8. a).

Indique el uso de 2-mercaptoetanol, quimotripsina, fluorescamina, oftaldehido, cloruro de

dansilo, cloruro de dabsilo y tripsina para la determinacin de estructuras proteicas. b). Cmo
pueden ser identificados los residuos N-terminal y C-terminal de una protena?

2-mercaptoetanol

es un compuesto qumico con la frmula HOCH2CH2SH. Es un hbrido entre el etilenglicol, HOCH2CH2OH,

y el 1,2-etanoditiol, HSCH2CH2SH. El ME o ME, como comnmente se abrevia, se emplea profusamente
en el laboratorio para reducir los puentes disulfuro y puede actuar como antioxidante biolgico, reciclando
radicales hidroxilo (entre otros) Se emplea ampliamente debido a que el grupo hidroxilo le confiere buena
solubilidad en agua, a la vez que disminuye la volatilidad. Debido a su reducida presin de vapor, su olor,
aunque desagradable, es menos molesto que el de otros tioles relacionados.

Desnaturalizacin de protenas[editar]
Algunas protenas pueden ser desnaturalizadas por el 2-mercaptoetanol por medio de su habilidad para
separar puentes disulfuro:
cysS-Scys + 2 HOCH2CH2SH 2 cysSH + HOCH2CH2S-SCH2CH2OH

Por medio de la ruptura de los puentes S-S, la estructura terciaria as como la estructura
cuaternaria de algunas protenas se pueden ver disruptas.4 Si una protena consta de varias
cadenas polipeptdicas distintas unidas mediante puentes disulfuro, la accin del 2-mercaptoetanol
separar las cadenas polipeptdicas distintas. Por ello, el 2-mercaptoetanol se emplea
profusamente para analizar el estado de oligomerizacin de las protenas.
El 2-mercaptoetanol se puede reemplazar por ditiotreitol (DTT) o el menos oloroso tris(2-
carboxietil)fosfina (TCEP) en aplicaciones biolgicas.

Desnaturalizacin de ribonucleasas[editar]
El 2-mercaptoetanol se emplea en algunos protocolos de aislamiento de RNA para
eliminar ribonucleasas liberadas durante la lisis celular. Ello se debe a que las ribonucleasas son
protenas estabilizadas mediante numerosos puentes disulfuro. La accin del 2-mercaptoetanol
desnaturaliza irreversiblemente estas molculas, lo cual previene la digestin del RNA durante el
procedimiento.5

quimotripsina
Las protenas parcialmente digeridas salen del estmago y entran en el intestino como cadenas de pptidos,
que constan de muchos aminocidos unidos juntos. La tripsina y la quimotripsina son las principales
proteasas en el intestino delgado y ambas se sintetizan y se liberan por la glndula del pncreas. La
quimotripsina corta inicialmente las cadenas de pptidos en fragmentos ms pequeos y, finalmente, reduce
los fragmentos en aminocidos individuales con la ayuda de tripsina y otras proteasas. A diferencia de la
pepsina, la quimotripsina funciona mejor en un ambiente alcalino, en particular entre los niveles de pH de 7,0
y 9,0.

La quimiotripsina rompe el lado carboxilo de los aminocidos que poseen un R aomatico, fenilalaina,
tirosina, triptfano y finalmente leucina.

fluorescamina

oftaldehido

cloruro de dansilo

cloruro de dabsilo

tripsina

La tripsina es una enzima peptidasa, que rompe los enlaces peptdicos de las protenas
mediante hidrlisis para formar pptidos de menor tamao y aminocidos. La tripsina es
producida en el pncreas y secretada en el duodeno, donde es esencial para la digestin. El
pH ptimo es 8 y la temperatura ptima es 37 C. Es una enzima especfica ya que liga al
pptido en las posiciones del carboxilo de residuos Arginina o Lisina en la cadena, ambos
aminocidos con grupos R cargados positivamente, fragmentando al pptido inicial. La tripsina
es producida por el pncreas en forma de tripsinogeno, y luego es activado en el duodeno por
la enteroquinasa intestinal a tripsina mediante corte proteoltico.
Tripsinas tiene un pH ptimo de funcionamiento de alrededor de 7.5 a 8.5 y la temperatura ptima
de funcionamiento de alrededor de 37 C.

