Rev Lab Clin.

2011;4(3):127133

Revista del Laboratorio Clnico

www.elsevier.es/LabClin

ORIGINAL

Desarrollo y validacin de un mtodo para la determinacin de

darunavir en plasma mediante LC-MS/MS
Sonia Pajares Garca , David Guilln Tunica y Merc Brunet Serra

Laboratorio de Farmacologa y Toxicologa, Servicio de Bioqumica y Gentica Molecular, Hospital Clnic y Provincial de
Barcelona, IDIBAPS, Universidad de Barcelona, Barcelona, Espana

Recibido el 31 de mayo de 2010; aceptado el 13 de diciembre de 2010

Disponible en Internet el 4 de mayo de 2011

PALABRAS CLAVE Resumen

Darunavir; Introduccin: Darunavir es uno de los frmacos inhibidores de la proteasa de ltima generacin
Inhibidor de utilizado para el tratamiento de la inmunodeciencia adquirida por VIH debido a su destacada
proteasa; ecacia teraputica y su mejor tolerancia, entre otras peculiaridades. Varios estudios demues-
Tratamiento tran una correlacin entre la dosis y el efecto de darunavir, aunque todava no se ha establecido
antirretroviral; un intervalo teraputico para las concentraciones del frmaco. Estos factores junto con una
Monitorizacin elevada variabilidad farmacocintica interindividual adems de interacciones farmacolgicas
farmacocintica; con otros frmacos, refuerzan la idea de la importancia de disponer de un mtodo sensible para
LC/MS/MS la monitorizacin de sus concentraciones plasmticas en pacientes tratados.
Objetivos: Validacin tcnica de un mtodo para la determinacin de las concentraciones
plasmticas de darunavir mediante LC/MS/MS.
Materiales y mtodos: El proceso de validacin se desarroll segn el procedimiento descrito
en la gua ICH Topic Q 2B Validation of Analytical Procedures: Methodology (CPMP/ICH/281/95).
El darunavir se extrae del plasma mediante una precipitacin de protenas. La separacin cro-
matogrca se consigui utilizando una columna X-BridgeTM C18 3,5 m 2,1 100 mm (Waters )
con un programa de elucin en gradiente de acetonitrilo y tampn. Para la deteccin de los anali-
tos, se utiliz un espectrmetro de masas de triple cuadrupolo Quattro micro con electroespray
en modo de ionizacin positivo.
Resultados: Linealidad (0,1-10 g/mL): y = 18,85-150,4 r2 : 0,997. Precisin: CV intraensayo:
1,07-4,62%. CV interensayo: 2,72-4,70%. Exactitud: intra-ensayo: 1-9%; inter-ensayo: 2-7%; LD:
0,05 g/mL; LQ: 0,15 g/mL.
Conclusiones: Este mtodo desarrollado basado en LC/MS/MS, posee una adecuada sensibilidad
y reproducibilidad para la determinacin de darunavir en plasma de pacientes tratados.
2010 AEBM, AEFA y SEQC. Publicado por Elsevier Espaa, S.L. Todos los derechos reservados.

Este trabajo corresponde a una comunicacin cientca presentada y premiada en el III Congreso Nacional del Laboratorio Clnico

celebrado en Valencia del 14 al 16 de octubre de 2009.

Autor para correspondencia.

Correo electrnico: spajares@clinic.ub.es (S. Pajares Garca).

1888-4008/$ see front matter 2010 AEBM, AEFA y SEQC. Publicado por Elsevier Espaa, S.L. Todos los derechos reservados.
doi:10.1016/j.labcli.2010.12.002

Descargado para Anonymous User (n/a) en ClinicalKey Espanol Colombia, Ecuador & Peru Flood Relief de ClinicalKey.es por Elsevier en junio 02, 2017.
Para uso personal exclusivamente. No se permiten otros usos sin autorizacin. Copyright 2017. Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
 128 S. Pajares Garca et al

KEYWORDS Development and assessment of a method for the determination of darunavir in

