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MICROBIOLOGIA DOS EUCARIOTAS

Ano Lectivo 2004/05

REPICAGEM E CULTURA DE FUNGOS FILAMENTOSOS

Introduo
As metodologias de repicagem e cultura praticadas na microbiologia bacteriana tm
aplicao imediata para os trabalhos com leveduras. No entanto, a natureza micelar das
colnias de fungos filamentosos e a fcil disseminao dos esporos produzidos por estas
colnias obrigam a tcnicas um pouco diferentes, visando a segurana do operador bem
como a minimizao do risco de contaminaes cruzadas. Neste trabalho sero feitas
repicagens por transferncia de esporos em massa e por transferncia de miclio activo
para diferentes meios de cultura.

Material
Material biolgico
1 cultura de Penicillium
1 cultura de Aspergillus
1 cultura de Fusarium
1 cultura de Trichoderma
1 cultura de Alternaria
1 cultura de Trametes versicolor

Meios de cultura e solues estreis


Soluo de TWS
Agar semi-slido
caixas de petri de 90 mm com Agar de Extracto de Malte (MEA)
caixas de petri de 90 mm com Agar de Czapek (CZ)
caixas de petri de 90 mm com Agar de Batata e Dextrose (PDA)
caixas de petri de 90 mm com Agar Nutriente Sinttico com Papel de Filtro (SNA+PF)

Outro material
agulha de inoculao

I.M. Santos 2005


ansa de inoculao
bisturi
lamparina
fsforos
lcool
copo de 100 ml
fonte de luz UV

Procedimento
Proceda repicagem das culturas de fungos colocadas na sua bancada de acordo com o
esquema indicado no quadro 1.

Quadro 1 esquema de repicagem e incubao (A., B. e C. referem-se aos procedimentos de


repicagem a seguir descritos).
Fungo Repicar para: Incubao
Penicillium chrysogenum MEA e CZ Tamb, 7d C.

Aspergillus oryzae MEA e CZ Tamb, 7d C.


PDA Tamb, 7d;
Fusarium sp. B.
SNA+PF com e sem luz negra
Tamb, 7d
PDA
Trichoderma sp. luz permanente; no escuro; A.
SNA+PF (3 placas)
ciclo dia/noite
Alternaria sp. PDA e SNA+PF Tamb, 7d A.

Trametes versicolor PDA Tamb, 7d B.

No final do perodo de incubao observe as placas cultivadas e registe as observaes;


notar os diferentes tipos de crescimento do mesmo fungo em meios de cultura e
condies de luz diferentes; relacionar o tipo de crescimento observado com a
composio dos meios de cultura.

A. Repicagem de culturas esporulantes


1. observar a cultura do fungo e seleccionar a rea de esporulao de onde se
pretende retirar o inculo;
2. esterilizar chama uma agulha ou ansa de inoculao;
3. deixar arrefecer a agulha ou ansa e, em condies de assepsia, mergulh-la na
soluo de TWS estril fornecida;

I.M. Santos 2005


4. com a agulha ou ansa humedecida transferir uma pequena poro de esporos ou
miclio para o centro de uma caixa de petri com meio de cultura fresco
previamente rotulada com o nome ou cdigo identificador do fungo repicado, a
data e a identificao do grupo de trabalho;
5. incubar temperatura ambiente durante 7 dias.

B. Inoculao com blocos de agar invertidos (Trametes versicolor; Fusarium)


1. flamejar um bisturi;
2. com o bisturi flamejado e arrefecido cortar um pequeno bloco de agar da
periferia da colnia que se pretende repicar;
3. transferir o bloco de agar para o centro de uma caixa com meio de cultura fresco
colocando-o sobre o agar em posio invertida (o miclio do inculo deve ficar
em contacto com o meio de cultura);
4. incubar temperatura ambiente durante 7 dias.

