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REDUCTORES.
INTRODUCCIN
La luz puede estudiarse como una radiacin (ondas) cuya frecuencia () y longitud
de onda () estn relacionadas por la importante expresin . = C, donde C es
la velocidad de la luz. Adems, la luz puede considerarse constituida por fotones
cuya energa (E) est dada por E=h = hc/ donde h es la constante de Planck.
La absorcin de la luz puede medirse en trminos de absrorbancia (A) o de
Transmitancia (T), que se definen como A= log(P0/P) y T= P/P0 donde P0 es la
potencia radiante de la luz que incide en una muestra y P es la potencia que
emerge del otro lado.
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alguna. Las soluciones de protenas normalmente se analizan en la regin del
ultravioleta a 280 nm, debido a que los grupos aromticos de los aminocidos
presentes en casi todas las protenas tienen un mximo de absorbancia a 280 nm.
(Harris J. Chem. Ed.).
Linealidad
Sensibilidad
Lmite de deteccin
Lmite de cuantificacin
Intervalo analtico.
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requieren cumplir ciertos criterios de aceptacin en la que estadsticamente se
puede justificar esa linealidad; para ello es necesario calcular:
La pendiente (m)
La ordenada al origen (b)
El coeficiente de determinacin (r2)
Sensibilidad.
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problemas han sido estadsticamente estudiados y varios criterios de decisin han
sido propuestos. Aunque ninguno es universal uno de los ms aceptables es el de
la concentracin que correspondera a la medida del promedio del blanco+ 3s. El
blanco es la seal emitida por el instrumento con una disolucin que contiene las
mismas especies que la muestra problema (pero sin el analito). Para fines de
validacin se considera que deben hacerse 10 mediciones de blancos
independientes El valor de 3s se refiere a tres veces la desviacin estndar al
realizar la medicin de estos blancos.
Intervalo analtico.
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modelo de curva de calibracin lineal, la pendiente vendr dada por la ecuacin
matemtica:
y = mx + b
Exactitud
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Para la determinacin de azcares segn el mtodo Miller, los azcares
reductores pueden reducir al cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) bajo determinadas
condiciones. Cuando el cido 3,5-dinitrosa- liclico es reducido en presencia de
calor, por los azcares reductores que entran en contacto con l, se desarrolla un
cambio de color parecido al caf (con variaciones de amarillo hasta caf). El
cambio de coloracin puede entonces determinarse por lecturas de densidad
ptica, ledas por espectrofotometra a una determinada longitud de onda. La
concentracin de los azcares reductores totales liberados en la muestra se
determina haciendo una interpolacin en la curva patrn del azcar utilizado,
graficando la absorbancia en funcin de la concentracin.
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS ESPECFICOS
MATERIALES Y EQUIPO
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Vasos de pp de 1 litro
Vasos de pp de 250 mL
Reactivo DNS
Reactivo Bradford
Parrilla de calentamiento
Espectrofotmetro con celdas
Vortex
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cuidado de no presionar mucho porque esto hace que la punta quede atorada
fuertemente dificultando retirarla.
4. Tomar la muestra presionando suavemente el mbolo con el pulgar hasta el
primer tope.
5. Introducir la punta de la micropipeta en la muestra no ms de 3 mm de la
superficie de lquido, manteniendo la micropipeta en posicin vertical.
6. Succionar el lquido, relajando suavemente y controlando la presin con el dedo
pulgar, sin permitir que el mbolo suba por s solo. Se espera un par de segundos
con la punta introducida en el lquido.
7. Retirar la punta de la muestra.
8. Introducir la punta de la micropipeta en el tubo o frasco donde se va a verter,
colocando la punta contra la pared del tubo, sin sumergirla en la solucin.
9. Presionar el mbolo lentamente, llevndolo hasta el primer tope, continuando
inmediatamente hasta el segundo tope, para expulsar la totalidad del lquido que
est en la punta.
10. Con el mbolo totalmente presionado se retira cuidadosamente la micropipeta,
deslizando la punta a lo largo de la pared del tubo.
11. Llevar el mbolo a la posicin inicial, controlando con el dedo (sin permitir que
el mbolo suba por s solo).
12. Sacar la punta de la micropipeta, presionando el expulsor de puntas o tirando
de ella. En algunos casos se puede usar la misma punta, para homogenizar la
mezcla, una vez adicionado el volumen, se introduce la punta en la mezcla y se
baja y sube el embolo repetidamente sin llegar al primer tope.
Preparacin de reactivos
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a) Reactivo de Bradford
Una vez terminado el reactivo se debe verificar el color, debe ser caf. Si
tiene un tono azulado no es adecuada y se desecha, debiendo preparar
nuevamente. Filtrar el reactivo cuando sea necesario, conservar en frasco mbar
bajo refrigeracin hasta su uso.
a) Azcares Reductores
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Glucosa (o el azcar reductor ms adecuado en funcin de lo que se vaya a
determinar) en un rango de concentracin de 0 a 1.0 g/L.
2. Las diluciones se prepararn, por duplicado, de acuerdo a la Tabla 1.
3. Una vez que se preparan las diluciones se debe realizar el procedimiento
para azcares reductores.
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10. Elaborar la curva patrn en donde se grafique en el eje de las ordenas
(ejey) promedio de la absorbancia determinada a 540 nm y en el eje de
las abscisas (ejex) el promedio de la concentracin de Glucosa
determinada en g/L.
11. Determina la ecuacin de la lnea recta que relaciona a los dos parmetros:
y = mx + b
b) Determinacin de Protena.
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1. La determinacin de protena de una solucin enzimtica con el mtodo de
Bradford, se determina por medio de una curva tipo con albmina de huevo (AH) y
el reactivo de Bradford.
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3. Discutir los resultados obtenidos.
REFERENCIAS
Bradford, M. M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Anal. Biochem. 72:248-254.
Miller G., 1959. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of
Reducing Sugar. Anal.
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