Darunavir; plasma by LC-MS/MS
Protease inhibitor;
Abstract
Antiretroviral
Introduction: Darunavir is a latest generation of protease inhibitors (PI) drugs used as a treat-
treatment;
ment of HIV infection owing to its improved efcacy and its better tolerance among other
HIV;
characteristics. Several studies have demonstrated a correlation between the dose and the
Pharmacokinetics
effect of darunavir, although a therapeutic range for the drug concentrations has not yet been
monitoring;
established. These factors, besides the high inter-individual variability and the adverse effects
LC/MS/MS
resulting from drug interactions, reinforce the need for having a sensitive method for monitoring
its plasma concentrations in treated patients.
Objective: Technical validation of a new method for darunavir plasma concentration monitoring
by LC/MS/MS.
Materials and methods: The method validation procedure was based on the recommendations
published in the guidelines ICH Topic Q 2B Validation of Analytical Procedures: Methodology
(CPMP/ICH/281/95). Darunavir was extracted from plasma samples by a protein precipitation
procedure. The chromatographic separation was achieved with a gradient program (acetoni-
trile/buffer) on an X-BridgeTM C18 3.5 m 2.1100 mm (Waters ). Analytes quantication is
performed by electrospray ionization in positive mode, a Quattro Micro triple quadrupole mass
spectrometer.
Results: Linearity (0.1-10 g/mL): y = 18.85-150.4 r2 : 0.997. Precision: Intra-assay CV: 1.07-
4.62%. Inter-assay CV: 2.72-4.70%. Accuracy: Intra-assay: 1-9%. Inter-assay: 2-7%. LOD:
0.05 g/mL, LLOQ: 0.15 g/mL.
Conclusion: The developed method based on LC/MS/MS has an adequate sensibility and repro-
ducibility for the determination of plasma concentrations of darunavir in treated patients.
2010 AEBM, AEFA y SEQC. Published by Elsevier Espaa, S.L. All rights reserved.

Introduccin teniendo como consecuencia una mayor ecacia y duracin

de accin contra la proteasa viral. La Kd (indicadora de
El tratamiento de la enfermedad producida por el VIH se la anidad o fuerza de unin del enzima al sustrato) del
fundamenta en una terapia combinada de varios frma- darunavir es de Kd 4,5 1012 mol/L, 100 veces superior al
cos antiretrovirales incluyendo generalmente dos anlogos amprenavir (Kd 3,9 1010 mol/L), otro frmaco inhibidor
nucleosdicos de la transcriptasa inversa (INRT), junto con de la proteasa, el cual presenta una estructura qumica
un inhibidor de la proteasa (IP) o un inhibidor no nucleo- similar al darunavir2,3 .
sdico de la transcriptasa inversa (INNRT). En los ltimos
a
nos se han desarrollado nuevas opciones teraputicas que
aportan una mayor ecacia y tolerancia y sobretodo con
NH2
especial inters en el desarrollo de tratamientos dirigidos
a pacientes que han tenido experiencia previa con trata-
mientos antiretrovirales y que han presentado resistencia a
estos frmacos1 . O
Darunavir (DRV) es uno de los nuevos inhibidores de pro- S
teasa de ltima generacin con potente actividad frente O
N
a diferentes cepas virales del VIH resistentes a otros IP.
Darunavir recibe el nombre comercial de Prezista y es utili-
zado en combinacin con otros frmacos antiretrovirales en HO
pacientes con experiencia previa de tratamientos antiretro-
virales y en pacientes nave. NH

O
H
Actividad antiviral O

Darunavir presenta en su estructura molecular un grupo

3(R), 3a(S), 6a(R)-bistetrahidrofuraniluretanoisstero O O
(g. 1). Este grupo favorece la formacin de fuertes enlaces H
de tipo puentes de hidrgeno con el centro activo de la
proteasa. Este tipo de unin representa una asociacin Figura 1 Estructura molecular de darunavir (presenta un
rpida con la enzima y tambin una disociacin lenta grupo 3(R), 3a(S), 6a(R)-bistetrahidrofuraniluretanoisstero).

Descargado para Anonymous User (n/a) en ClinicalKey Espanol Colombia, Ecuador & Peru Flood Relief de ClinicalKey.es por Elsevier en junio 02, 2017.
Para uso personal exclusivamente. No se permiten otros usos sin autorizacin. Copyright 2017. Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
 Desarrollo y validacin de un mtodo para la determinacin de darunavir en plasma mediante LC-MS/MS 129