C. Repicagem de espcies de Penicillium e Aspergillus


1. observar a cultura do fungo e seleccionar a rea de esporulao de onde se
pretende retirar o inculo;
2. esterilizar ao rubro uma ansa de inoculao;
3. deixar arrefecer a ansa e, em condies de assepsia, mergulh-la em agar semi-
slido;
6. tocar com a ansa na massa de esporos da colnia de Penicillium ou Aspergillus
que se pretende repicar;
7. transferir os esporos recolhidos na ansa para o agar semi-slido de modo a obter
uma suspenso de esporos;
8. esterilizar de novo a ansa e depois de arrefecida inocular a suspenso em MEA e
em CZ, com a caixa de petri em posio invertida, em 3 pontos equidistantes a
uma distncia de 2 cm da periferia da caixa;
9. incubar temperatura ambiente durante 7 dias.

Bibliografia
Santos I.M., Venncio, A. & Lima, N. (1998) Fungos Contaminantes na Indstria Alimentar.
Micoteca da Universidade do Minho, Braga. 128 pp.

I.M. Santos 2005


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Ano Lectivo 2004/05

RASTREIO DE ACTIVIDADES ENZIMTICAS EXTRACELULARES DE

FUNGOS FILAMENTOSOS

Material
Material biolgico
Mucor sp.
Aspergillus niger
Trichoderma sp.
Alternaria sp.
Phanerochaete chrysosporium

Meios de cultura
tubos com Agar de Czapek e Tributirina (CZ-Tb)
caixas de petri de 90 mm com Agar de Amido (AM)
tubos com Agar de Meio Base e Quitina-azure (MB-Qaz)
caixas de petri de 90 mm com Agar de Peptona e Extracto de levedura com Poly-R478
(PY-Poly R)

Outro material
marcador
fura rolhas
agulha de inoculao
lamparina
fsforos
lcool
copo de 100 ml

Equipamento
Estufa a 30 C

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Procedimento
A. Lipases
1. cortar discos de agar com um dimetro de 10 mm da periferia das colnias com
o auxlio de um fura-rolhas previamente flamejado;
2. inocular em duplicado os tubos CZ-Tb com um disco de agar de cada um dos
fungos em estudo;
3. incubar a 30 C durante 5 e 7 dias;
4. observar o clareamento do meio de cultura opaco e medir as profundidades de
clareamento exibidas.

B. Amilases
1. cortar discos de agar com um dimetro de 10 mm da periferia das colnias com
o auxlio de um fura-rolhas previamente flamejado;
2. inocular em duplicado cada um dos meios de cultura fornecidos com um disco
de agar de cada um dos fungos em estudo;
3. incubar em estufa a 30 C durante 7 e 14 dias;
4. inundar as placas AM com soluo aquosa de iodo durante 30 min;
5. escorrer a soluo e observar o aparecimento de zonas descoradas na placa;
6. medir os halos de reaco enzimtica/ profundidades de clareamento exibidos.

C. Quitinases
1. cortar discos de agar com um dimetro de 10 mm da periferia das colnias com
o auxlio de um fura-rolhas previamente flamejado;
2. inocular em duplicado os tubos MB-Qaz com um disco de agar de cada um dos
fungos em estudo;
3. incubar em estufa a 30 C durante 7 e 14 dias;
4. observar a difuso de corante azul ao longo da profundidade do tubo;
5. registar o resultado para cada fungo em estudo.

D. Lenhinases
1. cortar discos de agar com um dimetro de 10 mm da periferia das colnias com
o auxlio de um fura-rolhas previamente flamejado;
2. inocular em duplicado o meio PY-PolyR com um disco de agar de cada um dos
fungos em estudo;

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3. incubar em estufa a 30 C durante 7 e 14 dias;
4. observar a descolorao do meio de cultura;
5. registar o resultado para cada fungo em estudo.

Questes:
Construa uma tabela de 2 entradas para comparao dos perfis de actividades
enzimticas extracelulares dos fungos testados.

Bibliografia

Lima, N., Teixeira, J. A. & Mota, M. (1991) Deep agar-diffusion test for preliminary screening
of lipolytic activity of fungi. Journal of Microbiological Methods 14, 193-200.

Weber, R.W., Pitt, D. & Webster, J. (1998) Teaching techniques for mycology: 3. Amylase
secretion by Aspergillus oryzae. Mycologist 12, 19-20.

