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Ácidos nucleicos.
1. NUCLEÓTIDOS.
Los nucleótidos constituyen la unidad fundamental de los ácidos nucleicos y está formada por
tres subunidades características (Figura 1):
¾ un grupo fosfato;
¾ un azúcar de cinco carbonos (pentosa);
¾ y una base nitrogenada ( púrica o pirimídica),
El DNA posee el azúcar desoxirribosa (en el carbono 2’ le falta un átomo de oxígeno), mientras
que el RNA contiene ribosa (Figura 2). Unido a un extremo del azúcar se encuentra un grupo
funcional llamado grupo fosfato. En el otro extremo del azúcar se localiza la base nitrogenada
orientada hacia la zona central de la macromolécula. Existen cinco tipos diferentes de bases
nitrogenadas las que pueden estructurar igual número de nucleótidos diferentes. Dos de
ellas, la adenina y la guanina, tienen una estructura de dos anillos y se conocen como
purinas. Las otras tres, citosina, timina y uracilo, tienen un anillo único y se conocen como
pirimidinas (Figura 3). La adenina, la guanina y la citosina se encuentran tanto en el DNA
como en el RNA, mientras que la timina se encuentra sólo en el DNA y el uracilo sólo en el
RNA.
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Bases pirimídicas
Bases púricas
Figura 3. Bases nitrogenadas. Citosina, timina y uracilo son pirimídicas y adenina y guanina
son púricas.
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• Mensajeros intracelulares como el AMP cíclico (AMPc), que se forma por la acción de
la enzima adenilato ciclasa en respuesta a la unión de ciertas hormonas a los receptores
de membrana.
Todos los organismos celulares, tanto procariotas como eucariotas, tienen DNA de doble
cadena como molécula hereditaria; sin embargo entre los virus se pueden encontrar cuatro
variantes:
• DNA de doble cadena, por ejemplo: los fagos T, herpesvirus, SV40, virus de la viruela.
• DNA de cadena sencilla, por ejemplo: el fago ФX174.
• RNA de doble cadena, por ejemplo: rotavirus (causante de diarrea infantil).
• RNA de cadena sencilla, por ejemplo: el virus del mosaico del tabaco, el virus de la
hepatitis A, poliovirus, VIH y los virus del resfriado.
En las células eucariotas, el DNA se encuentra en el núcleo y una pequeña cantidad en las
mitocondrias y los cloroplastos. En las células procariotas, la molécula de DNA es bicatenaria,
circular, cerrada y desnuda (libre de histonas). Además, estas células pueden tener otras
moléculas más pequeñas de DNA, llamadas plásmidos (pueden ser transferidas de una
bacteria a otra, importantes en biotecnología).
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a) Organización del DNA.
Al igual que en las proteínas, en la molécula de DNA se pueden describir varias estructuras:
¾ Estructura primaria
¾ Estructura secundaria
La estructura secundaria de la doble hélice del DNA, permite explicar, además del
almacenamiento de la información genética, el mecanismo de duplicación del DNA
(replicación semiconservativa), para transmitir la información a las células hijas.
Watson y Crick (1953) postularon un modelo para la estructura tridimensional del DNA,
basándose en los datos obtenidos mediante difracción de rayos X por Franklin y Wilkins, y
en las leyes de equivalencia de bases de Chargaff que indica que el número de bases de
adenina es igual al de timina, así como el número de guanina es igual a la de citosina.
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Esta estructura explica la replicación exacta de las dos hebras. Cada cadena sirve de molde a
la complementaria, de manera que se pueden formar dos hélices con la misma secuencia de
nucleótidos que la parental. Esta propiedad permite transmitir la información genética de
generación en generación.
¾ Estructura terciaria
La replicación consiste en la formación de dos moléculas de DNA con una secuencia de bases
idénticas a partir de una molécula de DNA inicial. (Figura 7).
De acuerdo al modelo de Watson y Crick, la replicación del DNA se basa en la
complementariedad de las bases. Si una cadena de la molécula de DNA tiene una secuencia de
bases, la otra cadena debe tener la cadena complementaria.
Por ejemplo, si una cadena tiene la secuencia 5’ – ATTCGG – 3’, la cadena complementaria es
de 3’ –TAAGCC – 5’.
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Para comprobar que la replicación era semiconservativa, Mathew Meselson y Franklin
Stahl (1958) del Instituto Tecnológico de California, emplearon la técnica del gradiente de
densidad para separar distintas cadenas de DNA con densidades algo diferentes.
• Cultivaron bacterias E. Coli en un medio con amoniaco marcado con nitrógeno pesado
(15N), dejándolo un par de horas, tiempo suficiente para que el nitrógeno contenido en
el compuesto se utilizase durante el ciclo de división bacteriana en la síntesis de DNA.
Después las pasaron a un medio con amoniaco con nitrógeno liviano (14N) y
compararon la densidad de los DNA aparecidos en sucesivas generaciones (Tabla 1 y
Figura 8).
