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LOT-2042

Processos Bioquímicos

Separação/ Purificação de

Produtos Biotecnológicos

Profa. Dra. Rita de Cássia L.B. Rodrigues

Departamento de Biotecnologia LOT

E-mail: rita@debiq.eel.usp.br ritaclb_rodrigues@hotmail.com

Fone: 3159-5027

Conceitos: Abordagem

Conceitos: Abordagem  Introdução às técnicas de separação de bioprodutos.  Rompimento celular  Separação

Introdução às técnicas de separação de bioprodutos.

Rompimento celular

Separação de proteínas

Centrifugação

Processamento

downstream

Processamento downstream  A viabilidade da produção e comercialização de biomoléculas depende do custo do produto

A viabilidade da produção e comercialização de

biomoléculas depende do custo do produto

Cerca de 50 a 90% do custo da produção da biomolécula corresponde as etapas de purificação

Processamento

downstream

Processamento downstream  “Downstream processing“ → grupo de técnicas, tais como a centrifugação,

“Downstream processing“ grupo de técnicas, tais como a centrifugação,

filtração e cromatografia, usadas para

recuperar e purificar os produtos de uma conversão enzimática ou de um processo

de produção microbiológica.

PURIFICAÇÃO DE BIOMOLÉCULAS
PURIFICAÇÃO DE
BIOMOLÉCULAS
120 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7
120
100
80
60
40
20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Rendimento Total (%)

95%0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Rendimento Total (%) 90%

90%0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Rendimento Total (%) 95% 85%

85%1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Rendimento Total (%) 95% 90% 80%

80%2 3 4 5 6 7 8 9 10 Rendimento Total (%) 95% 90% 85% 70%

70%4 5 6 7 8 9 10 Rendimento Total (%) 95% 90% 85% 80% Número de

Número de etapas do processo

Influência do rendimento de cada etapa do

processo de purificação de produtos microbianos

sobre o rendimento do produto final

Cromatografia de Afinidade Eletroforese preparativa 10 9 I Cromatografia por adsorção Processos com Membranas II
Cromatografia de Afinidade Eletroforese preparativa 10 9 I Cromatografia por adsorção Processos com Membranas II
Cromatografia de Afinidade
Eletroforese preparativa
10
9
I
Cromatografia por adsorção
Processos com Membranas
II
Terapêutico
Filtração
Extração
Diagnóstico
III
Precipitação
Membranas
Industrial
BIOMOLÉCULAS
etanol
água
10
-3
10 -9
Concentração do Material Inicial
(kg/m 3 )
10 3
US$/k
g
 

Cultura Estoque Preparo Meio de Cultura Cultivo em Frascos Agitados

Pré-inóculo Esterilização Processo fermentativo

 
 

Produto Intracelular

 

Produto Extracelular

       

Processos de Separação de Células Centrifugação/ Filtração

Processos de Separação de Células Centrifugação/Filtração

UPSTREAM

DOWNSTREAM

de Células Centrifugação/Filtração UPSTREAM DOWNSTREAM Sobrenadante Células -PRODUTO- Sobrenadante Células
de Células Centrifugação/Filtração UPSTREAM DOWNSTREAM Sobrenadante Células -PRODUTO- Sobrenadante Células
Sobrenadante Células -PRODUTO- Sobrenadante Células -PRODUTO- Rompimento Sub-Produto – Sub-produto Celular ou
Sobrenadante
Células -PRODUTO-
Sobrenadante
Células
-PRODUTO-
Rompimento
Sub-Produto –
Sub-produto
Celular
ou Resíduo
ou Resíduo
Fragmentos Celulares:
Filtração
Fragmentos
Celulares
Sobrenadante
-PRODUTO-
Enriquecimento e Concentração do Produto
Extração Líquido-Líquido
Ultrafiltração
Precipitação (Sais, solventes)
Flotação
Processos de Purificação de Alta Resolução
Processos Cromatográficos

Acondicionamento

Trat. Finais Concentração:UF

Transporte

Etapa do processo

Clarificação

Rompimento

de células

Purificação

de

baixa

resolução

Purificação

de alta

resolução

tratamentos

finais

Operações Unitárias

Princípio

filtração convencional

centrifugação

filtração tangencial (membranas)

tamanho

tamanho

Tamanho de partículas

de

e

partículas

densidade de partículas

floculação

Hidrofobicidade

homegeneização

cisalhamento

ultra-som

cisalhamento

moagem em moinho de bolas

cisalhamento

de partículas

rompimento químico ou enzimático

precipitação

ultrafiltração (membranas)

Hidrólise, solubilização ou desidratação de moléculas que compõem a parede ou membrana celular

solubilidade

Massa molar e raio hidrodinâmico de moléculas

extração em sistemas de duas fases líquidas

solubilidade

cromatografia de troca iônica

cromatografia de afinidade (biológica ou química)

cromatografia de imunoafinidade

cromatografia de interação hidrofóbica

cromatografia de exclusão molecular

membranas adsortivas

cristalização

tipo e densidade de carga na superfície da biomolécula

sítios específicos da superfície de uma proteína (adsorção)

sítios específicos da superfície de uma proteína (adsorção antígeno/anticorpo)

hidrofobicidade

Massa

molar

massa molar e características para adsorção ou sítios específicos da superfície de uma proteína

Solubilidade e características de equilíbrio líqsól

liofilização

secagem

características de equilíbrio

características de

líquidosólido

equilíbrio líquidosólido

Processo de Downstream

depende do uso do produto

Processo de Downstream depende do uso do produto 1. Preparação de enzimas para suplementação animal não

1. Preparação de enzimas para

suplementação animal não são

purificadas.