Propiedades farmacocinticas Tabla 1 Interacciones farmacolgicas contraindicadas con

darunavir
Darunavir administrado conjuntamente con ritonavir por
va oral presenta una absorcin rpida alcanzando con- Frmacos contraindicados Conviene monitorizar la
centraciones plasmticas (Cmax ) a las 2,5-4 horas. La ecacia y la seguridad del
biodisponibilidad oral absoluta se incrementa del 37% a un tratamiento
82% cuando se combina con ritonavir (14 veces) y disminuye Antihistamnicos (astemizol, Anticoagulantes (warfarina)
a un 30% cuando se administra con alimento. terfenadina)
En plasma se encuentra unido un 95% a la - Derivados ergticos Antagonistas de los canales
cidoglicoprotena (AAG). El volumen de distribucin (ergotamina, de calcio (felodipino,
tambin se incrementa en presencia de ritonavir (Vd : 131L) dihidroergotamia, nifedipino, nicardipino)
frente a darunavir administrado en monoterapia (Vd : 88L)4 . ergonovina y
Darunavir sufre un metabolismo oxidativo heptico metilergonovina)
mediante el citocromo P450, principalmente el CYP3A4, Agentes procinticos Inmunosupresores
dando lugar a tres metabolitos oxidativos con actividad 10 (cisaprida) (ciclosporina, sirolimus o
veces inferior al darunavir. El inters de su uso combinado tacrolimus)
con 100 mg de ritonavir recae en el efecto inhibitorio de Neurolpticos (pimozida) Esteroides (dexametasona,
ste ltimo sobre el metabolismo heptico de darunavir uticasona, budesonida)
favoreciendo el incremento de la exposicin sistmica de Hipnticos (midazolam,
darunavir. Como consecuencia su semivida de eliminacin se triazolam)
incrementa a 15 horas. La eliminacin del frmaco intacto Antiarrtmicos (amiodarona,
es del 41,2% en heces y un 7,7% en orina4 . bepridilo, quinidina o
lidocana sistmica)
Interacciones farmacolgicas

Darunavir y ritonavir son inhibidores y sustratos del cito-

cromo CYP3A4, por lo que la administracin conjunta con
otros frmacos que sean metabolizados por el mismo sistema
dar lugar a alteraciones en las concentraciones plasmti-
cas de dichos frmacos afectando en la ecacia teraputica
o bien en la aparicin de efectos adversos. Existen deter-
minadas combinaciones con ciertos frmacos que estn
totalmente contraindicadas, mientras que hay otras asocia-
ciones con darunavir que aunque no estn contraindicadas5 ,
s que requieren de una monitorizacin de las concen-
traciones plasmticas de darunavir para tener un manejo
controlado del rgimen teraputico que se ha instaurado
(tabla 1).
Ecacia teraputica
En un ensayo clnico los estudios de la fase II se llevan a
cabo para determinar la ecacia teraputica de un frmaco
en un grupo de pacientes afectados por dicha enfermedad.
Esta fase se divide en la fase IIA en la que se estudia la dosi-
cacin y la fase II B en la que se llevan a cabo estudios para
ver la ecacia de dicha dosicacin ensayada. En esta fase
se intent buscar la dosis ptima de darunavir utilizando
diferentes dosis y cambiando el rgimen de la posologa.
Se demostr entonces que exista una relacin proporcio-
nal entre la dosis y la exposicin sistmica AUC24h (rea
bajo la curva), Cmin (concentracin mnima), Cmax (concen-
tracin mxima), t1/2term (vida media del frmaco)6 . Aunque
no se ha establecido un intervalo teraputico propiamente
dicho, s que se ha hallado un rango de concentraciones ms
ecaces y seguras para la Cmin referente a los pacientes par-
ticipantes que tomaban una dosis de 600 mg DRV/100 mg
ritonavir dos veces al da (Cmin : 1,3-7,4 g/mL) y con una
dosis de 800 mg/DRV/100 mg ritonavir una vez al da (Cmin :
0,4-7,2 g/mL)4 . La media de las Cmin fue 37 veces superior a
la EC50 = 55 ng/mL46 lo cual signica que la Cmin no caa por
debajo de los niveles de ecacia teraputica. No obstante,
no hay una buena correlacin entre la respuesta virolgica
y la concentracin de DRV considerada aisladamente, por lo
que no se ha identicado un umbral de la concentracin valle
de DRV relacionado con una mayor probabilidad de respuesta
virolgica (concentracin mnima efectiva [CME])7,8 .
Sin embargo, s que se encontr que el mejor predictor
de la respuesta virolgica era el cociente inhibitorio (IQ)
ratio entre la Cmin y el valor de EC50 basal (concentracin
efectiva del 50% en pre-dosis), de manera que valores de
IQ 1,5 signicaban una mayor probabilidad de reduccin
de la carga viral4 .
Por otro lado, se demostr que exista una relacin entre
la dosis y el efecto de darunavir como tambin la eca-
cia superior de darunavir respecto a otros inhibidores de
proteasa6,7 .
Como conclusin en estos ensayos se identic que la
dosis ptima era la de 600 mg de darunavir potenciado con
100 mg de ritonavir dos veces/da6 y fue con esta dosis selec-
cionada con la que evualaron a posteriori la tolerancia y
seguridad del frmaco. Se observ que darunavir era un fr-
maco bien tolerado, con reacciones adversas de grado 1 y 2,
con una incidencia de reacciones adversas inferior al resto
de IP49 .
Otros estudios recientes tambin han demostrado que
el tratamiento de darunavir en monoterapia presentaba
una ecacia no inferior a la triple terapia usada hasta
ahora formada por darunavir y dos anlogos nuclesidicos
de la transcriptasa reversa10 . Estos resultados son relativa-
mente novedosos, por lo que todava quedan por realizar
ms estudios para ofrecer ms informacin a tal eviden-
cia; no obstante, estos hallazgos aportan matices de suma
importancia en la terapia antiretroviral de la enfermedad
producida por el VIH.
En conclusin, darunavir es un frmaco con una ecacia
teraputica destacada y una buena tolerancia. No obstante,