Los resultados obtenidos se esquematizan en la siguiente tabla.
Los datos indican que el DNA intermedio es una cadena híbrida constituida por dos
cadenas de diferente densidad, una liviana y otra pesada. En cada generación
disminuye a la mitad el DNA híbrido y aumenta el DNA con nitrógeno liviano.
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c) Enzimas de la replicación.
Como todo proceso biológico, en la replicación participa un conjunto de enzimas que permiten
que la replicación sea rápida, fiel y eficiente:
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Existen distintos tipos de RNA que se pueden clasificar según su actividad biológica:
Es un RNA de alto peso molecular, también conocido como transcrito primario del RNA, ya
que es el RNA recién sintetizado por la RNA polimerasa en el proceso de transcripción.
En células procariotas, el transcrito primario actúa directamente como molde para la síntesis
de proteínas. En el núcleo de las células eucariotas actúa como precursor de los demás tipos
de RNA que se encuentran en el citoplasma. La fragmentación del hnRNA para formar otros
tipos de RNA constituye la maduración o procesamiento del RNA.
Los rRNA forman parte de los ribosomas que se encargan de sintetizar las proteínas según la
secuencia de nucleótidos de los mRNA. Son filamentos muy plegados, sobre los cuales se
asocian proteínas específicas, constituyendo las subunidades mayor y menor del ribosoma. Las
subunidades ribosómicas, salen luego por los poros de la carioteca al citoplasma. Hay varios
tipos, que se clasifican atendiendo a su coeficiente de sedimentación. Estas moléculas se
sintetizan en el DNA nucleolar a partir de un único RNA precursor.
El rRNA contribuye a dar al ribosoma su estructura acanalada, la cual le permite albergar
simultáneamente un mRNA y una proteína.
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Los tRNA reconocen los codones del mRNA y transfieren un aminoácido determinado a la
proteína que se está sintetizando de forma específica (traducción). Existe al menos un tRNA
para cada aminoácido.
Lederberg, Tatum y sus colegas fueron los pioneros en la genética bacteriana, un campo que
en 20 años hizo de la E. coli el más estudiado de todos los organismos a nivel molecular.
Finalmente, en la década de los 70, la investigación sobre las bacterias condujo al desarrollo
de la tecnología del DNA recombinante.
La tecnología de DNA recombinante es un procedimiento de ingeniería genética que se viene
usando desde hace algunos años y en la actualidad tiene una amplia variedad de aplicaciones.
Esta técnica se basa en la inserción de DNA foráneo al genoma de una célula hospedadora,
para que ésta lo exprese como si fuese suyo. Este proceso se realiza mediante el uso de
enzimas de restricción, vectores de clonación y hospedadores (procariotas o eucariotas), y
consiste en aislar un fragmento de DNA con genes de interés para el investigador e introducirlo
en un vector, el cual se encarga de llevarlo al hospedero para que ocurra recombinación.
El uso masivo de estas técnicas ha rendido altos dividendos en la investigación básica. Por
ejemplo, haciendo uso de la tecnología del DNA, se descubrieron las secuencias no
codificadoras dentro de los genes eucarióticos (intrones). Esta tecnología también ayudó a
descubrir mutaciones y/o genes que provocan cáncer (oncogenes) y quizás el uso más
importante es la investigación en el proyecto del genoma humano. El proyecto del genoma
humano, está revelando las bases genéticas de lo que significa ser un humano. A nivel más
práctico, se espera que este ambicioso esfuerzo nos ayude a comprender y curar muchas
enfermedades.
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a) Obtención de múltiples copias de DNA
Los clones, en genética molecular, son copias múltiples de la misma secuencia de DNA. Las
secuencias a ser clonadas se introducen en células bacterianas por medio de vectores. Los
plásmidos y los virus se usan como vectores. Las secuencias de DNA que se desean clonar
deben ser insertadas en los vectores. Una vez en la bacteria, el vector y el DNA extraño que
lleva, se replican y las múltiples copias pueden ser recuperadas de las células (Figura 11).Los
extremos pegajosos, formados por secuencias TTAA y AATT, pueden unirse con cualquier otro
segmento de DNA que haya sido escindido por la misma enzima. Así es posible insertar un gen
extraño en el plásmido. (En el diagrama de la figura 11, la longitud de las secuencias GAATTC
se ha exagerado y las longitudes de las otras porciones del gen extraño y del plásmido se han
acortado). Cuando estos plásmidos recombinantes, que llevan un gen extraño, se incuban en
ciertas condiciones con bacterias en medio líquido, son captados por algunas de las células
bacterianas. Cuando estas células se multiplican, los plásmidos también se replican; el
resultado es un número creciente de células, todas sintetizando copias del mismo plásmido.
Los plásmidos pueden separarse luego de los otros contenidos celulares y tratarse con EcoRI
para liberar copias múltiples del gen clonado.