La actividad de tripsinas no se ve afectada por el inhibidor de tosilo fenilalanil clorometil cetona,

TPCK, que desactiva la quimotripsina. Esto es importante porque, en algunas aplicaciones, como
la espectrometra de masas, la especificidad de la escisin es importante.

Tripsinas se deben almacenar a temperaturas muy bajas para evitar la autolisis, que tambin
puede ser impedida por el almacenamiento de tripsinas a pH 3 o mediante el uso de tripsina
modificada por metilacin reductiva. Cuando el pH se ajusta de nuevo a pH 8, regrese la actividad.

El mecanismo enzimtico es similar a la de otras serina proteasas. Estas enzimas contienen una
trada cataltica que consiste en histidina-57, aspartato-102, y la serina-195. Estos tres residuos
forman un rel de carga que sirve para hacer que el sitio activo serina nucleoflica. Esto se logra
mediante la modificacin del entorno electrosttico de la serina. La reaccin enzimtica que
tripsinas catalizar es termodinmicamente favorable, pero requiere energa de activacin
significativa. Adems, tripsina contiene un "agujero de oxianin" formado por la columna vertebral
amida tomos de hidrgeno de Gly-193 y Ser-195, que sirve para estabilizar la carga negativa en
desarrollo en el tomo de oxgeno del carbonilo de las amidas troceados.

El residuo aspartato situado en el bolsillo cataltico de tripsinas es responsable de la atraccin y la

estabilizacin de carga positiva de lisina y/o arginina, y es, por lo tanto, responsable de la
especificidad de la enzima. Esto significa que la tripsina escinde predominantemente protenas en
el lado carboxilo de los aminocidos lisina y arginina, excepto cuando o bien est unido a un C-
terminal de prolina., Aunque los datos de espectrometra de masas de gran escala sugieren la
escisin se produce incluso con prolina. Tripsinas se consideran endopeptidasas, es decir, la
divisin se produce dentro de la cadena polipeptdica en lugar de en los aminocidos terminales
situados en los extremos de los polipptidos

La tripsina es disponible en gran cantidad en el pncreas, y se puede purificar con bastante

facilidad. Por lo tanto, se ha usado ampliamente en diversos procesos biotecnolgicos.

En un laboratorio de cultivo de tejidos, tripsinas se utilizan para volver a suspender las clulas
adherentes a la pared de placa de cultivo celular durante el proceso de recoleccin de las clulas.
Algunos tipos de clulas tienen una tendencia a "pegarse" - o adherirse - a los lados y el fondo de
un plato cuando se cultivan in vitro. La tripsina se utiliza para escindir protenas de unin de las
clulas cultivadas para el plato, de modo que las clulas se pueden suspender en solucin fresca
y transfirieron a placas frescas.

La tripsina tambin se puede utilizar para disociar las clulas disecadas.

Tripsinas se pueden utilizar para romper la casena en la leche materna. Si se aade tripsina a
una solucin de leche en polvo, la ruptura de la casena har que la leche se convierta en
transparente. La velocidad de reaccin se puede medir mediante el uso de la cantidad de tiempo
que le toma a la leche a su vez translcido.

La tripsina se utiliza comnmente en la investigacin biolgica durante la protemica experimentos

para digerir las protenas en pptidos para el anlisis de espectrometra de masas, por ejemplo,
digestin en gel. La tripsina es particularmente adecuado para esto, ya que tiene una especificidad
muy bien definido, ya que hidroliza slo los enlaces peptdicos en los que el grupo carbonilo es
aportado ya sea por un residuo de Arg o Lys.

La tripsina tambin se puede utilizar para disolver los cogulos de sangre en su forma microbiana
y el tratamiento de la inflamacin en su forma pancretica

b). Cmo pueden ser identificados los residuos N-terminal y C-terminal de una protena

N-terminal de una protena

C-terminal de una protena