Descargado para Anonymous User (n/a) en ClinicalKey Espanol Colombia, Ecuador & Peru Flood Relief de ClinicalKey.es por Elsevier en junio 02, 2017.
Para uso personal exclusivamente. No se permiten otros usos sin autorizacin. Copyright 2017. Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
 130
dado que an no se ha establecido un rango teraputico bien
denido de concentraciones plasmticas; que su sistema de
metabolizacin heptico es compartido por muchos otros
frmacos (derivando as en interacciones farmacolgicas);
y que existe una elevada variabilidad farmacocintica inte-
rindividual, es importante disponer en el laboratorio clnico
de un mtodo sensible para la monitorizacin de sus con-
centraciones plasmticas en aquellos pacientes tratados con
posibles riesgos de desencadenar reacciones adversas o una
disminucin de la ecacia teraputica del tratamiento. Por
ello, el objetivo de este trabajo fue elaborar un mtodo pre-
vio al estudio con pacientes tratados mediante LC/MS/MS
para la determinacin de darunavir en plasma.
Materiales y mtodos
Los ensayos para el desarrollo y validacin del mtodo para
la determinacin de darunavir tuvieron lugar en el Labora-
torio de Farmacologa de Fase I del Servicio de Bioqumica
Clnica del Hospital Clnic de Barcelona durante un perodo
de dos meses liderado por la Dra. Merc Brunet.
Estndares y reactivos
El estndar de darunavir (DRV) fue suministrado por Tibotec-
Johnson&Johnson y se almacen a 20 C.
Ritonavir deuterado (A-86903), como estndar interno,
fue suministrado por Abbot Diagnostics. cido frmico (cali-
dad para LC/MS) y acetato amnico (calidad para LC/MS)
fueron obtenidos de Fluka (Steinheim, Alemania). Metanol
(calidad para HPLC) y acetonitrilo (calidad para HPLC) fue-
ron comprados a Panreac (Barcelona).
Soluciones estndar y curva de calibracin
Se preparar una solucin stock de darunavir de una con-
centracin de 2 mg/mL y del estndard interno (ritonavir
deuterado) de 1 mg/mL usando metanol como solvente. Las
soluciones fueron almacenadas a 80 C para asegurar la
estabilidad al menos durante 6 meses (segn experiencia
previa de los tests de estabilidad realizados en el laborato-
rio, cuyas reas de dichas soluciones metanlicas congeladas
eran comparables con disoluciones nuevas recin prepara-
das).
El pool de plasma de un grupo sano libre de frmaco fue
proporcionado por el Banc de Sang i Teixits de Barcelona
(BST Barcelona). Se analiz previamente como un blanco
para comprobar la ausencia de picos de sustancias interfe-
rentes en el anlisis cromatogrco, con el n de utilizarlo
como matriz biolgica para calibradores y controles. Se pre-
pararon 7 puntos de calibracin (0,1 g/mL, 0,25 g/mL,
0,5 g/mL, 1 g/mL, 2,5 g/mL, 5 g/mL, 10 g/mL) y 4
concentraciones para los controles (0,3 g/mL, 0,9 g/mL,
3 g/mL, 7,5 g/mL) a partir de una solucin de trabajo de
100 g/mL.
Preparacin de la muestra
nadir 50 l de calibrador o
El primer paso consisti en a
control en eppendorfs junto con 600 l de una solucin