2. Enzimas para uso industrial podem ser

parcialmente purificadas (ex. Amilase para industria de amido).

3. Enzimas para uso analítico (ex. Glicose

oxidase) e proteínas farmacêuticas são altamente purificadas.

Animal feed enzyme

Analytical enzyme

Therapeutic protein

Fermentation

Fermentation

Centrifugation to remove cells

Centrifugation to remove cellsFermentation Fermentation Centrifugation to remove cells Culture supernatant Culture supernatant Fermentation

to remove cells Centrifugation to remove cells Culture supernatant Culture supernatant Fermentation

Culture supernatant

Culture supernatant

Fermentation

Centrifugation to remove medium

supernatant Fermentation Centrifugation to remove medium Cell pellet Protein precipitation Cell lysis Centrifugation

Cell pellet

Fermentation Centrifugation to remove medium Cell pellet Protein precipitation Cell lysis Centrifugation Protein

Protein

precipitation

to remove medium Cell pellet Protein precipitation Cell lysis Centrifugation Protein fraction Semi-purified

Cell lysis Centrifugationto remove medium Cell pellet Protein precipitation Protein fraction Semi-purified protein Intracellular

Protein fraction

precipitation Cell lysis Centrifugation Protein fraction Semi-purified protein Intracellular fraction Protein

Semi-purified

protein

Centrifugation Protein fraction Semi-purified protein Intracellular fraction Protein fraction Liquid preparation

Intracellular fraction

fraction Semi-purified protein Intracellular fraction Protein fraction Liquid preparation to animal feed market

Protein fraction

protein Intracellular fraction Protein fraction Liquid preparation to animal feed market Protein

Liquid preparation

to animal feed

market

Protein

precipitation

1 or 2 purification

steps

3-4 purification steps

Lyophilisation

Bottling

Homogeneous

protein

To chemicals market

Sterile

bottling

steps Lyophilisation Bottling Homogeneous protein To chemicals market Sterile bottling To pharmaceuticals market

To pharmaceuticals market

Etapas do processamento

1-Separação de células

Proteínas Intracelulares

Fermentação coleta e separação das células (centrifugação ou

filtração)ruptura ( homogeneização uma suspensão de células é submetida a atravessar um orifício de diâmetro interno estreito, sob alta pressão ou agitação na presença de abrasivos, como perólas de vidro) centrifugação (para separação dos fragmentos celulares).

Proteínas extracelulares Neste caso, menor complexidade nas etapas iniciais do processamento de Downstream. Fermentação remoção das células por

centrifugação ou filtração

Etapas do processamento

Etapas do processamento 2 - Concentração do produto protéico Pequenos volumes são mais convenientes para se

2 - Concentração do produto protéico

Pequenos volumes são mais convenientes para

se trabalhar

Métodos:

Indução da precipitação do produto

utilizando, por exemplo, sais como sulfato de

amônio ou solventes como o etanol.

Ultrafiltração.

Etapas do processamento

Etapas do processamento 2 - Concentração do produto protéico Ultrafiltração É um método popular de concentração

2 - Concentração do produto protéico

Ultrafiltração

É um método popular de concentração devido aos seguintes fatores:

Altas taxas de recuperação do produto

Processo rápido

Equipamento para scale-up do processo já está disponível, e os custos são relativamente acessíveis.

Etapas do processamento

Etapas do processamento 2 - Concentração do produto protéico Ultrafiltra ç ão

2 - Concentração do produto protéico

Ultrafiltração

Etapas do processamento 2 - Concentração do produto protéico Ultrafiltra ç ão

Etapas do processamento

Etapas do processamento 3 - Purificação As técnicas de purificação são baseadas nas características

3 - Purificação

As técnicas de purificação são baseadas nas características físico-químicas das proteínas, tais como tamanho, carga, solubilidade, hidrofobicidade.

Estagios:

Design: é uma série de etapas de purificação, onde deve-se conhecer:

qual é o maior contaminante?

informações detalhadas da origem do produto e dos contaminantes,

características físicas do produto.

Scale-up: processo empregado para converter um procedimento laboratorial em industrial, mediante aspectos econômicos produto de alta qualidade e competitivo no mercado.

Etapas da cadeia de

purificação:

Etapas da cadeia de purificação:  obtenção do produto de interesse;  remoção da maior parte

obtenção do produto de interesse;

remoção da maior parte dos

contaminantes (incluindo DNA);

remoção de todos os vestígios de contaminantes e formas variáveis do

produto de interesse.

