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INVESTIGAO GENTICA DOS ABORTAMENTOS ESPONTNEOS PELO DNA

GENETIC INVESTIGATION OF SPONTANEOUS ABORTIONS BY DNA TECHNIQUES

SRGIO DANILO JUNHO PENA*; HELENA BEATRIZ BELO LISBOA MARTINS DA COSTA**;
ELEN ROSE FONTOURA CARVALHO**; ROSANE STURZENEKER***

RESUMO tenham maior probabilidade de ser cromossomicamente


Os abortamentos espontneos so fenmenos comuns, mas anormais.6
emocionalmente devastadores. Uma explicao cientfica da Em todos os estudos, a proporo de conceptos cro-
causa da perda fetal fundamental para o casal poder restaurar mossomicamente anormais estava inversamente relacio-
a sua homeostase emocional e para o mdico orientar a sua con-
duta. Mais de 50% dos abortamentos apresentam anormalidades nada com o perodo gestacional. Assim, por exemplo, no
cromossmicas, especialmente trissomias (60%), triploidia (15%) segundo trimestre de gravidez, o nmero de abortos com
e monossomia X (15%). Assim, o caritipo fetal deve ser feito, se defeito cromossmico cai para 25% a 30%. Por outro
possvel, em todos os casos de perda gestacional. Os estudos
cromossmicos convencionais dependem da cultura de clulas
lado, na maioria dos trabalhos publicados, as freqncias
fetais estar associada com falhas de crescimento in vitro e conta- dos vrios tipos de anormalidade foram mais ou menos
minao com clulas maternas. Uma alternativa vantajosa a constantes. Fritz et al.6 fizeram meta-anlise de 19.920
citogentica molecular, que estuda o caritipo fetal diretamente
casos da literatura e observaram que as trissomias (presen-
ao nvel do DNA, dispensando a cultura de tecidos e permitindo
at a anlise de espcimes fixados em formol, etanol ou includos a de um cromossomo extra) correspondiam a aproxima-
em parafina. Este artigo descreve a implantao no GENE damente 59% dos abortos anormais, a monossomia X
Ncleo de Gentica Mdica de uma metodologia prpria de (45,X) correspondia a 15% e a triploidia (trs cpias de
estudos genticos de abortamentos usando a reao em cadeia
da polimerase (PCR) e permitindo o diagnstico das principais todos os cromossomos), a 15%.
trissomias, da triploidia e da monossomia X. Neste trabalho faze-
mos uma reviso da anlise de 1.096 abortamentos estudados
por trs protocolos diferentes: citogentica convencional
QUAL A IMPORTNCIA DO DIAGNSTICO
(Protocolo 1), citogentica convencional + citogentica molecular ETIOLGICO DAS PERDAS REPRODUTIVAS?
(Protocolo 2), ou citogentica molecular isoladamente (Protocolo
3). O nosso objetivo foi comparar resultados obtidos aps a
O abortamento, apesar de comum, emocionalmen-
implantao dos estudos moleculares com os resultados anterio- te devastador e o seu impacto intensificado quando a
res. A concluso do estudo foi que o procedimento de citogen- causa no estabelecida. Isto ocorre porque, com fre-
tica molecular implantado simples, eficiente e de baixo custo e quncia, a perda fetal no apropriadamente investigada.
representa uma ferramenta de grande utilidade clnica.
Embora esteja provado que mais de 50% dos abortamen-
Palavras-chave: Abortamento; Perda fetal; Cromossomo- tos tm caritipos anormais e os geneticistas h anos enfa-
patias; Citogentica; DNA tizem a necessidade dos estudos citogenticos das perdas
reprodutivas, a verdade que eles no se tornaram parte
Abortamentos espontneos so eventos comuns e integral da rotina obsttrica, exceto para alguns especialis-
ocorrem em 10% a 15% das gravidezes reconhecidas cli- tas com orientao mais acadmica. Uma das razes o
nicamente.1 Sabemos hoje que mais freqentemente a sua fato de que, no passado, freqentemente havia insucesso
causa gentica, e mais especificamente citogentica.2 da cultura clssica de tecidos fetais a longo termo, ento
Bou e Bou3, em Paris, encontraram anomalias cromos- essencial para o estudo cromossmico. Hoje, isto no
smicas em 61% de 1.500 abortamentos de primeiro tri- mais verdade, graas aos avanos significativos em cultu-
mestre estudados. Da mesma maneira, Hassold et al.4, no
Hava, encontraram cromossomopatias em 50,5% de * Mdico, Doutor em Gentica Humana, pesquisador do GENE - Ncleo de Gentica Mdica de
Minas Gerais e do Departamento de Bioqumica e Imunologia, Universidade Federal de Minas
2.919 fetos abortados com menos de 500g. Estes dois Gerais.
estudos basearam-se em culturas a longo termo de tecidos ** Biloga do GENE - Ncleo de Gentica Mdica de Minas Gerais
*** Biloga, Doutora em Bioqumica
fetais, mtodo sabidamente complexo e sujeito a falhas de
GENE - Ncleo de Gentica Mdica de Minas Gerais
cultura em mais de 30% dos casos. Utilizando o exame
Endereo para correspondncia:
cromossmico com cultura a curto termo de vilosidades Prof. Dr. Srgio Pena
GENE - Ncleo de Gentica Mdica
corinicas, Ohno et al5. obtiveram um caritipo em Av. Afonso Pena 3111, 9 andar
92,3% dos abortos e observaram uma taxa de anormali- Belo Horizonte, MG
CEP: 30 130-909
dades cromossmicas mais alta ainda: 69,4%. possvel Tel.: (31) 3284-8000
Fax: (31) 3227-3792
que os espcimes que no crescem em culturas in vitro E-mail: spena@gene.com.br