Valente, L., Santos I.M. & Lima, N. (2002) Implementao de tcnicas para avaliao do
potencial degradativo de compostos naturais por fungos. In Ecologia dos Fungos (Eds.
I.M. Santos, A. Venncio & N. Lima), pp. 67-82. Micoteca da Universidade do Minho,
Braga.

I.M. Santos 2005


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Ano Lectivo 2004/05

ISOLAMENTO DE FUNGOS A PARTIR DE UMA AMOSTRA DE SOLO

Material

Material biolgico
Amostra de solo

Meios de cultura e gua para diluio estreis


50 ml gua destilada (em matraz de 100 ml)
6 tubos com 9 ml gua destilada
6 caixas de petri de 90 mm com Agar de Extracto de Batata (PDA)
6 caixas de petri de 90 mm com Agar de Extracto de Batata e Cloranfenicol
(PDA+CF)
6 caixas de petri de 90 mm com Agar de Diclorano Rosa Bengal e Cloranfenicol
(DRBC)
6 caixas de petri de 90 mm com Agar de Extracto de Malte (MEA)

Material de vidro esterilizado


10 Pipetas 1 ml
Espalhador

Outro material
marcador
lamparina
fsforos
pompete
lcool
copo de 100 ml

Equipamento

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vortex
estufa a 35 C

Procedimento
A. Diluies decimais sucessivas
1- rotular 5 tubos de ensaio contendo 9 ml de gua destilada estril com as
diluies respectivas a realizar (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5);
2- colocar 10 g da amostra de solo no matraz de 100 ml fornecido, contendo 50 ml
de gua destilada esterilizada e agitar vigorosamente;
3- com uma pipeta de 1 ml estril, transferir assepticamente 1 ml da suspenso
obtida no ponto 1, depois de passar a boca do matraz pela chama, para um tubo
com 9 ml de gua destilada (diluio 10-1);
4- homogeneizar a suspenso por agitao no vortex segurando a rolha para que
no salte durante a agitao;
5- com uma nova pipeta estril transferir 1 ml da primeira diluio para novo tubo
com 9 ml de gua destilada para obter a diluio 10-2, e assim sucessivamente;
6- Fazer a sementeira de imediato seguindo a ordem decrescente das diluies (usar
uma s pipeta para todas as sementeiras da mesma amostra).

B. Sementeira por espalhamento


1- com uma pipeta esterilizada, retirar 1 ml da diluio 10-5 efectuada em A;
2- entreabrindo cada caixa de petri, colocar 0,2 ml de diluio em cada um dos
meios de cultura fornecidos;
3- utilizando a mesma pipeta, proceder do mesmo modo para inocular os meios de
cultura com a diluio 10-4, e assim sucessivamente at diluio 10-2;
4- flamejar um espalhador de vidro, arrefec-lo e depois pass-lo pela superfcie
dos meios de cultura semeados rodando rapidamente as caixas;
5- incubar as placas temperatura ambiente ou a 35 C durante 7 dias;

C. Isolamento de colnias individualizadas


1- fazer a anotao comparativa do crescimento obtido nos diferentes meios de
cultura para a mesma diluio;
2- procurar distinguir colnias de bactrias, leveduras e fungos filamentosos;
3- repicar as colnias individualizadas de tipos morfolgicos diferentes para MEA;

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4- incubar as placas temperatura ambiente (ou 35 C) durante 7 dias.
Questes
a. Caso pretendesse fazer a contagem de unidades formadoras de colnias (UFC)
poderia usar uma s pipeta para todas as sementeiras da mesma amostra no
ponto A.6? Justifique.
b. Compare e comente os resultados obtidos para as mesmas amostras nos
diferentes meios de cultura (PDA, PDA + CF, DRBC).

Bibliografia
Santos I.M., Venncio, A. & Lima, N. (1998) Fungos Contaminantes na Indstria Alimentar.
Micoteca da Universidade do Minho, Braga. 128 pp.