Métodos de purificação

Métodos de purificação 1-Filtração A eficiência deste método depende da natureza física das partículas do

1-Filtração

A eficiência deste método depende da natureza física das partículas do produto; Pode ser usada antes da primeira etapa de purificação, com o objetivo de concentrar a biomassa;

2-Ultrafiltração: moléculas de tamanhos diferentes

são separadas pela passagem, sob pressão, de uma dispersão sobre uma membrana com poros de tamanho definido.

Está técnica é aplicada para a separação de

macromoléculas ou de vírus.

Métodos de purificação

Métodos de purificação 1-Filtração

1-Filtração

Métodos de purificação 1-Filtração
Métodos de purificação 1-Filtração

Métodos de purificação

Métodos de purificação 3-Centrifugação - Também depende da natureza física do produto de interesse; - Permite

3-Centrifugação

- Também depende da natureza física do produto de interesse;

- Permite o isolamento eficiente de partículas

subcelulares e organelas em suspensão num líquido viscoso;

- Esta técnica utiliza um fluido viscoso, com gradiente de densidade constante. Após a

centrifugação, as diferentes frações podem ser

removidas.

Métodos de purificação

3-Centrifugação

Métodos de purificação 3-Centrifugação

Métodos de purificação

4-Precipitação

- Método simples e relativamente econômico, mas

não é muito utilizado para purificação de proteínas recombinantes em larga escala, pois faz uso de agentes que devem ser eliminados depois;

- Pode ocorrer por “salting-out”, que é a

precipitação devido ao aumento da força iônica do

meio (sulfato de amônio)

- Também pode ocorrer por mudança da constante

dielétrica, utilizando uma mistura de água + solvente orgânico (ex: polietilenoglicol, ácido

tricloroacético).

Métodos de purificação

Métodos de purificação 5-Cromatografia - É baseado na separação envolvendo no processo 2 fases: fase estacionária

5-Cromatografia

- É baseado na separação envolvendo no processo

2 fases: fase estacionária e fase móvel

Fase estacionária ideal: Alta força mecânica,

alta porosidade, alta capacidade,

biocompatibilidade e estabilidade da matriz frente a

uma variedade de solventes.

Métodos de purificação

Métodos de purificação 5-Cromatografia  Cromatografia por adsorção  Cromatografia por troca iônica 

5-Cromatografia

Cromatografia por adsorção

Cromatografia por troca iônica

Cromatografia de interações hidrofóbicas

Cromatografia de permeação em gel

Cromatografia de afinidade

Métodos de purificação

Métodos de purificação 1-Cromatografia de afinidade É baseado em interações específicas entre um ligante

1-Cromatografia de afinidade É baseado em interações específicas entre um ligante imobilizado e a proteína de interesse.

Sob condições fisiológicas ocorre a ligação da proteína

com o ligante.

Em seguida, lava-se a matriz com a finalidade de remover contaminantes.

Assim, a proteína purificada pode ser recuperada através da adição de ligantes que competem pela fase estacionária ou de mudanças nas condições

físicas, reduzindo a afinidade.

Métodos de purificação

Métodos de purificação Cromatografia de afinidade Vantagens: a alta especificidade e a combinação de concentração

Cromatografia de afinidade

Vantagens: a alta especificidade e a combinação de

concentração e purificação em um só passo.

Desvantagens: a ligação da proteína desejada nos passos adicionais pode ser muito forte, necessitando de

condições severas para a separação desse complexo.

Considerações para a produção e

purificação de proteínas

para a produção e purificação de proteínas 1. Heterogeneidade de N- e C-terminais É muito importante

1. Heterogeneidade de N- e C-terminais

É muito importante o uso de métodos que gerem proteínas com um NH 2 -terminal como o encontrado na proteína autêntica.

Quando as proteínas não são produzidas de forma correta, o produto final pode ser uma mistura de diversas variáveis da proteína em questão ou mesmo conter proteínas faltando um ou mais resíduos de

amino-terminal. Isso é chamado de heterogeneidade

de amino-terminal.

A heterogeneidade de amino- e/ou carboxi-terminal não

é desejável, uma vez que pode causar dificuldades na

purificação e caracterização das proteínas.

Considerações para a produção e

purificação de proteínas

para a produção e purificação de proteínas 2. Modificação química/ Alterações conformacionais

2. Modificação química/ Alterações conformacionais

Transcritos que contêm a sequencia inteira de códigos podem resultar em isômeros conformacionais da proteína por causa da estrutura secundária inesperada que afeta a fidelidade da tradução.

Além de alterações conformacionais, as proteínas também podem sofrer mudanças químicas durante o processo de purificação. Essas alterações podem

resultar em desnaturação parcial da proteína. Por

outro lado, a desnaturação da proteína pode ser a causa das alterações químicas.

Considerações para a produção e

purificação de proteínas

para a produção e purificação de proteínas 3. Glicosilação Muitas proteínas terapêuticas produzidas

3. Glicosilação

Muitas proteínas terapêuticas produzidas pela

técnica do DNA recombinante são

glicoproteicas.

A presença e a natureza dos oligossacarídeos nas proteínas afeta muitas características importantes, entre as quais o tempo de meia- vida, solubilidade, estabilidade e, às vezes, até

mesmo a função farmacológica.