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ras de curto prazo e em estudos diretos do DNA extrado diviso celular, o que freqentemente s possvel com a
dos tecidos fetais, mesmo contaminados, macerados ou cultura dos tecidos fetais a longo termo no laboratrio. As
fixados, garantindo um resultado conclusivo e til na falhas de cultura so comuns porque os tecidos de aborta-
maioria dos casos, como demonstrado neste estudo. mentos e natimortos esto freqentemente macerados,
A maior indicao para o estudo cromossmico dos contaminados com bactrias e/ou fungos, ou foram fixa-
tecidos fetais o abortamento de repetio.7 Nos Estados dos em formol ou lcool. Neste estudo, verificamos se
Unidos, 4% das mulheres casadas tiveram duas perdas possvel usar testes baseados na reao em cadeia da poli-
fetais e 3% tiveram trs ou mais perdas.8 Nestes casos de merase (PCR) para conseguir fazer o diagnstico rpido
recorrncia torna-se essencial estabelecer se o abortamento de doenas cromossmicas humanas em DNA extrado
est ou no relacionado com uma cromossomopatia. Na de tecidos de fetos abortados e natimortos, sem necessida-
presena de cromossomopatia, a causa da perda fetal pode de de cultura de tecidos.
ser considerada como estabelecida e no h necessidade de Em 1991, Mutter e Pomponio 13 iniciaram a citogen-
fazer nenhuma investigao da me. Por outro lado, na tica molecular pela PCR ao desenhar um nico par de ini-
ausncia de uma alterao do caritipo fetal, h indicao ciadores que promovia a amplificao do gene ZFY no
para investigaes maternas, que devem incluir ultra-sono- cromossomo Y e o seu homlogo ZFX no cromossomo X,
grafia plvica, estudos genticos de trombofilia e anticor- mas gerando produtos de tamanhos diferentes para cada
pos lpicos anticoagulante e anti-cardiolipina.9 Estudos um deles. Eles demonstraram que, alm do diagnstico
hormonais so controversos.1 do sexo, estas condies competitivas permitiam o diag-
Entretanto, mesmo no primeiro abortamento, acredi- nstico molecular de indivduos com caritipo alterado
tamos que h justificativas para o estudo cromossmico 47, XXY (sndrome de Klinefelter) ou 47, XYY (dissomia
fetal. O processo de luto aps uma perda fetal associado Y), pois as quantidades relativas de produtos de amplifi-
com ansiedade e depresso.10 Nos casos em que a perda cao de ZFX e ZFY tinham razes 2:1 e 1:2, respectiva-
fica inexplicada, freqentemente a paciente apresenta sen- mente, em contraste com 1:1 em controles normais (46,
timentos de culpa e questiona se a perda fetal ocorreu XY). Obviamente, este enfoque experimental to atraen-
porque ela fez ou deixou de fazer algo. Friedman e Gath11 te, baseado na homologia peculiar apresentada entre os
entrevistaram 67 mulheres quatro semanas aps aborta- cromossomos sexuais X e Y, no era aplicvel aos cromos-
mento espontneo e observaram a presena de depresso somos autossmicos. Entretanto, Mansfield14 observou
psiquiatricamente significativa em 32 delas (48%). que em indivduos heterozigotos para microssatlites poli-
Freqentemente as seqelas psicolgicas tambm tm mrficos (ver abaixo) um alelo podia servir como contro-
impacto negativo nas relaes familiares, incluindo mari- le interno competitivo para o outro.
dos e outros filhos.12 O esclarecimento ao casal de que o Os microssatlites so blocos de unidades repetitivas
de DNA, contendo de uma a seis bases nucleotdicas, que
abortamento foi causado por defeito cromossmico espo-
so abundantes e altamente polimrficos em genomas
rdico (acidente gentico) e que a continuao da gravi-
eucariontes devido variao no nmero de unidades
dez seria impossvel ou culminaria no nascimento de uma
repetitivas entre alelos.15 Os locos de microssatlites so
criana anormal contribui significativamente para que
informativos para o diagnstico de trissomias quando
haja aceitao da perda fetal. Devido a estas razes, acre-
mostram a presena de mais de um alelo. Os indivduos
ditamos que todos os abortamentos devam ser submeti-
trissmicos apresentaro, em locos de microssatlites
dos a exames citogenticos, assim permitindo o aconse-
informativos, trs alelos de intensidade aproximadamente
lhamento gentico dos casais antes de uma nova gravidez.
igual ou dois alelos com dosagem relativa na proporo
2:1 (Figura 1). No primeiro caso, o diagnstico bvio e
DESENVOLVIMENTO DAS TCNICAS DE fcil, enquanto que, no segundo caso, quantitativo e
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depende de tcnicas estatsticas.
ESPONTNEOS PELO ESTUDO DIRETO DO DNA
Vrios grupos de pesquisadores tm usado a amplifi-
Pelo exposto acima fica claro que, sempre que poss- cao pela PCR de microssatlites do cromossomo 21
vel, todas as perdas reprodutivas devem ser investigadas para o diagnstico da sndrome de Down14, 16-19, especial-
citogeneticamente. Infelizmente, quando feitas com a mente para o diagnstico pr-natal em DNA extrado de
citogentica clssica convencional, estas investigaes so clulas fetais do lquido amnitico ou de vilos corinicos.
relativamente dispendiosas, demoradas e tm um percen- No GENE Ncleo de Gentica Mdica ns desenvol-
tual significativo de casos sem resultado. Isto acontece vemos para o exame pr-natal em lquido amnitico obti-
porque a citogentica convencional depende da disponi- do por amniocentese um protocolo diagnstico para a
bilidade de clulas humanas vivas e em processo ativo de trissomia 21 que permite a amplificao simultnea de