Las herramientas de corte para hacer DNA recombinante son enzimas bacterianas llamadas
enzimas de restricción (Ej. EcoRI, HindIII, PstI, etc.), las cuales fueron descubiertas por
primera vez a finales de la década de los 60. Estas enzimas son endonucleasas que reconocen
secuencias específicas en el DNA, normalmente de 4 a 6 pares de bases con simetría rotacional
y producen roturas en las dos cadenas. En la naturaleza, estas enzimas protegen a la bacteria
contra el DNA intruso de otros organismos y virus. Para unir los trozos de DNA se utiliza otra
enzima denominada DNA ligasa.
Hasta la década de 1980, el único método para obtener grandes cantidades de un fragmento
de DNA era clonándolo en vectores adecuados e introducirlo y multiplicarlo en bacterias. En el
año 1986, un investigador norteamericano, K. Mullis, desarrolló un método que permite, a
partir de una muestra muy pequeña de DNA, obtener millones de copias de DNA in Vitro
(figura 12), en unas pocas horas y sin necesidad de usar células vivas. Esta técnica, llamada
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), requiere conocer la secuencia de nucleótidos
de los extremos del fragmento que se quiere amplificar. Estas secuencias se usan para diseñar
dos oligonucleótidos sintéticos de DNA complementarios a una porción de cada una de las dos
cadenas de la doble hélice.
Para clonar genes específicos se puede preparar una biblioteca genómica que consiste en
una colección de fragmentos de DNA genómicos, clonados en vectores, que representan el
genoma entero del organismo.
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Figura 12. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El método consiste en someter a una secuencia
de DNA que interesa clonar, a ciclos de calentamiento y enfriamiento, más los requisitos básicos para la
replicación.
b) La electroforesis en gel.
Una herramienta clave en la tecnología del DNA, es la electroforesis en gel, que es un método
para separar físicamente macromoléculas, como proteínas o ácidos nucleicos, principalmente
sobre la base de su carga eléctrica y tamaño (Figura 13). Si una muestra de DNA se deposita
en el extremo negativo del aparato, la molécula debiera migrar al lado positivo (las moléculas
pequeñas migran más rápido hacia el ánodo). En el caso del DNA tiene carga negativa gracias
a su grupo fosfato. Cuando la corriente se apaga, el resultado es una serie de bandas en cada
fila del gel. Cada banda consiste en moléculas de DNA de distinto tamaño.
Figura 13. Electroforesis en gel de poliacrilamida. A) Depósito que recibe las muestras para ser
sometidas a un campo eléctrico. B) Bandas características una vez teñidas las macromoléculas.
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c) Otras aplicaciones de la tecnología del DNA.
¾ Como una nueva técnica para la medicina forense. Las huellas Del DNA pueden resolver
crímenes.
¾ Producción de fármacos y nuevas vacunas.
¾ Mejoramiento genético en plantas y animales (Organismos transgénicos).
¾ Terapia génica para el tratamiento de enfermedades genéticas.
GLOSARIO.
Anticodón: En una molécula de tRNA, una secuencia específica de tres nucleótidos que es
complementaria al triplete del codón en el mRNA.
Adenosín difosfato (ADP): Un nucleótido compuesto por adenina, ribosa y dos grupos
fosfatos, formado por la eliminación de un fosfato de una molécula de ATP.
AMP cíclico: Forma de adenosina monofosfato (AMP) en la cual los átomos del grupo fosfato
forman un anillo. Funciona como "segundo mensajero” para muchas hormonas y
neurotransmisores de los vertebrados.
Base nitrogenada: Una molécula que contiene nitrógeno y tiene propiedades básicas
(tendencia a adquirir un ion H+); purina (A, G) o pirimidina (T, C y U).
Gen: Una unidad discreta de información hereditaria que consiste en una secuencia de
nucleótidos específica en el DNA. La mayoría de los genes de un eucariótica están localizados
en el DNA cromosómico.
Histona: Una molécula proteica básica y pequeña que está asociada con el DNA y es
importante en el empaquetamiento del DNA en el cromosoma eucariótico.
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NAD+: Dinucleótido de nicotinamida-adenina; una coenzima que forma parte de las enzimas
que transportan electrones durante las reacciones redox del metabolismo celular. El signo de
adición indica que la molécula está oxidada y lista para tomar hidrógenos; la forma reducida
que transporta al hidrógeno es NADH2.
Nucleósido: Un monómero orgánico que está formado por un azúcar de cinco carbonos que
está unido covalentemente a una base nitrogenada. Los nucleósidos son los elementos de
formación de los nucleótidos, basta con agregar un grupo fosfato.
Plásmido: Un anillo pequeño de DNA bicatenario, separado del cromosoma bacteriano. Los
plásmidos se encuentran en procariontes y levaduras.
Transcriptasa inversa: Una enzima que cataliza la síntesis de DNA sobre una plantilla de
RNA.
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