Considerações para a produção e

purificação de proteínas

para a produção e purificação de proteínas 4. Processamento proteolítico As proteases exercem um

4. Processamento proteolítico

As proteases exercem um importante papel no

processamento, maturação, modificação ou

isolamento de proteínas recombinantes.

Se a célula morre, as proteases são soltas e lisam a célula. Portanto, é importante controlar o crescimento e as condições de cultivo para minimizar esse efeito.

Considerações para a produção e

purificação de proteínas

para a produção e purificação de proteínas 5. Formação de corpo de inclusão de proteína na

5. Formação de corpo de inclusão de proteína na célula

Na bactéria normalmente proteínas solúveis podem

formar inclusões granulares no citoplasma.

Essas inclusões provavelmente ocorrem pelo acúmulo de agregados de proteínas amorfas que se mantêm

unidas por ligações covalentes e não-covalentes.

Com a presença dessas inclusões, podem ocorrer problemas na purificação e na solubilidade da

proteína.

Bibliografia

Bibliografia BIBLIOGRAFIA Walsh, G. – Biopharmaceuticals, Biochemistry and Biotechnology, 2ª edição, Ed. Wiley,

BIBLIOGRAFIA Walsh, G. Biopharmaceuticals,

Biochemistry and Biotechnology, 2ª

edição, Ed. Wiley, 1998, p. 134-140

Para produtos intracelulares ou ligados à membrana

Para produtos intracelulares ou ligados à membrana

CRITÉRIOS PARA SELEÇÃO DA TÉCNICA DE ROMPIMENTO

- Tamanho da célula

- tolerância a tensões de cisalhamento

- necessidade de controle de temperatura

- tempo de operação

- rendimento do processo

- gasto de energia

- custo e capital de investimento

Células envolvidas só com membranas (células animais e

hibridomas - são linhagens celulares desenvolvidas para produzir um anticorpo desejado em grande quantidade)

facilmente rompidas

Células com estruturas robustas

(microrganismos)

difícil rompimento

Bactérias Gram-negativas:

paredes mais rígidas que Gram+

Leveduras e Fungos Filamentosos:

paredes celulares mais rígidas que bactérias, mas são de

maior tamanho.

Bactérias

Gram (+)

Bactérias

Gram (-)

Leveduras

10-80 nm

8 nm

8 nm

3

nm

8 nm

75 nm

Fungos Filamentosos

10-80 nm 8 nm 8 nm 3 nm 8 nm 75 nm Fungos Filamentosos parede celular
10-80 nm 8 nm 8 nm 3 nm 8 nm 75 nm Fungos Filamentosos parede celular

parede celular

espaço periplasmático membrana citoplasmática

CITOPLASMA

CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA
CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA
CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA
CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA

CITOPLASMA

CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA
CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA
CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA
CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA
CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA

CITOPLASMA

CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA
CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA
CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA
CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA

CITOPLASMA

CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA membrana externa parede celular mureína espaço

CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA CITOPLASMA membrana externa parede celular mureína espaço

membrana externa

parede celular

mureína

espaço periplasmático

membrana citoplasmática

parede celularmureína espaço periplasmático membrana citoplasmática lipídios proteínas manana glicano membrana citoplasmática

lipídios

proteínas

manana

glicano

parede celular lipídios proteínas manana glicano membrana citoplasmática glicano glicoproteína

membrana citoplasmática

glicano

glicoproteína

quitina/microfibrila

membrana citoplasmática

Estruturas estilizadas de paredes celulares de diferentes microrganismos

Condições de crescimento microbiano

podem influenciar o rompimento

- Células cultivadas em meio sintético podem ser

rompidas mais facilmente que em meios complexos

- Células com elevadas velocidades específicas de

crescimento possuem parede celular menos robusta

Tabela 2.1 Diâmetros de moléculas, organelas e células com interesse

biotecnológico

Partícula

Diâmetro

Glicose-6-fosfato desidrogenase

140 Å

Glicose oxidase

70 Å

Ovoalbumina

58 Å

Vírus

0,01 a 0,1 m

Mitocôndria

0,4 a 4,0 m

Bactérias

0,5 a 5,0 m

E.

coli

1 a 2 m

Leveduras

2 a 15 m

Fungos filamentosos

5 a 10 m

S.

cerevisiae

4 a 5 m

Células animais em geral

~10 m

Células vermelhas do sangue

5 a 8 m

Células de planta

20 a 100 m

Células de fígado humano

30 a 40 m

O tamanho relativo dos microrganismo Microrganismos por serem pequenos, abrangem uma grande variedade de tamanhos

O tamanho relativo dos microrganismo

Microrganismos por serem pequenos, abrangem uma grande variedade de tamanhos a partir do vírus de T4, vírus que são 0,02 µm a bactérias

gigantes

maiores do que 700 µm

Célula intacta

Célula intacta Rompimento total Permeabilização seletiva Biomolécula-alvo Esquema comparativo entre rompimento total

Rompimento total

Permeabilização seletiva

Célula intacta Rompimento total Permeabilização seletiva Biomolécula-alvo Esquema comparativo entre rompimento total
Célula intacta Rompimento total Permeabilização seletiva Biomolécula-alvo Esquema comparativo entre rompimento total

Biomolécula-alvo

total Permeabilização seletiva Biomolécula-alvo Esquema comparativo entre rompimento total da célula com

Esquema comparativo entre rompimento total da célula com permeabilização seletiva

Alterações Bioquímicas em Alimentos

Alterações Bioquímicas em

Alimentos

Alterações Bioquímicas em Alimentos

Tabela 1: Classificação das alterações que podem ocorrer durante manipulação, processamento, ou armazenamento.