Descargado para Anonymous User (n/a) en ClinicalKey Espanol Colombia, Ecuador & Peru Flood Relief de ClinicalKey.es por Elsevier en junio 02, 2017.
Para uso personal exclusivamente. No se permiten otros usos sin autorizacin. Copyright 2017. Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
S. Pajares Garca et al
120
% Fase mvil a (ACN)
100
80
60
40
20
0
0 1,5 2 3,5 3,6 5,5
Tiempo total de anlisis (min)
Figura 2 Programa de gradiente de la fase mvil A (acetoni-
trilo) para el anlisis cromatogrco de darunavir.
de acetonitrilo/metanol (50:50) y 40 l de estntar interno
(SI) de una solucin de trabajo (10 g/mL en metanol/agua
50:50). Inmediatamente se agita al vrtex durante 30 segun-
dos y se centrifugan los tubos en una centrfuga (Abbott) a
10.900 rpm durante 10 min a temperatura ambiente. A con-
tinuacin 200 l del sobrenadante se transeren a un vial de
cromatografa donde previamente se ha a nadido 200 l de
agua de calidad Milli Q y se mantienen a 5 C en el interior
del carro de muestras del cromatgrafo hasta su anlisis11 .
Instrumentacin y condiciones analticas
El cromatgrafo lquido de alta resolucin (HPLC) utilizado
fue el modelo Alliance 2795 (Waters, Milford, MA, USA). La
columna analtica del HPLC fue una columna X-BridgeTM C18
(2,1 100 mm, 3,5 m, Waters) que se mantena a 65 C en
el horno de la columna.
La fase mvil estaba compuesta de una solucin A (aceto-
nitrilo) y una solucin B (acetato amnico 3 mM/0,1 M cido
frmico) y segua un programa de elucin en gradiente. Se
iniciaba con un 60% de fase mvil A y un 40% de fase mvil
B durante 1,5 min. A continuacin durante 0,5 min se incre-
mentaba el ujo al 100% de la fase mvil A y se mantena
durante 1,5 minutos. Finalmente durante 0,1 min descenda
a un 60% de fase mvil A y a un 40% de fase mvil B man-
tenindose en esta proporcin durante 1,9 min (g. 2). El
volumen de inyeccin era de 40 l, el ujo de 0,4 mL/min y
un tiempo total de anlisis de 5,5 min.
Para la deteccin, se utiliz un espectrmetro de masas
de triple cuadrupolo Quattro micro (Micromass, Manches-
ter, UK). La ionizacin se produca por electrospray en modo
positivo usando un potencial del capilar de 1 kV. La tem-
peratura de la fuente era de 120 C y la temperatura de
desolvatacin de 300 C. El ujo del gas de nebulizacin era
de 700 l/h y el ujo del gas de cono de 50 l/h. Las transicio-
nes m/z de los iones detectados fueron 548,3 > 392,4 para
el darunavir y 747,7 > 322,2 para el ritonavir deuterado (ya
que son stos los fragmentos hijos mayoritarios tras la frag-
mentacin de la molcula tal y como se describe en otros
mtodos descritos en la bibliografa)1113 . Dichas transicio-
nes se han escogido con una resolucin de 0,6 (anchura del
pico a mitad de altura). En la tabla 2 se recogen parmetros
especcos para cada transicin estudiada. El procesamiento
de los datos se realiz usando el software MassLynxTM V 4.0 y
la curva de calibracin se construy utilizando un factor de
1/x para ponderar la recta calculada por mnimos cuadrados.
 Desarrollo y validacin de un mtodo para la determinacin de darunavir en plasma mediante LC-MS/MS 131