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trs microssatlites diferentes, D21S11, D21S1270 e mos acima, entre os abortamentos com cromossomopa-
IFNAR, conjuntamente com AMEL.20 J temos seis anos tias h trs classes principais de defeitos: trissomias
de experincia com este procedimento, que permite um (Figura 1), monossomia X (Figura 2) e triploidia (Figura
diagnstico rpido (24-48 horas) e, assim, quando nor- 3). A nossa estratgia era fazer o diagnstico molecular
mal, alivia a ansiedade dos pais, j que os resultados da das trissomias mais freqentes, ou seja, daquelas acome-
citogentica convencional, dependentes da cultura de tendo os cromossomos 13, 16, 18, 21 e 22 (que conjun-
clulas, demoram de 8 a 14 dias. tamente perfazem aproximadamente 70% de todas as
Da mesma maneira que para o diagnstico da trisso- trissomias em abortamentos Figura 1). O diagnstico
mia21, a citogentica molecular pode ser usada para o das triploidias seria feito usando a mesma ferramenta
diagnstico pr-natal das aneuploidias sexuais19 e das diagnstica, ou seja, citogentica molecular por PCR
trissomias 13 e 18.17,18 J emergiram na Europa propos- com quantificao fluorescente (Figura 3). No se cons-
tas de utilizao da citogentica molecular pela PCR tatando a presena de triploidia ou das trissomias testa-
como ferramenta nica no diagnstico pr-natal de tris- das, todos os fetos do sexo feminino seriam estudados
somias. Mann et al.21, em Londres, publicaram em 2001 pelo procedimento de triagem da monossomia X, usan-
a experincia com o diagnstico pr-natal das trisso- do a reao multiplex de cinco microssatlites do brao
mias21, 18 e 13 exclusivamente pela PCR em 1.314 casos. longo do cromossomo X (Figura 2B). Nos casos com
Nesta srie no houve nenhum resultado falso-positivo evidncia molecular de monossomia X, seria, ento,
nem falso-negativo.21 Esta tambm a experincia feita a confirmao do caritipo 45,X com a PCR espe-
do GENE. cfica para metilao (Figura 2C).
No presente trabalho fazemos uma reviso de 1.096
DIAGNSTICO DA SNDROME DE TURNER (45,X) abortamentos estudados no GENE no perodo 1990-
PELO ESTUDO DIRETO DO DNA 2002. Estes casos foram estudados por trs protocolos
O grupo de pesquisa do Laboratrio de Gentica diferentes: citogentica convencional, citogentica con-
vencional + citogentica molecular, ou citogentica
Bioqumica na UFMG desenvolveu procedimento PCR
molecular isoladamente. A concluso do estudo foi que
multiplex que permite a amplificao simultnea de
o protocolo de citogentica molecular desenvolvido
cinco microssatlites de dinucleotdeos localizados em
simples, eficiente e de baixo custo e que a sua implanta-
uma regio do brao longo do cromossomo X (Figura o representou um progresso considervel na investiga-
2B). Os estudos populacionais demonstraram que a o gentica dos abortamentos.
diversidade haplotpica em populaes do Brasil, da
frica e da Europa era maior que 99%.22 Assim, espera- MATERIAIS E MTODOS
mos ver homozigosidade dos cinco locos em menos de
1% das mulheres normais. Por outro lado, esperamos Materiais estudados
ver a presena de um nico pico em cada um dos cinco No perodo entre janeiro de 1990 e o final de junho
locos em todas as pacientes no-mosaicas com o cariti- de 2002, foram estudados no GENE Ncleo de
po 45, X (Figura 2B), j que h perda de heterozigosida- Gentica Mdica 1.096 abortamentos em que a idade
de por ausncia de um cromossomo X. Assim, comea- gestacional era conhecida, incluindo 1.008 perdas de pri-
mos a usar estes microssatlites para fazer a triagem de meiro trimestre e 88 perdas de segundo trimestre. Estes
fetos para a sndrome de Turner.23 Para confirmao casos foram encaminhados com finalidades diagnsticas,
de praticamente todo o territrio brasileiro. Trata-se de
deste teste baseado em microssatlites, empregamos o
uma amostra populacional essencialmente de classe mdia
procedimento de PCR especfica para metilao (Figura ou classe mdia alta.
2C), usando a metodologia descrita em detalhe previa-
mente para diagnstico da sndrome do X-frgil.24,25 Citogentica convencional: cultura a curto termo

Todo o trabalho realizado assepticamente em uma


Proposta do presente estudo
capela de fluxo laminar. O material de curetagem colo-
Este estudo descreve a implantao no GENE cado em uma placa de Petri estril e examinado no
Ncleo de Gentica Mdica de protocolo de estudo microscpio invertido. As vilosidades corinicas, se pre-
gentico de abortamentos e outras perdas reprodutivas sentes, so cuidadosamente dissecadas. Uma pequena
pela citogentica molecular pela PCR. Como mostra- parte da amostra ento congelada para possvel utiliza-