Atributo

Alteração

Textura

Perda de solubilidade Perda da capacidade de retenção de água Endurecimento Amolecimento

Sabor

Desenvolvimento de rancidez (hidrolítica ou oxidativa) sabor cozido ou caramelo outros odores indesejados sabores desejados

Cor

Valor nutricional

Segurança

Escurecimento Branqueamento Desenvolvimento de cores desejadas (p.ex., escurecimento em produtos cozidos)

Perda, degradação ou alteração da biodisponibilidade de proteínas, lipídeos, vitaminas, minerais e outros componentes benéficos a saúde.

Geração de substâncias tóxicas Desenvolvimento de substâncias com efeito protetor a saúde Inativação de substâncias tóxicas

Alterações Bioquímicas em Alimentos

Tabela 2: Algumas das reações químicas e bioquímicas que podem levar à alteração da qualidade ou segurança dos alimentos.

Tipo de reação

Exemplos

Escurecimento não enzimático

Produtos cozidos, secos e de umidade intermediária.

Escurecimento enzimático

Frutas e vegetais cortados

Oxidação

Lipídeos (odores indesejáveis), degradação de vitaminas, descoloração de pigmentos, proteínas (perda do valor

nutricional)

Hidrólise

Lipídeos, proteínas, carboidratos, vitaminas,pigmentos.

Interação com metais

Complexação (antocianinas), perda de Mg da clorofila, catálise da oxidação.

Isomerização de lipídeos

Ciclização de lipídeos

Oxidação e polimerização de lipídeos

Desnaturação de proteínas

Interligação entre proteínas

Síntese e degradação de polissacarídeos

Alterações glicolíticas

Isomerização cis

trans, não conjugado , conjugado

Ácidos graxos monocíclicos

Formação de espuma durante a fritura

Coagulação da gema do ovo, inativação de enzimas

Perda de valor nutricional durante processamento alcalino

Pós-colheita de plantas

Pós-colheita do tecido vegetal, pós-morte do tecido animal

As reações listadas na Tabela 3 (a seguir)

causam as alterações listadas na Tabela 1

3 (a seguir) causam as alterações listadas na Tabela 1 A integração da informação contida em

A integração da informação contida em ambas as tabelas pode conduzir ao entendimento das

causas de deterioração dos alimentos.

A deterioração de um alimento costuma ser

constituída por uma série de eventos primários,

seguidos de eventos secundários (reações e

interações dos componentes dos alimentos) que, por sua vez, tornam-se evidentes pela alteração de atributos de qualidade.

Alterações Bioquímicas em Alimentos

Tabela 3: Exemplos de relações causa-efeito associadas a alterações em alimentos durante manipulação,armazenamento e processamento.

Evento primário

Efeito secundário

Atributo influenciado

Hidrólise de lipídeos

Hidrólise de polissacarídeos

Oxidação de lipídeos

Ácidos graxos livres reagem com proteína

Açúcares reagem com proteínas

Produtos de oxidação reagem com diversos outros constituintes

Textura, sabor, valor nutricional

Textura, sabor, cor, valor nutricional

Textura, sabor, cor, valor nutricional; pode ocorrer a formação de substancias tóxicas

Contusões em plantas

Ruptura celular, liberação de enzimas, disponibilidade de oxigênio

Textura, sabor,cor, valor nutricional

Aquecimento de produtos da horticultura

Perda de integridade de parede e membrana celulares, liberação de ácidos, inativação de enzimas.

Textura, sabor, cor, valor nutricional

Aquecimento do tecido muscular

Desnaturação e agregação de proteínas, inativação de enzimas.

Textura, sabor, cor , valor nutricional.

Conversão cis

trans

Aumento da taxa de polimerização

Formação excessiva de espuma

em lipídeos

durante fritura

durante a fritura, diminuição do valor nutricional e biodisponibilidade de lipídeos, solidificação do óleo de fritura.

Escurecimento Enzimático e

Não enzimático

Alteração de alimentos

Alteração de alimentos “Todas as modificações que se operam, destruindo parcial ou totalmente as características

“Todas as modificações que se operam,

destruindo parcial ou totalmente as características essenciais dos alimentos,

por comprometimento de suas qualidades

físicas e químicas, microbiológicas, sensoriais e nutritivas.”

(Evangelista, J., 2000)

Alteração de alimentos

Alteração de alimentos  Alterações na produção – alcançam de 10 a 30%  Alimentos são

Alterações na produção alcançam de 10 a 30%

Alimentos são classificados devido a resistência às alterações e a quantidade de água livre, em:

Perecíveis leite, carne bovina, alimentos in natura;

às alterações e a quantidade de água livre, em:  Perecíveis – leite, carne bovina, alimentos
às alterações e a quantidade de água livre, em:  Perecíveis – leite, carne bovina, alimentos
às alterações e a quantidade de água livre, em:  Perecíveis – leite, carne bovina, alimentos

Alteração de alimentos

Alteração de alimentos Semi-perecíveis - alguns legumes (beterraba, batata madura) frutas maduras, amêndoas etc. Não

Semi-perecíveis - alguns legumes (beterraba,

batata madura) frutas maduras, amêndoas

etc.

