible, Ultravioleta y Rayos X, las que se encuentran
asociadas con las longitudes de onda, nmero de ondas, frecuencias y energa, se presentan en el
siguiente grfico. El espectro ptico o electromagntico es detectado por equipos especiales
como:

FOTOCOLORIMETRO: Cuya zona de observacin es en la Zona visible: (400 700 nm).

ESPECTROFOTOMETRO: Estas pueden ser de dos clases:

1 Espectrofotmetro UV que comprende de 10 a 400 nm.

* UV cercano 200 a 400 nm
* UV lejano 10 a 200 nm

2. Espectrofotmetro IR que comprende de 760 a 10 000 nm

* IR cercano 0,75 a 2,50 m
* IR medio 2,50 a 5,00 m
* IR lejano 5,00 a 10 m

Las molculas biolgicas absorben las radiaciones de la regin UV cercana (200 a 400 nm).
Las protenas lo hacen en el UV lejano debido a los enlaces peptdico, mientras que la
Fenilalanina, Tirosina y Triptfano absorben a 280 nm lo cual constituye el fundamento de una
tcnica muy sensible para determinar protenas sin que se destruya la muestra.

Los esteroides, las bases pricas y pirimidnicas, nuclesidos y nucletidos lo hacen tambin en
la regin UV.
Los enlaces o grupos funcionales como: amino, carboxilo, metilo, amida absorben las
radiaciones de la regin IR.

La molcula o parte de ella que se excita por la luz como consecuencia de la absorcin de sta
se denomina CROMOFORO.
Cuando la luz continua se hace pasar a travs de un prisma, la luz sufre una dispersin de sus
longitudes de onda componentes. Cuando estas longitudes de onda dispersas se les hacen pasar
a travs de una celda que contiene la muestra problema (tomos o molculas), la luz emergente
deja de ser continua ya que parte de las ondas de luz han interaccionado con los tomos o
molculas y han sido absorbidos por stos.

Las longitudes de ondas faltantes se detectan cuando la luz emergente de la celda que contiene
la muestra problema incide sobre una placa fotogrfica o sobre algn dispositivo o detector. A
este procedimiento se le denomina ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION.

La longitud de onda en la que las molculas o tomos de la muestra absorben con mayor
intensidad la luz, se denomina LONGITUD DE MAXIMA ABSORCION.

Los procesos de absorcin de las radiaciones electromagnticas son explicados por la Ley de
Lambert-Beer que relaciona la intensidad de la luz incidente (Io) y la transmitida (It) en funcin
de la concentracin de las molculas y tomos que absorben la luz.
Su expresin es:

A = log Io/It = e. l. C

A = - log It/Io = e. l. C

Donde:
A: Absorbancia o Extincin
e : Coeficiente de extincin molar. Valor constante que depende de la naturaleza de la
sustancia y de la longitud de onda.
l: ancho del recipiente de la muestra = 1 cm
C: Concentracin de la muestra problema

II.- OBJETIVOS:

1. Aplicar los conceptos de la espectrofotometra UV - VIS,

2. Representar los resultados de las curvas espectral y estndar del KMn O 4
3. Hallar la concentracin de una muestra desconocida de KMn O 4 usando la curva estndar o
de trabajo.

III.- MATERIALES Y REACTIVOS:

Equipos: Balanza analtica

Espectrofotmetro
Muestra: solucin de Permanganato de Potasio (KMnO 4) 4 %, solucin de anaranjado de metilo
4%, solucin de azul de metileno 4%.
Tubos de Vidrio, gradillas, fiolas, vasos, pipetas, Picetas.

IV.- PROCEDIMIENTO:

PARTE 1.- Longitud de onda ptima (Curva Espectral) para la solucin muestral.

Encender el espectrofotmetro 30 min antes de empezar a trabajar.

Seleccionar la regin visible (VIS) del espectro, e Iniciar las lecturas desde 400 nm.
Colocar en la cubeta agua destilada y llevar a CERO de Absorbancia y 100% de
Transmitancia.
Colocar en otra cubeta la solucin muestral.
Realizar la lectura en Absorbancia y anotar el valor obtenido.
 Aumentar la a 420 nm . Recuerde que cada vez que se cambie de longitud de onda es
necesario graduar el instrumento en CERO con agua destilada en la cubeta. Luego:
LEER la absorbancia.
Repetir la misma operacin DE 20 nm cada vez hasta llegar a 700 nm
En el papel milimetrado dibuje la Curva Espectral A vs

DATOS:

Lectura (A) Lectura (A)

PARTE 2.-Curva de trabajo y cuantificacin de solucin problema.

Clculo de la concentracin de una solucin problema

Existen dos mtodos:

2.1 Mtodo de la curva estndar: Consiste en utilizar varios estndares de concentraciones

conocidas y progresivas para construir un grfico de un sistema de coordenadas, colocndose
las lecturas de concentracin en las abscisas y las lecturas de absorbancia (medidas a la
longitud de onda optima seleccionada) en el eje de la ordenada. En la recta obtenida (funcin
lineal) se pueden extrapolar la absorbancias o densidad ptica de la muestra problema
hallando la concentracin de la misma en el eje de las abscisas

2.2 Factor de Calibracin : El FC relaciona la concentracin de una sustancia estndar con su

absorbancia.
Si la muestra problema y el estndar son procesados de una misma manera la concentracin
de la muestra problema se hallar con la formula siguiente:

Concentracin del estndar

FC = -----------------------------------
Lectura del estndar

MP = Amp x FC

Amp = Absorbancia de la muestra problema

FC = Factor de calibracin

Si la muestra sufre diluciones previas se usar el factor de dilucin ( Fd) que es

matemticamente la inversa de la dilucin
Volumen total
Fd = ---------------------
Volumen medido

MP = Amp x FCx Fd

Fd = Factor de dilucin
Proceder de acuerdo a:
TUBOS 1 2 3 4
KMno4 ml 1 2 3 4
Agua ml. 9 8 7 6
KMno4 mg%

Leer cada uno de los tubos a la longitud de onda elegida o hallada en el primer experimento.
Hallar la concentracin de la muestra problema con los mtodos de la curva estndar y el factor
de calibracin. Proceder de igual modo para las otras soluciones muestras
Comparar ambas medidas y analizar los resultados.

V.- RESULTADOS:
Elaborar las grficas en papel milimetrado con los datos obtenidos en cada uno de los
experimentos.

VI.- INTERPRETACIN

VII.- CONCLUSIONES.

VIII.- CUESTIONARIO:

1.- Dibuje las partes bsicas de un espectrofotmetro tpico.

2.- Cules son los cromforos de las protenas que absorben la luz de 280nm?
3.- Cules son los rangos de energa de la regin Ultravioleta UV, Infraroja IR y que aplicacin
medica considera Ud. que estas tendran?
4.- Porque es importante la ley de Lamber y Beer?

MATERIALES ENCARGADOS PARA LA PRCTICA N 4

- 5 goteros por cada mesa, 10 vasitos descartables de 100 ml. por cada mesa.
- Papel Oscuro delgado o preparar un sistema casero cmara o caja pequea
con tapa que pueda mantener oscuridad en los sistemas de tubos hasta el
momento de su lectura.
- Papel secante o papel higinico blanco.
- Papel milimetrado 2 hojas por alumno, Lpiz, regla.
- Computador ( programa Excel)