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Figura 1 - Citogentica molecular por PCR usando quantificao fluo- Figura 2 - Diagnstico da monossomia X (45,X) por trs tcnicas dife-
rescente de microssatlites polimrficos (QF-PCR). Foram utilizados rentes usadas neste trabalho: a citogentica convencional (A), a perda de
em multiplex o loco da amelogenina nos cromossomos X e Y e micros- heterozigosidade diagnosticada por microssatlites do cromossomo X
satlites polimrficos dos cromossomos 16, 13, 21, 22 e 18. De cima (B) e a anlise de metilao do cromossomo X (C). Em mulheres nor-
para baixo vemos os traados obtidos com um feto cromossomicamen- mais, observamos um fragmento de 142 pb, que corresponde ao cro-
te normal (46,XY), um feto feminino com trissomia 18 (as setas mos- mossomo X ativo (no-metilado) e tambm um produto de 84 pb que
tram o padro de trs alelos) e um feto masculino com trissomia 16 (as corresponde ao cromossomo X inativado. Como um controle interno
setas mostram dois alelos em relao de rea 1:2). indispensvel, ns usamos iniciadores especficos para a verso materna
metilada da ilha CpG do gene SNRPN no cromossomo 15 humano.
Como na sndrome de Turner (igual ao caso de homens) h apenas um
cromossomo X ativo (no-metilado), h no resultado um padro mole-
cular tipicamente masculino, ou seja, ausncia do produto de 142 pb,
com a presena apenas da banda de 84 pb.

o em citogentica molecular. Para cultura de curto


termo, os vilos so transferidos para uma nova placa de
cultura contendo 5ml de meio de cultura Amniomax
(Invitrogen) e incubadas a 37C na presena de 5% de
CO2 durante a noite. No dia seguinte, pela manh, so
adicionados 700 mg de colcemid e a placa incubada a
37C por 45 min. Aps centrifugao, as vilosidades so
tratadas seqencialmente com soluo hipotnica (10 ml
de citrato de sdio 1%) e fixador [2 ml de cido acti-
co/metanol 1/3 (v/v)]. Aps 6 lavagens com fixador, o
material pingado em lminas resfriadas a 4C de acordo
com procedimento citogentico padro. As lminas so
colocadas em placa aquecida a 60C at o dia seguinte,
quando ento iniciado o bandeamento GTG, usando
tripsina e o mtodo de colorao de Giemsa de acordo
com procedimento citogentico padro
Citogentica convencional: cultura a longo termo
Se vilosidades no so visualizadas no material fetal cas so mantidas em incubadora a 37C na presena de
encaminhado ao laboratrio, ou se no forem obtidas 5% CO2 at que fibroblastos migrem dos explantes para
metfases com a cultura a curto termo descrita acima, ou a superfcie da placa. Quando h suficientes fibroblastos
se for uma perda fetal mais tardia e tecidos do prprio crescendo, a placa processada para citogentica usando
feto (pele, fascia lata, msculo, etc.) tiverem sido encami- procedimentos rotineiros de preparao cromossmica in
nhados, feita a cultura a longo termo. Tecidos fetais so situ, seguido de bandeamento GTG por tripsina e giem-
identificados, cuidadosamente separados de tecidos sa. Caso no haja crescimento dos explantes aps 3-4
maternos, e cortados em pequenos fragmentos de aproxi- semanas, feita a extrao de DNA dos mesmos para a
madamente 1 mm3 (explantes), que so colocados em realizao dos testes de citogentica molecular.
uma placa de cultura com uma gota de meio de cultura
cada um, para mant-los midos. Depois dos explantes Diagnstico molecular das trissomias fetais
estarem aderidos placa de cultura, so adicionados cui- Para a realizao dos testes de citogentica molecular
dadosamente 2ml de meio Amniomax sobre eles, e as pla- pela PCR, o DNA extrado das clulas fetais. Contanto

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Figura 3 - (A) Caritipo fetal masculino mostrando a presena de 69 usados na PCR so marcados com o fluorocromo Cy5 e
cromossomos (triploidia). (B) Diagnstico molecular do mesmo feto os produtos do sistema multiplex so resolvidos por ele-
mostrando trissomia dos cromossomos 16, 13, 22, 21 e 18 e um com-
plemento sexual XXY. Observe padres de trs picos nos cromossomos troforese num densitmetro a laser computadorizado
16, 22 e 21 e padres de dois picos com diferenas quantitativas nos (Seqenciador Automtico ALF Express, Amersham-
cromossomos 13 e 18, alm do par XY. Pharmacia Biotech, Uppsala, Sucia). Adicionalmente, o
GENE possui vrios marcadores em reserva para casos em
que algum microssatlite no seja informativo e tambm
para confirmao diagnstica, se necessrio (Tabela 1).
Diagnstico do sexo fetal e de aneuploidias do cro-
mossomo X

Tabela 1 - Locos de microssatlite usados na citogentica molecular


pela Reao em Cadeia da Polimerase

Multiplex C1
Cromossomos X e Y Amelogenina
Cromossomo 13 D13S308
Cromossomo 16 D16S2622
Cromossomo 18 D18S51
Cromossomo 21 D21S1446
Cromossomo 22 D22S685
Multiplex LA
Cromossomos X e Y Amelogenina
Cromossomo 21 D21S11, D21S1270, D21S1280
Locos reserva
Cromossomo 13 D13S258, D13S317, D13S631
Cromossomo 16 D16S535, D16S685
Cromossomo 18 D18S57, D18S535, D18S1270
Cromossomo 21 D21S1245, IFNAR, PENTA D
Cromossomo 22 D22S264, D22S941, D22S944