Não perecíveis - tempo de conservação indefinido

açúcar, farinhas, leguminosas, cereais, alimentos

que sofreram algum processo de conservação.

Alteração de alimentos

Semi-perecíveis - alguns legumes (beterraba, batata

madura) frutas maduras, amêndoas

legumes (beterraba, batata madura) frutas maduras, amêndoas Não perecíveis - tempo de conservação indefinido –
legumes (beterraba, batata madura) frutas maduras, amêndoas Não perecíveis - tempo de conservação indefinido –

Não perecíveis - tempo de conservação indefinido

açúcar, farinhas, leguminosas,

cereais, alimentos que sofreram algum processo de conservação.

etc.

indefinido – açúcar, farinhas, leguminosas, cereais, alimentos que sofreram algum processo de conservação. etc.
indefinido – açúcar, farinhas, leguminosas, cereais, alimentos que sofreram algum processo de conservação. etc.

Alteração de alimentos

Alteração de alimentos Dependendo do grau e tipo de alteração - alimento pode ser consumido se

Dependendo do grau e tipo de alteração - alimento pode ser consumido se não desfigurar suas qualidades sensoriais e não oferecer perigo a quem o ingere.

Exemplos de produtos alterados e aproveitados:

leite “talhado” para fazer doce, requeijão; Frutas fermentadas obtenção de vinagres ; Pão “dormido” fazer farinha de rosca

requeijão;  Frutas fermentadas – obtenção de vinagres ;  Pão “dormido” – fazer farinha de

Alteração de alimentos

Alteração de alimentos Essas alterações podem ser de origem biológica, química e física e englobam: Crescimento

Essas alterações podem ser de origem biológica, química e física e englobam:

Crescimento e atividade dos microrganismos;

Ação das enzimas presentes;

Reações químicas não enzimáticas;

Por ataque de insetos ou roedores;

Ações

físicas

como

as

provocadas

mecânicos.

por

agentes

Alteração de alimentos

Alteração de alimentos Queijo Brie ( Penicillium ) Queijo Camembert (Penicillium)

Queijo Brie

( Penicillium)

Alteração de alimentos Queijo Brie ( Penicillium ) Queijo Camembert (Penicillium)
Alteração de alimentos Queijo Brie ( Penicillium ) Queijo Camembert (Penicillium)

Queijo Camembert

(Penicillium)

Alteração de alimentos Queijo Brie ( Penicillium ) Queijo Camembert (Penicillium)
Alteração de alimentos Queijo Brie ( Penicillium ) Queijo Camembert (Penicillium)
Alteração de alimentos Queijo Brie ( Penicillium ) Queijo Camembert (Penicillium)

Alteração de alimentos

Alteração de alimentos As reações de escurecimento de alimentos estão entre as mais importantes alterações que

As reações de escurecimento de alimentos estão entre as mais importantes alterações que sofrem os alimentos, seja na forma in natura ou durante a cadeia de processamento e armazenamento.

Por causa das alterações que provocam, têm implicações

tanto nutricionais, tecnológicas e econômicas.

Por isto são motivos de intensa atividade de pesquisa.

Alteração de alimentos

Alteração de alimentos Os principais grupos de reações de escurecimento são conhecidos como escurecimento

Os principais grupos de reações de escurecimento são

conhecidos como escurecimento enzimático (REE)

da polifenoloxidase (PPO) e escurecimento não enzimático (RENE), causado pela reação de Maillard (RM)

Outros mecanismos de escurecimento de alimentos, tais como oxidação de vitamina C, ação das peroxidases, etc.

Escurecimento Enzimático

Escurecimento Enzimático Alterações provocadas por enzimas;  enzimas do próprio produto;  enzimas produzidas

Alterações provocadas por enzimas;

enzimas do próprio produto;

enzimas produzidas por microrganismos.

Raramente conferem nocividade ao produto;

Alteram características sensoriais do produto mais atingidos: sabor, aroma e cor

EnzimasEnzimas

EnzimasEnzimas  São Proteínas embora existam:  Ribozimas – pequenos RNAs catalíticos  Abzimas –

São Proteínas embora existam:

Ribozimas pequenos RNAs catalíticos

Abzimas anticorpos catalíticos

Eficientes catalisadores

Aceleram as reações por um fator de 10 8 a 10 10 Atuam em pequenas concentrações: 10 -3 a 10 -4 % do catalisador

EnzimasEnzimas

EnzimasEnzimas  Atuam sob condições amenas de reação  pH na faixa 5-8, geralmente 7 

Atuam sob condições amenas de reação

pH na faixa 5-8, geralmente 7

Temperatura: 20-40 o C, existindo também na faixa de 50-70 o C

Minimiza problemas de reações laterais indesejadas como: decomposição, isomerização e rearranjo.

