Prctico de Fisiologa Animal

Estudio de genes potencialmente involucrados en la diferenciacin femenina en peces

PCR en Tiempo Real
2016

Dra. Denise Vizziano Cantonnet, Br. Andr Lasalle, Lic. Santiago Di Landro
Laboratorio de Fisiologa de la Reproduccin y Ecologa en Peces

Descripcin de la prctica

Marco terico

La diferenciacin del sexo es un proceso bioqumico por el cual el tejido gonadal que es en su origen
bipotencial, se diferencia en un ovario o un testculo (Brennan and Capel 2004). Este proceso se da por la
accin de varios genes que se expresan en mayores niveles durante el periodo de diferenciacin molecular.
En vertebrados se han identificado genes que son propios de la va de diferenciacin femenina (FOXL2, FST,
CYP19A1,WNT4 y BMP2) y otros pertenecientes a la va de diferenciacin masculinaSOX9, NR5A1 (SF1),
NR0B1 (DAX1), DMRT1, ARX, DHH, AMH, GSDF(Brennan and Capel 2004; Yao 2005; Vizziano et al. 2007;
Jiang et al. 2016; Xie et al. 2016). Estudios realizados en nuestro laboratorio (FREP) demostraron que es
periodo de diferenciacin molecular del esturin siberiano se produce a los 3 y 4 meses, mientras que el
momento de la diferenciacin sexual se produce a los 8 meses de edad (VizzianoCantonnet et al. 2016).
Hemos identificado mediante el estudio del transcriptoma del A. baeriialgunos genes que se presentan con un
expresin mayor en hembras que en machos. De todos ellos, segn la bibliografa consultada, algunos
podran estar relacionados con la diferenciacin gonadal. Los genes elegidos fueron irx3, lhx2 y mafA.
Irx3es un factor de transcripcin, que en mamferos,tiene una expresin dimrfica durante el perodo
de diferenciacin gonadal, con altos niveles de expresin en las hembras (Jorgensen and Gao 2005). Este
gen se ha propuesto como un factor muy importante en la va de diferenciacin ovrica del ratn (Garcia-Ortiz
et al. 2009)
Lhx2forma parte de los genes que de las familias LIM, muy conservados a lo largo de la evolucin y
esenciales para el desarrollo (Hobert and Westphal 2000). Puede actuar como factor de transcripcin. En
ratones, este gen, tiene una expresin dimrfica, con niveles ms elevados en hembras durante el perodo de
diferenciacin gonadal. Si Lhx2no est presente, se sobre-regula la cascada de diferenciacin testicular. Esto
muestra que Lhx2 es esencial para regular la va de diferenciacin ovrica y mantener reprimida la va de
diferenciacin masculina, por lo menos en ratones (Deepak 2015).
MafA: algunosresultados en Drosophila indican que factores de transcripcin pertenecientes a la
familia Maf son imprescindibles para el buen desarrollo de la gnada tanto en la migracin como en la
diferenciacin de las clulas germinales primordiales (Kawashima et al. 2003; Li et al. 2003)

Objetivo

La prctica tiene como objetivo realizar el anlisis cuantitativo de la expresin de estos tres genes
durante diferentes estados del esturin siberiano. As intentaremos identificar si estos genes tienen un patrn
de expresin femenino y si pueden cumplir un papel importante para el proceso de diferenciacin. Este
estudio se realizar mediante la tcnica de qPCR.
Disearemos una reaccin de PCR en tiemporeal,en la cual se utilizar ADNc diluido 1 en 20de
gnadas (gnada indif 563, gnadas indif 564), ovarios (gnadas 166 y 174) y testculo (gnadas 142) de
A.baerii como sustrato de la reaccin.

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Protocolo experimental

Parte 1: PCR en tiempo real

La reaccin se lleva a cabo en una solucin que contiene H2O, SYBR Green, cebadores especficos
(tanto el forward como el reverse) para los genes que estemos interesados en amplificar, ademsdel ADNc
como sustrato.
El SYBRGreen, adems de contener el elemento fluorescente que se une a la hebra de ADNc,
contiene los otros elementos esenciales para que la reaccin pueda realizarse, estos son la enzima
polimerasa AmpliTaq Gold DNA Polymerase, los dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) y un buffer que
contiene otros elementos el Mg+2 y Na+, cofactores de la ADN polimerasa.
La reaccin de qPCR se produce en un termociclador que tiene la capacidad de medir la
fluorescencia que es producida durante el tiempo en que la reaccin se est llevando a cabo.
Cada una de las reacciones se realiza en un pocillo que pertenece a una pequea caja especialmente
diseada para qPCR. El volumen final de cada reaccin ser de 12 l (6l de SYBR Green; 4,5l de H2O;
0,5l del correspondiente juego de cebadores y 1l de ADNc)
La mezcla de reaccin se construir usando varios mixes o mezclas. El mix 1 (o mix madre)
contendr los elementos comunes a todos los tubos. En la Tabla 1 se muestra la composicin de un tubo. El
mix 1 para 48pocillos se prepara sin cebadores (Tabla 1).