Ns temos usado os iniciadores desenhados por


que o DNA no esteja demasiadamente degradado, esta Sullivan et al.28 para diagnosticar o sexo fetal de aborta-
extrao pode ser feita em tecidos frescos, secos, congela- mentos. Pela incorporao do fluorforo Cy5 durante a
dos, macerados, contaminados com bactrias ou fungos, PCR podemos usar o seqenciador automtico para
fixados em formol ou etanol ou mesmo includos em quantificar os produtos de amplificao do X e do Y e
parafina. Utilizando pina e tesoura esterilizadas, sepa- verificar o sexo fetal, alm de fazer o diagnstico molecu-
ram-se os tecidos fetais (vilosidades corinicas, pele ou lar da sndrome de Klinefelter (47, XXY) ou da dissomia
sangue fetal, restos placentrios). Se o material fetal tiver Y (47, XYY).
vindo sem conservante, ou em lcool absoluto, so feitos
Diagnstico molecular da monossomia X (sndrome
ento o lisado e a precipitao do DNA exatamente como de Turner)
descrito em detalhe por Pena et al.26 Caso os tecidos fetais
tenham vindo fixados em formol, a incubao em protei- Quando os testes para trissomias e triplodia so nor-
nase K estendida por 72h. A extrao de DNA para mais e o sexo fetal feminino, so sempre realizados estu-
PCR de amostras includa em parafina foi feito, pelo dos moleculares adicionais para o diagnstico de uma
mtodo descrito por Raedle et al.27, que utiliza pr-incu- possvel monossomia X (45,X), uma das causas mais
comuns de abortamento. Inicialmente utilizada a reao
bao com Triton X-100. Depois de o DNA ser extrado
multiplex de cinco microssatlites do brao longo do cro-
e dosado eletroforeticamente26 feita a primeira amplifi-
mossomo X, exatamente como descrito em Pereira et al.23
cao por PCR com a mistura C1 que inclui os locos Nos casos em que um nico pico visto em cada um dos
amelogenina, D13S308, D16S2622, amelogenina, microssatlites feita ento a confirmao do caritipo
D18S51, D21S1446 e D22S685, respectivamente dos 45,X com a PCR especfica para metilao, utilizando a
cromossomos X e Y, 13, 16, 18, 21 e 22. Os iniciadores metodologia descrita por Pena e Sturzeneker.24, 25

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Definio dos protocolos clulas maternas femininas e citogeneticamente normais.


Neste trabalho fazemos uma reviso da anlise de Com base nesta observao, todos os laudos dos exames
1.096 abortamentos estudados por trs protocolos dife- com resultado 46,XX eram acompanhados de explicao
rentes que foram adotados seqencialmente. O Protocolo especfica e tambm de sugestes relativas a necessidade
1, que vigorou de 1990 a 1996, baseou-se no uso exclusi- de outros exames dos pais.
vo da citogentica convencional. O Protocolo 2, que pas-
sou a vigorar a partir de 1997, estendendo-se at o presen- Tabela 2 - Estudo gentico de abortamentos feito exclusivamente por
te, baseou-se no uso combinado da citogentica conven- citogentica convencional. Perodo: janeiro 1990 - dezembro 1996
cional e da citogentica molecular. Finalmente, o Vilos Cultura Total
Protocolo 3, que era constitudo pela citogentica mole- Total de casos 216 284 500 100,0%
cular isoladamente, passou a ser usado a partir de 1999. Falha de cultura 0 142 142 28,4%
Sem resultado 0 142 142 28,4%
Anlise estatstica Caritipo normal 95 129 224 224/358=62,6%
46, XY 48 15 63
Toda a anlise estatstica foi realizada no VassarStats 46, XX 47 114 161
Web Site for Statistical Computation (http://faculty.vas- Caritipo anormal 121 13 134 121/216=56,0%a 134/358=37,4%
sar.edu/lowry/VassarStats.html). Foi usado o teste exato Trissomia 83 7 90 68,6%a
Trissomia 13 10 0 10
de Fisher e o valor de P considerado significativo foi
Trissomia 16 25 4 29
menor que 0,05. Trissomia 18 3 1 4
Trissomia 21 14 0 14
Trissomia 22 6 1 7
RESULTADOS
47, XXY 2 0 2 (60) 49,6%
Outras trissomiasb 23 1 24 19,0%c
Protocolo 1 45, X 12 4 16 9,9%
Triploidia 21 1 22 17,3%
O Protocolo 1 vigorou de 1990 a 1996 e efetivamen- Tetraploidia 1 1 2 0,8%
te representa a era pr-molecular. Neste perodo foram Outros 4 0 4 3,3%
estudados 500 casos de abortamento por cultura de curto a
Estas percentagens referem-se exclusivamente aos resultados em vilosidades corinicas
termo de vilosidades corinicas e/ou cultura a longo (vilos)
b
Inclui trissomias duplas
termo de explantes de outros tecidos fetais, seguidos, c
Em negrito e itlico esto as anormalidades cromossmicas no detectveis pelo protocolo
molecular
quando vivel, de processamento para citogentica con-
vencional. Quando a cultura de curto termo de vilosida- Focalizando a nossa ateno somente nos resultados
des corinicas no produzia metfases, era ento feita a obtidos de vilosidades corinicas, que apresentam menos
cultura a longo termo dos tecidos fetais disponveis, aps vieses potenciais, podemos constatar a presena de anor-
cuidadosa dissecao. Os resultados obtidos com este malidades cromossmicas em 56,0% dos abortamentos, o
protocolo esto mostrados em detalhe na Tabela 2. que completamente concordante com a literatura. Entre
Como j esperado pelas estatsticas internacionais, no os conceptos cromossomicamente anormais encontramos
foram obtidos resultados em 28,4% dos casos (142 exa- 68,6% trissmicos, 9,9% com caritipo 45,X e
17,3% triplides.
mes). Nos exames que permitiram um resultado, obser-
vamos 63 conceptos masculinos cromossomicamente Protocolo 2
normais (28,1%) e 161 conceptos femininos cromosso- O Protocolo 2, que inclui os estudos de citogentica
micamente normais (71,2%). Esta diferena altamente molecular pela PCR, passou a vigorar a partir de 1997 e
significativa pelo teste exato de Fisher (Z = 4,7; P = foi usado no estudo de 298 perdas reprodutivas. Houve
0,000002). A razo para esta diferena fica clara quando falhas de cultura em 94 casos (31,5%), conforme espera-
separamos os resultados das culturas a curto termo de do pelos dados da literatura, e este percentual, inclusive,
vilosidades corinicas (coluna Vilos na Tabela 2), com no difere significativamente dos 28,4% com o Protocolo
uma razo feminino/masculino de 1,02, e das culturas a 1 (Z = 0,9; P > 0,30). Entretanto, neste protocolo todos
longo termo (coluna Cultura na Tabela 2) com uma os casos em que houve falha de cultura foram ademais
estudados pela citogentica molecular, com a conseqn-
razo feminino/masculino de 0,13. Provavelmente, nas
cia de que foi possvel obter resultados em 296 das 298
culturas a longo termo estava havendo crescimento de