Classe da Enzima

Número

Número

Tipo de reação

Classificadas

Disponíveis

1.oxidoredutases

650

90

Redução - oxidação:

oxigenação de ligações de C -

H, C -C, C=C; ou remoção total

ou adição de equivalentes de

átomos de hidrogênio

2.transferases

720

90

Transferência de grupos:

aldeídico, cetônico, acila,

açúcar, fosfato ou metila

3.hidrolases

636

150

Hidrólise: formação de

ésteres, amidas, lactonas,

lactamas, epóxidos,

nitrilasanidridos, glicosídeos,

organohaletos

4.liases

255

35

Adição - eliminação de

pequenas molé culas nas

ligações C=C, C=N, C=O

5.isomerases

120

6

Isomerização tais como

racemização, epimerização,

re - arranjos

6.ligases

80

5

Formação - clivagem de

ligações C -O, C - S, C - N, C - C

com concomitante clivagem

de trifosfato

EnzimasEnzimas emem AlimentosAlimentos

EnzimasEnzimas emem AlimentosAlimentos  Papel destacado - Influem na composição, processamento e deterioração dos

Papel

destacado

-

Influem

na

composição,

processamento e deterioração dos alimentos

Portanto, ora são úteis ora são indesejáveis

Detecção da atividade em determinado produto pode servir de indicador da eficiência de uma determinada operação;

Ex. vegetais branqueados atividade da peroxidase =

indicador do processo térmico empregado

EnzimasEnzimas emem Alimentos:Alimentos:

EfeitoEfeito desejáveisdesejáveis

Modificar

matérias-primas

produtos específicos

e/ou

obter

Panificação

Modificação enzimática de materiais amiláceos

Fabricação de sucos de frutas

Modificação de proteínas

Fabricação de bebidas alcoólicas

Fabricação de laticínios

EnzimasEnzimas emem Alimentos:Alimentos:

EfeitoEfeito indesejáveisindesejáveis

Escurecimento de frutas e vegetais causado pelas polifenoloxidases

Rancidez de farinhas causada pela ação

de lipases e lipoxigenases

Amolecimento

de

tecidos

vegetais

provocado pelas enzimas pécticas

Escurecimento Enzimático

Escurecimento Enzimático Alterações como: Diminuição da textura de frutas e de vegetais – atividade das enzimas

Alterações como:

Diminuição da textura de frutas e de vegetais atividade das enzimas pectinolíticas leva a formação da massa

de tomate por exemplo;

Supermaturação

das

frutas

branqueamento;

deve

ser

evitada

pelo

Sucos de frutas cítricas pode provocar precipitação do liquido;

Escurecimento Enzimático

Escurecimento Enzimático
Escurecimento Enzimático

Escurecimento Enzimático

Escurecimento Enzimático
Escurecimento Enzimático

Escurecimento Enzimático

Escurecimento Enzimático Duas enzimas são relevantes na degradação oxidativa dos compostos fenólicos por causarem a

Duas enzimas são relevantes na degradação oxidativa dos

compostos fenólicos por causarem a produção de polímeros de coloração marrom (melaninas): a polifenoloxidase (PPO) e a peroxidase (POD)

(TOMÁS-BARBERÁN e SPÍN, 2001).

Função = oxidam os polifenóis a quinonas;

polifenoloxidase (PPO) e a peroxidase (POD) (TOMÁS-BARBERÁN e SPÍN, 2001). Função = oxidam os polifenóis a

Escurecimento Enzimático

Escurecimento Enzimático Compostos fenólicos  São considerados como metabólitos secundários. 

Compostos fenólicos

São considerados como metabólitos secundários.

Estruturalmente contêm um anel aromático com um

ou

substitutos.

mais

grupos

hidroxilas,

juntamente

com

outros

A composição fenólica de frutas e hortaliças varia de acordo com a espécie, cultivo, grau de amadurecimento e condições ambientais de desenvolvimento e de armazenamento

Escurecimento Enzimático

Escurecimento Enzimático Compostos fenólicos O tipo e a concentração do substrato fenólico afetam diretamente o

Compostos fenólicos

O tipo e a concentração do substrato fenólico afetam diretamente o escurecimento enzimático, conforme afirmam MARTÍN-BELLOSO e SOLIVA-FORTUNY (2006).

fenólico afetam diretamente o escurecimento enzimático, conforme afirmam MARTÍN-BELLOSO e SOLIVA-FORTUNY (2006).

Escurecimento Enzimático

Escurecimento Enzimático

Escurecimento Enzimático

Agente causador de alteração :

Escurecimento Enzimático Agente causador de alteração : ENZIMA POLIFENOL OXIDASE Oxidam compostos fenólicos do

ENZIMA POLIFENOL OXIDASE

Agente causador de alteração : ENZIMA POLIFENOL OXIDASE Oxidam compostos fenólicos do alimento (taninos e

Oxidam compostos

fenólicos do alimento

(taninos e tirosina)

Geram MELANOIDINAS = COLORAÇÃO ESCURA

Produzem quinonas substancias que

possuem carbonilas

Geram MELANOIDINAS = COLORAÇÃO ESCURA Produzem quinonas – substancias que possuem carbonilas Polimerizadas