Tabla 1. Mix madre (sin cebadores)

Mix 1 qPCR 1 pocillo 48 pocillos

Sybr Green 6 l 288 l

H2O estril 4,5 l 216 l

Volumen total
10,5 l 504 l

Tabla 2.- Composicin de un tubo que contiene los cebadores especficos para la reaccin y el molde de
cDNA.

Mix 1 qPCR 1 pocillo

Sybr Green 6 l
H2O estril 4,5 l
Cebador Fw 0,25 l
Cebador Rv 0,25 l

Volumen total
11 l

+1 l cDNA

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Para estudiar los distintos genes blancos seleccionados (irx3, lhx2, mafA) as como el gen constitucional 18S,
se disear una caja como la mostrada en la Tabla 3.

Tabla 3. Diseo de caja para qPCR; c/u de los casilleros representa un pocillo en el cual se produce una
reaccin.
irx3 irx3 irx3 irx3 irx3 indif1 irx3 indif1 irx3 irx3 indif2
ovario1 ovario1 Testis Testis
indif 2
irx3 irx3 Blanco Blanco lhx2 lhx2 lhx2 lhx2
ovario2 ovario 2 irx3 irx3 ovario1 ovario1 Testis Testis
lhx2 lhx2 lhx2 lhx2 lhx2 lhx2 Blanco Blanco
indif1 indif1 indif2 indif2 ovario2 ovario2 lhx2 lhx2
mafA mafA mafA mafA mafA mafA mafA mafA
ovario1 ovario1 Testis Testis indif1 indif1 indif2 indif2
mafA mafA Blanco Blanco 18S 18S 18STestis 18STestis
ovario2 ovario2 mafA mafA ovario1 ovario1
18Sindif1 18S 18S 18S 18S 18S Blanco Blanco
indif1 indif2 indif2 ovario2 ovario2 18S 18S

Cada grupo preparar los mixes para 2 juegos de genes (un total de 24 pocillos).

El mix 1(comn en ambos grupos) contendr 156 l SYBR Green (6x26) + 117 l de H2O(4,5x26) (total 273
l).
El mix2 y 3 se prepararan a partir del mix 1, y la diferencia entre ellos ser los juegos de cebadores a usar. El
mix 2 contendr cebadores para amplificar el fragmento del mensajero delirx3y el mix 3 contendr los
cebadores para lhx2(grupo 1), o mix 2 con cebadores de mafA y el mix 3 concebadores para amplificar el 18S
(gen constitutivo) (grupo 2).

(deben ajustarse los volmenes utilizando un poco ms de reactivo en cada uno de los mixes debido
a que comnmente se producen errores de pipeteo)

El mix 2 (irx3/mafA dependiendo del grupo)para 13reacciones/ pocillos est compuesto de:

136,5 l Mix 1 + 3,5 l Cebador Fw+ 3,5 l Cebador Rv

El mix 3 (mafA/18S dependiendo del grupo) para 13reacciones/ pocilloss est compuesto de:

136,5 l Mix 1 + 3,5 l Cebador Fw + 3,5 l Cebador Rv

Previo a distribuir el mix se reparte 1l de ADNc (molde) de cada muestra o agua en el caso del blanco, en su
respectivo pocilloen la caja deqPCR (ya aadido).

Luego de distribuido el ADNc se reparte 11 l del correspondiente mix a cada tubo de PCR y se homogeniza
suavemente.

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Finalmente, se procede a la amplificacin del ADNc, y la medicin de la fluorescencia emitida mediante el
siguiente ciclado

Ciclado:
95 C por 3 min (primera desnaturalizacin)
95 C por 10 seg (desnaturalizacin)
60 C por 45 seg (annealing de los cebadores) El paso 2 se repite 40 veces
95 C por 15 seg

60 C por 1 min (ltima extensin)

95 C por 15 seg

El producto de cada reaccin se guarda

guar a -20 C y puede ser utilizado luego por ejemplo para analizar
resultados por electroforesis.

Parte 2: Interpretacin de los datos obtenidos de una qPCR

El objetivo de esta parte del prctico es analizar la salida

salida que se nos devuelve una vez terminada la qPCR. La
interpretacin de datos es fundamental y es la que nos permitir distinguir si la reaccin se realiz de buena
manera, si hubo contaminaciones, e incluso tener una idea primaria de que genes se expresan ms que
otros, lo que podremos establecerr de manera fehaciente luego de realizar los clculos pertinentes.
Analizaremos entonces una serie de datos obtenidos previamente en una corrida de PCR realizada en el
laboratorio para el gen cyp19a1a (aromatasa).

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Para preguntarse:
La qPCR es una tcnica cualitativa o cuantitativa?

Qu tendencia debe observarse en nuestro experimento?

Qu es el Threshold?

Los CTs?

Cmo los interpreto?

Cul es la importancia del gen constitutivo y el blanco?

Bibliografa

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Garcia-Ortiz JE, Pelosi E, Omari S, Nedorezov T, Piao Y, Karmazin J, Uda M, Cao A, Cole SW, Forabosco A.
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Kawashima T, Nakamura A, Yasuda K, Kageyama Y. 2003. Dmaf, a novel member of Maf transcription factor
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