Tabla 2 Parmetros especcos del detector de espectrometra de masas y caractersticas del anlisis cromatogrco de los
analitos
Compuesto Voltaje Energa de Transiciones Tiempo
cono (V) colisin (eV) masas (m/z) retencin (min)
DRV 25 13 548,3 > 392,4 1,1
SI (ritonavir deuterado) 30 20 747,7 > 322,2 1,9

Parmetros de validacin
El proceso de validacin se realiz siguiendo el protocolo
descrito en la gua ICH Topic Q 2B Validation of Analytical
Procedures: Methodology14 .
En el caso de la precisin intra-da y exactitud, se realiza-
ron 5 replicados para cada concentracin de control durante
el mismo da. En el caso de la exactitud y precisin inter-da,
se realizaron 5 replicados diarios durante tres das dife-
rentes. La precisin se expres como desviacin estndar
relativa para cada control y no deba sobrepasar el 15% segn
indica la gua. La linealidad se evalu en un rango de con-
centraciones entre 0,1-10 g/mL usando 7 concentraciones.
Para aceptar la validacin se asumi un valor mnimo de
r2 = 0,997. Para aceptar el test de exactitud se consideraron
valores ptimos el 100 15% del valor terico del control
segn indica la gua. En el caso del lmite de cuanticacin
(LQ) se analizaron 5 plasmas libres de frmaco a los cua-
les se les anadi una concentracin de darunavir igual a la
del calibrador ms bajo (0,1 g/mL). La exactitud del LQ
debera estar en un 100 20% y la precisin por debajo del
20%. En cuanto al lmite de deteccin, se analizaron 5 plas-
mas libres de frmaco a los cuales se les haba a
nadido una
concentracin de darunavir inferior a la concentracin del
calibrador ms bajo (0,05 g/mL).
El efecto matriz se evalu en las cuatro concentraciones
de controles. Para ello, se a
nadi darunavir en concentra-
ciones equivalentes a las obtenidas para los controles a
cinco sobrenadantes resultantes de la extraccin de plasmas
blanco (sin frmaco) para cada concentracin de control. Por
otro lado, se prepararon soluciones estndar en fase mvil
que contenan darunavir a concentraciones equivalentes. El
resultado se obtuvo del ratio obtenido entre la media de las
reas de los cinco picos de darunavir de los blancos post-
extraccin y la media de las reas de los estndares en fase
mvil.
Existen diferentes maneras de evaluar la recuperacin
de un mtodo, en nuestro laboratorio se ensay para las
cuatro concentraciones de controles comparando la media
de las reas de 5 replicados de cada concentracin de con-

DRV,SI 100ng/mL
160108_102 MRM of 4 Channels ES+
1,09 548,3 > 392,4
2,86e4
%

2
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,75 2,00 2,25 2,50 2,75 3,00 3,25 3,50 3,75 4,00 4,25 4,50 4,75 5,00 5,25

160108_102 MRM of 4 Channels ES+

1,95 747,7 > 322,2
2,26e6
%

0 Time
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,75 2,00 2,25 2,50 2,75 3,00 3,25 3,50 3,75 4,00 4,25 4,50 4,75 5,00 5,25

Figura 3 Cromatograma del calibrador de 0,1 g/mL de darunavir y estndar interno.