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INVESTIGAO GENTICA DOS ABORTAMENTOS ESPONTNEOS PELO DNA

perdas reprodutivas (>99%), um aumento espetacular Protocolo 3


em comparao com o Protocolo 1. Com a citogenti- O Protocolo 3, que inclui apenas estudos de citogenti-
ca convencional no Protocolo 2 foram encontradas ca molecular pela PCR, passou a vigorar a partir de 1999.
anormalidades cariotpicas em 49,5% dos conceptos, De janeiro daquele ano a junho de 2002, foram estudados
em concordncia com os resultados do Protocolo 1. Por 298 abortamentos por este protocolo. Vrios destes casos
outro lado, com a citogentica molecular observamos eram de espcimes que haviam sido fixados em formol ou
anormalidades em apenas 24,5% dos casos. Entretanto, lcool, ou mesmo includos em parafina para estudos anato-
temos de considerar que a citogentica molecular tem mopatolgicos ao microscpico. Foram observados 105
foco exclusivo nos cromossomos 13, 16, 18, 21, 22, X conceptos com caritipos anormais, ou seja, uma taxa de
e Y e, alm disso, no capaz de diagnosticar casos de anormalidade cariotpica de 35,2% (Tabela 4).
tetraploidia nem translocaes balanceadas. Dos 100 Tabela 4 - Estudo gentico de abortamentos feito pelo Protocolo 3,
casos anormais detectados pela citogentica convencio- empregando a metodologia molecular (PCR - Reao em Cadeia da
Polimerase). Perodo: janeiro 1999 a junho 2002
nal, 30 no seriam passveis de deteco pelo protocolo
de citogentica molecular utilizado neste estudo (ver Total de casos 298 100,0%
em negrito e itlico na Tabela 3), porque envolviam Sem resultado 0
Caritipo normal 193 203/298 = 64,8%
anomalias infreqentes. O protocolo adotado no
Caritipo anormal 105 100,0% 105/298 = 35,2%
GENE leva em conta a relao custo/benefcio do Trissomia 46 44,2%
exame e privilegia as cromossomopatias mais comuns Trissomia 13 6
nos abortamentos. Se omitirmos estes casos, indetect- Trissomia 16 17
Trissomia 18 8
veis pela citogentica molecular, de considerao, tera-
Trissomia 21 13
mos caritipos anormais pela citogentica convencional Trissomia 22 1
em 70 de 202 conceptos, ou seja, 34,7%, que no sig- 47, XXY 1
nificantemente diferente dos 24,5% vistos com a cito- 45, X 23 22,1%

gentica molecular (Z = 1,7; P > 0,14). Alm disso, Triploidia 36 34,6%

como a citogentica molecular foi feita nos casos em


que houve falha de cultura apenas, os dois grupos no DISCUSSO
so facilmente comparveis.
Eficincia da citogentica molecular
Tabela 3 - Estudo gentico de abortamentos feito exclusivamente por
citogentica convencional com utilizao suplementar de metodologia Este foi um estudo com controles seqenciais, ou seja,
molecular (PCR - Reao em Cadeia da Polimerase). Perodo: janeiro o nosso objetivo era comparar resultados obtidos aps a
1997 - junho 2002
implantao dos estudos moleculares (Protocolos 2 e 3)
Total de casos 298 100,0% com os resultados anteriores (Protocolo 1). Dois parme-
Falha de cultura 94 31,5% tros bsicos, determinantes da sensibilidade diagnstica
Sem resultado 2 0,7% do procedimento, foram inicialmente analisados: propor-
Caritipo normal 173 173/296=58,4%
o de casos com resultado definitivo e proporo de
Convencional Molecular Total
Caritipo anormal 100/202 = 23/94 = 123 100% 123/296 =
casos com anormalidade cromossmica.
49,5% 24,5% 41,6% O Protocolo 1, baseado na citogentica tradicional
Trissomia 70 19 89 72,3%
aps cultura a curto ou longo prazo, representa o proce-
Trissomia 13 8 4 12
Trissomia 16 23 2 25
dimento clssico de estudo de abortamentos e estabeleceu
Trissomia 18 5 6 11 a nossa linha de base. A proporo de casos sem resulta-
Trissomia 21 10 4 14 do, 28,4%, foi significativa, mas dentro do esperado, j
Trissomia 22 5 1 6 descrito na literatura especializada. Na maioria dos casos
47, XXY 2 2 4 (72) 58,5%
isto se deveu a amostras inadequadas, com contaminao
Outras trissomias* 17 0 17 (17%a) 15,4%
45, X 11 8,9%
bacteriana, macerao pronunciada, ou mesmo ausncia
10 1
Triploidia 7 3 10 8,1% de tecidos fetais reconhecveis. Em parte, este problema
Tetraploidia 5 0 5 (5,0%) 4,1% relacionado com a falta de experincia dos mdicos ao
Outros 8 0 8 (8,0%) 6,5% fazer a coleta, que no haviam recebido informaes ade-
* Inclui trissomias duplas quadas, ou que no haviam seguido os procedimentos de
a
Em negrito e itlico esto as anormalidades cromossmicas no detectveis pelo protocolo
molecular
coleta recomendados. Sem dvida, essa proporo de exa-