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OBSERVAO E IDENTIFICAO DE FUNGOS FILAMENTOSOS

Material
Material biolgico
Culturas puras de fungos filamentosos

Lquidos de montagem
Azul de algodo
Lactofucsina
cido lctico

Material de vidro
Lminas
Lamelas

Outro material
agulha de inoculao
pina
bisturi
marcador
lamparina
fsforos
gua destilada
lcool
copo de 100 ml
papel absorvente
verniz das unhas

Equipamento
Lupa (ampliao 5 a 25x)

I.M. Santos 2005


Microscpio ptico

Procedimento
A. Observao directa
1. observar as culturas de fungos e anotar para cada uma delas a cor, textura,
recorte e dimetro das colnias;
2. colocar a cultura sob a lupa e observ-la com luz reflectida, com luz transmitida
e com as duas fontes de luz combinadas;
3. desenhar as estruturas reprodutoras observadas.

B. Observao ao microscpio
1. observar a placa a baixa ampliao (lupa) para determinar as reas de
esporulao;
2. colocar uma gota de lquido de montagem na lmina;
3. transferir, com uma agulha de inoculao previamente esterilizada e arrefecida
na extremidade da placa, uma pequena poro de material da rea de
esporulao para o lquido na lmina (usar uma segunda agulha ou o canto da
lamela para remover o material aproveitando para o dissociar se necessrio);
4. cobrir a preparao com uma lamela;
5. se necessrio, limpar o excesso de corante em redor da lamela pressionando com
papel absorvente sem provocar o deslocamento da lamela;
6. colocar a preparao na platina do microscpio;
7. observar e desenhar as estruturas reprodutoras;
8. identificar os fungos isolados do solo ao nvel do gnero com o auxlio dos
diagramas e chave fornecidos (compare as caractersticas do seu isolamento com
a descrio do gnero);
9. caso pretenda selar a preparao para visualizao futura passar verniz das unhas
num movimento nico sobre cada uma das arestas da lamela sem provocar o
seu deslocamento.

C. Preparaes de espcies de Penicillium e Aspergillus


1. recolher, com uma agulha de inoculao previamente esterilizada e arrefecida na
extremidade da placa, uma pequena quantidade de material da periferia da

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colnia (movimento do centro para a periferia de modo a recolher estruturas em
diferentes estados de maturao);
2. colocar o material no centro de uma lmina com o auxlio de uma segunda
agulha ou o canto da lamela, caso seja necessrio;
3. deixar cair uma gota de lcool sobre o material e balanar a lmina para um e
outro lado e depois deixar o lcool escorrer para papel absorvente (o excesso de
esporos que iriam mascarar a preparao so assim removidos);
4. deixar secar;
5. colocar uma gota de corante sobre o material e cobrir com uma lamela;
6. se necessrio, limpar o excesso de corante em redor da lamela pressionando com
papel absorvente sem provocar o deslocamento da lamela;
7. caso pretenda selar a preparao para visualizao futura passar verniz das unhas
num movimento nico sobre cada uma das arestas da lamela sem provocar o
seu deslocamento,.

D. Preparaes de espcies de Fusarium


1. as culturas de Fusarium devem estar crescidas em placas com meio SNA-PF de
2-3 mm de espessura;
2. observar a placa a baixa ampliao (lupa) para determinar as reas de
esporulao;
3. flamejar um bisturi e cortar, da rea de esporulao seleccionada, um bloco de
agar de ca 1 cm de lado;
4. colocar o bloco de agar sobre a lmina com a cultura virada para cima;
5. deixar cair uma gota de gua sobre a superfcie do bloco de agar e cobrir com
uma lamela sem esmagar o agar!
6. as estruturas intactas esto prontas a serem visualizadas no microscpio atravs
do agar transparente.

E. Mtodo da fita-cola
1. colocar na lmina uma gota de azul de algodo;
2. cortar um pequeno quadrado de fita-cola;
3. com o auxlio de uma pina pressionar ligeiramente a parte da fita que cola sobre
o fungo;

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4. colocar a fita-cola sobre o de azul de algodo na lmina com a face que cola
virada para cima;
5. cobrir a preparao com uma lamela;
6. se necessrio, limpar o excesso de corante em redor da lamela pressionando com
papel absorvente sem provocar o deslocamento da lamela;
7. a preparao est pronta para observao.

Bibliografia
Santos I.M., Venncio, A. & Lima, N. (1998) Fungos Contaminantes na Indstria Alimentar.
Micoteca da Universidade do Minho, Braga. 128 pp.

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