Descargado para Anonymous User (n/a) en ClinicalKey Espanol Colombia, Ecuador & Peru Flood Relief de ClinicalKey.es por Elsevier en junio 02, 2017.
Para uso personal exclusivamente. No se permiten otros usos sin autorizacin. Copyright 2017. Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
 132
Tabla 3 Valores de precisin intra-da e inter-da (R.S.D %) y exactitud de darunavir en plasma (n = 5)
Controles Concentracin (g/mL) Precisin (%)
Intra-ensayo
C1 0,3 3,3
C2 0,9 2,7
C3 3 2,7
C4 7,5 1,9
LD 0,05
LQ 0,15
trol pre-extraccin con la media de las reas de los picos
post-extraccin.
El anlisis del carryover se realiz segn las recomen-
daciones de la gua Proposals for the description and
measurement of carry-over effects in clinical chemistry15 .
El anlisis de los resultados de la validacin se realiz con
el programa de procesamiento de datos Excel.
Resultados
Los parmetros del espectrmetro de masas se optimiza-
ron para favorecer las transiciones que presentaron mayor
sensibilidad: 548,3 > 392,4 para el darunavir y 747,7 > 322,2
para el ritonavir deuterado. Las condiciones cromatogrcas
mostraban un perl como el que se observa en la gura 3.
Darunavir llega al detector en el minuto 1,1 y el ritonavir
deuterado en el minuto 1,95 (tabla 2).
Validacin
Se analizaron 6 muestras de plasma libres de darunavir y
no se observaron interferencias con el anlisis de darunavir.
El mtodo fue lineal en el rango de concentraciones de 0,1-
10 g/mL obteniendo un valor de r2 = 0,997. Todos los puntos
de la calibracin presentaron una exactitud por encima del
85% (Intra-da: 92,5-97,3% e Inter-da: 92,5-97,74%) y una
precisin por debajo del 15% (Intra-da: 1,9-3,3% e Inter-da:
0,7-1,2%) tal y como se indica en las guas para su anlisis.
En el caso del lmite de cuanticacin (LQ), se acept la con-
centracin de 0,15 g/mL y para el lmite de deteccin (LD)
de 0,05 g/mL. En todos los casos el valor de recuperacin
estaba por encima del 75%. La evaluacin del efecto matriz
descartaba interferencias con darunavir y mostraba que las
condiciones del anlisis no afectaban a la ionizacin de la
molcula. Todos los resultados de la validacin se recogen
en la tabla 3. El mtodo se utiliz para monitorizar pacientes
tratados con dicho frmaco. Se evaluaron las posibles inte-
racciones con otros frmacos antiretrovirales (raltegravir,
ritonavir, lopinavir, atazanavir), inmunosupresores (tacroli-
mus, ciclosporina, everolimus y sirolimus) y sus metabolitos
y no se detectaron interferencias analticas.
Discusin
El uso de los inhibidores de proteasa en el rgimen terapu-
tico del tratamiento de la inmunodeciencia adquirida por
VIH se est convirtiendo cada vez ms en una prctica ecaz
a la hora de tratar a estos pacientes afectados por el virus.
Descargado para Anonymous User (n/a) en ClinicalKey Espanol Colombia, Ecuador & Peru Flood Relief de ClinicalKey.es por Elsevier en junio 02, 2017.
Para uso personal exclusivamente. No se permiten otros usos sin autorizacin. Copyright 2017. Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
S. Pajares Garca et al
Exactitud (%)
Inter-ensayo Intra-ensayo Inter-ensayo
1,2 92,6 92,62
1,04 92,5 92,51
1,17 97,3 97,6
0,70 95,2 97,74
Sobretodo, los IP adquieren mayor importancia en aque-
llos pacientes en los que una terapia previa con otros
tratamientos antiretrovirales ha fracasado debido a cepas
del virus resistente a estos frmacos, y entre ellos se
encuentra darunavir, uno de los nuevos frmacos con
excelente ecacia antiretroviral y una buena tolerancia
demostrada. No obstante, todava se desconocen algunos
aspectos en cuanto a las concentraciones asociadas a un
rango teraputico establecido de darunavir o el comporta-
miento farmacocintico en determinadas poblaciones. Por
ello, la monitorizacin de sus concentraciones plasmticas
resulta de inters para el manejo de efectos adversos, para
optimizar la ecacia del tratamiento o para controlar deter-
minadas interacciones farmacolgicas.
Estos intereses nos condujeron a desarrollar un mtodo
de determinacin de darunavir en muestras plasmticas
mediante cromatografa lquida acoplada a espectrome-
tra de masas. El mtodo const de una primera parte de
tratamiento previo de la muestra plasmtica mediante pre-
cipitacin de protenas, una metodologa fcil de llevar a
cabo y poco costosa que mostr tener una elevada abili-
dad y reproducibilidad. La adicin de un tampn formado
por acetato amnico 3 mM/cido frmico 0,1 M (60:40) a
la fase mvil favoreci la produccin de formas inicas de
los analitos (M + H+ ) y en menor proporcin (M + NH4+ ). Los
fragmentos hijos obtenidos fueron detectados en el espec-
trmetro de masas mediante ionizacin en electrospray en
modo positivo (ESI + ) ya que se obtenan mejores resultados
que mediante electrospray en modo negativo (ESI-).
Respecto a la validacin, el mtodo fue lineal en todo