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mes sem resultado, mesmo se esperada, era causa de frus- rigido para a sensibilidade terica de 74%, fornece taxa total
trao para os mdicos, os pais e a prpria equipe do estimada de anormalidades de 47,6%, que no estatistica-
GENE. Um outro problema com este protocolo que a mente diferente dos 52,9% observados pela citogentica
inadequao das amostras dificultava tambm a dissecao convencional (Z = 1,47; P > 0,14). Assim, conclumos que
dos conceptos, de tal maneira que nas culturas a longo prazo o protocolo de citogentica molecular est funcionando
havia o risco de crescimento de clulas maternas, como sina- bem prximo de sua expectativa terica.
lizado pelo excesso de resultados femininos normais (Tabela
2). Como a contaminao com clulas maternas sabida- QUAL DOS NOSSOS PROTOCOLOS O IDEAL PARA
mente uma causa de resultados falso-negativos, em todos os ESTUDO DE ABORTAMENTOS?
resultados de caritipo feminino normal em culturas a Em termos de sensibilidade diagnstica no h dvida
longo termo de abortamentos era includa no laudo uma que o Protocolo 2 o melhor, pois combina a alta sensibili-
observao indicando esta possibilidade. Se concentrarmos dade metodolgica da citogentica convencional, que per-
a nossa ateno somente nos casos examinados pela cultura mite o diagnstico de todas as cromossomopatias, com a
a curto prazo de vilosidades corinicas, em que a contami- robustez da citogentica molecular, garantindo um resulta-
nao materna no constitui uma fonte de erro, observamos do em virtualmente todos os espcimes. Entretanto, na pr-
anormalidades citogenticas em 56% dos casos, o que tica clnica temos de levar em conta consideraes de custo
bem concordante com a literatura j citada. e benefcio. Os exames de citogentica convencional so tec-
O Protocolo 2 incluiu a utilizao inicial da citogenti- nicamente complexos e intensivos em trabalho manual e
ca convencional, suplementada pela citogentica molecular anlise especializada ao microscpio, o que os torna muito
quando no havia resultado com a primeira (Tabela 3). Os mais dispendiosos que os exames moleculares. Para os
resultados da citogentica convencional com este protocolo pacientes, os exames moleculares isolados baseados na PCR
podem ser juntados com os de vilosidades corinicas da (Protocolo 3) custam aproximadamente 50% dos exames de
Tabela 2 para aumentar a casustica e torn-la mais confi- citogentica convencional (Protocolo 2), que incluem uma
vel. Passamos assim a ter 221 casos anormais em 418 abor- segunda etapa molecular na eventualidade de no se obter
tamentos estudados (52,9%), distribudos da seguinte um diagnstico pelo primeiro mtodo. Assim, ao decidir
maneira: 69% trissomias, 12,7% triploidias e 10% monos- qual estudo fazer, temos de primariamente levar em consi-
somia X, o que se harmoniza muito bem com a literatura. derao a situao econmica da famlia e as indicaes para
Para avaliarmos a eficincia e a sensibilidade dos estudos o exame. Em casos de abortamento de repetio, sempre
de abortamentos apenas pelo exame direto do DNA, preci- que financeiramente possvel, deve ser empregado o
samos ento comparar os resultados da citogentica conven- Protocolo 2, pois imperativo trabalhar com sensibilidade
cional conjuntamente das Tabelas 2 e 3 com os obtidos pelo diagnstica elevada para maximizar a probabilidade de obter
Protocolo 3 (Tabela 4), que faz uso exclusivo de metodolo- resultado anormal conclusivo que possa orientar a conduta
gia molecular e que tem as enormes vantagens de ser mais mdica. No abortamento de repetio especialmente
rpido, ter um custo muito menor (ver discusso a seguir) e importante usar metodologia capaz de diagnosticar rearran-
de permitir resultado em virtualmente 100% dos casos, jos cromossmicos no-balanceados, que poderiam revelar a
mesmo naqueles em que os tecidos fetais foram fixados em presena de translocao balanceada em um dos pais e assim
formol, lcool ou includos em parafina. A principal limita- elucidar a causa das perdas repetidas. Por outro lado, em
o da sensibilidade diagnstica deste protocolo o fato de casos de primeiro abortamento, o Protocolo 3 o mtodo
que metodologicamente s vivel o diagnstico das anor- de escolha quando uma economia financeira for importan-
malidades cromossmicas mais comuns. Ns desenvolve- te. Outros elementos a serem levados em conta na escolha
mos tcnicas moleculares para o diagnstico de todas as tri- do exame so as condies de coleta dos tecidos fetais e a
ploidias, da monossomia X e das trissomias dos autossomos facilidade e rapidez do transporte deste material ao labora-
13, 16, 18, 21 e 22 e dos cromossomos sexuais X e Y. Assim, trio. Para citogentica molecular os tecidos tm de ser cole-
entre os 221 casos anormais observados com a citogentica tados de maneira rigorosamente estril e encaminhados com
convencional (Tabelas 2 e 3), 58 (26,2%) so trissomias de urgncia ao laboratrio sem nenhum conservante, para
outros autossomos, tetraploidias e arranjos estruturais, ou garantir a viabilidade dos tecidos. Por outro lado, para utili-
seja, apresentam anomalias no detectveis pelo protocolo zao exclusiva das tcnicas moleculares, a esterilidade no
molecular em discusso (Protocolo 3). Isto estabelece um to fundamental e perfeitamente aceitvel a fixao dos
mximo terico de sensibilidade ao redor de 74% para o tecidos fetais em etanol, o que elimina a urgncia e permite
protocolo molecular implantado no GENE. Efetivamente o envio do material pelo correio, mesmo em localidades nas
observamos 35,2% de anormalidades (Tabela 4) que, se cor- quais o servio SEDEX no est disponvel.