el rango de concentracin de la curva de calibracin (0,1-
10 g/mL). Este rango de concentraciones se obtuvo de los
valores ms altos encontrados de darunavir en estudios cl-
nicos y farmacocinticos.
La precisin y exactitud intra-da e inter-da resultaron
satisfactorios. La ausencia de picos en el cromatograma
mostr que no haba interferencias con analitos de la propia
matriz biolgica ni con otros frmacos y por lo tanto ree-
jaba que el mtodo tena una buena especicidad. Por otro
lado los ensayos de precisin y exactitud tambin demostra-
ron que las condiciones de anlisis son las adecuadas para
una correcta ionizacin de la molcula. El mtodo adems
presentaba una buena sensibilidad basndose en un LD de
0,05 g/mL y un LQ de 0,15 g/mL.
En conclusin, el mtodo ensayado rene todos los
requisitos respecto a sensibilidad, especicidad, precisin
y exactitud, que son necesarios para poder realizar una
correcta determinacin de las concentraciones plasmti-
cas de darunavir y poder aplicarlo a su monitorizacin
 Desarrollo y validacin de un mtodo para la determinacin de darunavir en plasma mediante LC-MS/MS
farmacolgica en aquellas poblaciones especiales que lo
requieran.
Conicto de intereses
Los autores declaran no tener ningn conicto de intereses.
Agradecimientos
Nos gustara agredecer a Tibotec-Johnson&Johnson el sumi-
nistro de darunavir sustancia pura.
Referencias bibliogrcas
1. Poveda E, De Mendoza C, Martn-Carbonero L, Corral A,
Briz V, Gonzlez-Lahoz J, et al. Prevalence of darunavir
resistance mutations in HIV-1-infected patients failing other
protease inhibitors. Journal of Antimicrobial Chemotherapy.
2007;60:8858.
2. Dierynck I, De Wit M, Gustin E, Keuleers I, Vandersmissen J,
Hallenberger S, et al. Binding Kinetics of darunavir to HIV-1
protease explain the potent antiviral activity and high genetic
barrier. J Virol. 2007;81:1384551.
3. Ghosh AK, Dawson ZL, Mitsuya H. Darunavir a conceptually new
HIV-1 protease inhibitor for the treatment of drug-resistant HIV.
Bioorg Med Chem. 2007;15:757680.
4. McKeage K, Perry C, Keam S. A Review of its Use in the Mana-
gement of HIV Infection in Adults. Drugs. 2009;69:4.
5. Molt J, Valle M, Clotet B. Interacciones medicamentosas
de darunavir. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2008;26 Suppl
10:4350.
6. Bofto M, Miralles D, Hill A. Pharmacokinetics, Efcacy,
and Safety of Darunavir/Ritonavir 800/100 mg Once-Daily
inTreatment-Nave and Experienced Patients. HIV Clin Trials.
2008;9:41827.
Descargado para Anonymous User (n/a) en ClinicalKey Espanol Colombia, Ecuador & Peru Flood Relief de ClinicalKey.es por Elsevier en junio 02, 2017.
Para uso personal exclusivamente. No se permiten otros usos sin autorizacin. Copyright 2017. Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
133
7. Curran A, Ribera Pascuet E. Darunavir as rst-line therapy.
The TITAN study. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2008;26 Suppl
10:1422.
8. Clotet B. Posicionamiento de darunavir en la terapia antirre-
troviral. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2008;26 Suppl 10:
612.
9. Antela Lpez A. Seguridad y tolerabilidad de darunavir. Enferm
Infecc Microbiol Clin. 2008;26 Suppl 10:326.
10. Arribas JR, Horban A, Gerstoft J, Ftkenheuer G, Nelson Mark,
Clumeck N, et al. The MONET trial: darunavir/ritonavir with or
without nucleoside analogues, for patients with HIV RNA below
50 copies/ml. AIDS. 2010;24:10579.
11. DAvolio A, Siccardi M, Sciandra M, Baietto L, Bonora S, Tren-
tini L, et al. HPLC-MS method for simultaneous quantication
of the new HIV protease inhibitor darunavir, and 11 other anti-
retroviral agents in plasma of HIV-infected patients. Journal of
cromatography B. 2007;859:23440.
12. Ter Heine R, Alderden-Los CG, Rosing H, Hillebrand MJ, van
Gorp EC, Huitema AD, et al. Fast and simultaneous determi-
nation of darunavir and eleven other antiretroviral drugs for
therapeutic drug monitoring: method development and vali-
dation for the determination of all currently approved HIV
protease inhibitors and non-nucleoside reverse transcriptase
inhibitors in human plasma by liquid chromatography coupled
with electrospray ionization tandem mass spectrometry. Rapid
Commun Mass Spectrom. 2007;21:250514.
13. Wang PG, Wei JS, Kim G, Chang M, El-Shourbagy T.
Validation and application of a high-performance liquid
chromatography-tandem mass spectrometric method for simul-
taneous quantication of lopinavir and ritonavir in human
plasma using semi-automated 96-well liquid-liquid extraction.
J Chromatogr A. 2006;1130:3027. Epub 2006 Aug 21.
14. Guia ICH Topic Q 2B Validation of Analytical Procedures: Met-
hodology.(CPMP/ICH/281/95).
15. Proposals for the description and measurement of carry-
over effects in clinical chemistry. Pure & Appl.Chem.
1991;63:3016.