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Qualquer que seja o protocolo usado, o nosso estudo REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS


demonstra claramente que a metodologia molecular desen- 1- Simpson JL. Fetal wastage. In: Gabbe SG, Niebyl Jr, Simpson
volvida pelo GENE, e j implantada em sua rotina diagns- JL, editors. Gabbe obstetrics: normal and problem pregnan-
tica, representa ferramenta de extraordinria utilidade clni- cies. 4th. ed. Edinburgh: Churchill Livingstone; 2002.
ca, que fez muito para tornar a investigao gentica de p.729-49.
abortamentos um exame perfeitamente adaptvel rotina 2- Pena SDJ, Martins-da-Costa HBBL, Tiritilli SF. Investigao
clnica do obstetra moderno, independente de sua localiza- gentica das perdas fetais. In: Isfer EV, Sanches RC, Saito M
editors. Medicina fetal. So Paulo: Revinter; 1996. p. 14-21.
o geogrfica.
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moment de la conception. Biomedicine 1973; 18:372-7.
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emotional homeostasis and for the physicians involved to 6- Fritz B, Hallermann C, Olert J et al. Cytogenetic analyses of
plan their conduct. More than 50% of miscarriages have culture failures by comparative genomic hybridisation
chromosomal abnormalities, especially trisomies (60%), tri- CGH;-Re-evaluation of chromosome aberration rates in
ploidy (15%) and monosomy X (15%). Thus, a fetal kar- early spontaneous abortions. Eur J Hum Genet 2001; 9:539-
47.
yotype should be obtained in all abortions, if possible.
7- Wolf GC, Horger EO 3rd. Indications for examination of
Conventional chromosome studies depend on fetal cell cul- spontaneous abortion specimens: a reassessment. Am J
tures and are thus associated with growth failures in vitro Obstet Gynecol 1995; 73:1364-8.
and contamination with maternal cells. An advantageous 8- U.S. Department of Health and Human Services
alternative to conventional methods is molecular cytogene- Reproductive impairments among married couples. In: U.S.
tics, which is based on studying the fetal karyotype directly Vital and Health Statistics Series 23, No. 11. Hyattsville,
at the DNA level. This has the advantage of dispensing with MD, National Center for Health Statistics, 1982.
tissue culture and allows analysis even of specimens fixed in 9- American College of Obstetricians and Gynecologists.
Recommendations for Management of Recurrent
ethanol or formaldehyde or included in paraffin. We wish
Miscarriage. 2001. http://www.acog.org/from_home/publi-
to describe the development at GENE Ncleo de cations/press_releases/nr02-01-01-1.cfm
Gentica Mdica of a methodology for the molecular 10- Neugebauer R, Kline J, Shrout P et al. Major depressive
cytogenetic study of miscarriages using the polymerase disorder in the 6 months after miscarriage. J Am Med Assn
chain reaction (PCR), permitting the diagnosis of the most 1997; 277:383-8.
common trisomies, of triploidy and of monosomy X. In 11- Friedman T, Gath D. The psychiatric consequences of spon-
this article we review the results of 1,096 abortion speci- taneous abortion. Br J Psychiatry 1989; 155:810-3.
mens studies by one of three protocols: conventional cyto- 12- Frost M, Condon JT. The psychological sequelae of miscar-
riage: a critical review of the literature. Aust N Z J Psychiatry
genetics (Protocol 1), conventional cytogenetics + molecu-
1996; 30:54-62.
lar cytogenetics (Protocol 2) and molecular cytogenetics 13- Mutter GL, Pomponio RJ. Molecular diagnosis of sex chro-
alone (Protocol 3). Our objective was to compare data mosome aneuploidy using quantitative PCR Nucleic Acids
obtained with molecular cytogenetics with previous results. Res 1991; 19:4203-7.
The conclusion was that the protocols developed with the 14- Mansfield ES. Diagnosis of Down syndrome and other aneu-
use of molecular techniques are simple, efficient and inex- ploidies using quantitative polymerase chain reaction and
pensive and represent a tool of great clinical usefulness small tandem repeat polymorphisms Hum Mol Genet 1993;
2:43-50.
Keywords: Abortions; Miscarriages; Chromosomal
15- Pena, SDJ, Jeffreys, AJ. Breve introduo s impresses digi-
tais de DNA. Rev Bras Genet 1993; 15:857-79.
defects; Cytogenetics; DNA
16- Pertl B, Weitgasser U, Kopp S, Kroiser PM, Sherlock J,
Adinolfi M. Rapid detection of trisomies 21 and 18 and
sexing by quantitative fluorescent PCR Hum Genet 1996;
AGRADECIMENTOS 98:55-9.
17- Pertl B, Yau SC, Sherlock J, Davies AF, Mathew CG,
Os autores desejam agradecer a todos os outros integrantes Adinolfi M. Rapid molecular method for prenatal detection
da equipe tcnica do GENE. Agradecem tambm a Betnia of Down's syndrome. Lancet 1994; 343:1197-8.
Maria Andrade Pena pela reviso do manuscrito, teis 18- Toth T, Findlay I, Papp C, Toth-Pal E, Marton T, Nagy B,
sugestes e importantes discusses. Quirke P, Papp Z. Prenatal detection of trisomy 21 and 18

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