Polimerizadas

Geram MELANOIDINAS = COLORAÇÃO ESCURA Produzem quinonas – substancias que possuem carbonilas Polimerizadas
Geram MELANOIDINAS = COLORAÇÃO ESCURA Produzem quinonas – substancias que possuem carbonilas Polimerizadas

Escurecimento Enzimático

Escurecimento Enzimático Os sucos cítricos ricos em Vitamina C tem ação de impedir o desenvolvimento dessa

Os sucos cítricos ricos em Vitamina C tem ação de impedir

o desenvolvimento dessa reação;

O ácido ascórbico atua sequestrando o cobre, grupo prostético da polifenoloxidase, e reduzindo quinonas de volta a fenóis, antes de formarem pigmentos escuros

(SAPERS, G.M.; MILLER, R.L, 1998).

Escurecimento Enzimático

Escurecimento Enzimático ARAÚJO (1999) acrescenta que no tecido vegetal intacto de frutas e hortaliças também pode

ARAÚJO (1999) acrescenta que no tecido vegetal intacto de frutas e hortaliças também pode ocorrer escurecimento. Situações de inibição da respiração durante o

armazenamento em atmosfera controlada, o uso de

embalagem imprópria, a deficiência de ácido ascórbico no

tecido vegetal, o armazenamento a frio e a radiação ionizante.

WHITAKER e LEE (1995) acreditam que mais de 50% das

frutas ocorrem como resultado do

perdas

escurecimento enzimático.

em

Escurecimento Enzimático

Escurecimento Enzimático MARSHALL, HIM e WEI (2000) indicaram que a alface e outros vegetais verdes folhosos,

MARSHALL, HIM e WEI (2000) indicaram que a alface e

outros vegetais verdes folhosos, a batata e fontes de

amido (como a batata-doce, fruta-pão, inhame, cogumelos e bananas), além de diversas frutas e hortaliças tropicais e subtropicais são susceptíveis ao escurecimento enzimático, causando perdas econômicas

para os agricultores.

O controle do escurecimento, portanto, torna-se crítico para

a diminuição das perdas comerciais do agricultor e para a

indústria de transformação

Escurecimento Enzimático

Escurecimento Enzimático Fatores que afetam o escurecimento enzimático:  Temperatura  Modificação da atmosfera

Fatores que afetam o escurecimento enzimático:

Temperatura

Modificação da atmosfera

Agentes químicos antioxidantes

Modificação genética caracterizar e inativar os genes que codificam as enzimas PPO E POD.

Escurecimento Enzimático

Alteração indesejável:

Problema do escurecimento enzimático sob o aspecto nutricional

do escurecimento enzimático sob o aspecto nutricional Possibilidade das o-quinonas interagirem com grupos amina e

Possibilidade das o-quinonas interagirem com grupos amina e

tiol, reduzindo a disponibilidade da lisina, metionina, tiamina e outros nutrientes essenciais (ARAÚJO, 1999). ALÉM DE ALTERAR A COR DOS ALIMENTOS

Alteração desejável:

desenvolvimento do sabor e da cor do chá preto;

na diminuição do amargor e adstringência dos produtos do cacau,

etc.

Escurecimento Não Enzimático

Escurecimento Não Enzimático

Escurecimento Não Enzimático

Escurecimento Não Enzimático Escurecimento ou browning - série de reações químicas que levam a formação de

Escurecimento ou browning - série de reações químicas que levam a formação de pigmentos escuros, de cor marrom melanoidinas ou melaninas

(polímeros insaturados coloridos de variada composição);

Três mecanismos ou tipos principais de escurecimento

químico:

A reação de Maillard; O mecanismo do ácido ascórbico ; Caramelização.

Escurecimento Não Enzimático

Escurecimento Não Enzimático Para que essas reações ocorram há necessidade da presença de alguns fatores combinados

Para que essas reações ocorram há necessidade da presença de alguns fatores combinados como:

temperatura,

tempo,

umidade,

meio ácido ou alcalino e

Componentes dos alimentos mais susceptíveis a participarem da reação.

No caso da reação de Maillard, além da cor tem-se a formação do aroma.

Escurecimento Não Enzimático

Escurecimento Não Enzimático
Escurecimento Não Enzimático
Escurecimento Não Enzimático
Escurecimento Não Enzimático
Escurecimento Não Enzimático
Escurecimento Não Enzimático
Escurecimento Não Enzimático

Escurecimento Não Enzimático

Escurecimento Não Enzimático
Escurecimento Não Enzimático
Escurecimento Não Enzimático
Escurecimento Não Enzimático
Escurecimento Não Enzimático

Escurecimento Não Enzimático

Escurecimento Não Enzimático 1- Reação de Maillard A reação acontece quando o grupo amino de aminoácidos

1- Reação de Maillard

A reação acontece quando o grupo amino de aminoácidos e compostos carbonilas de açúcares redutores, em especial glicose; frutose; maltose e lactose reagem entre si quando aquecidos.

A reação abrange uma série de segmentos onde ocorrem combinações, rearranjos e fragmentação de moléculas, tendo como produto final as melanoidinas (pigmento marrom), o qual tem grande influência na qualidade de alimentos processados. (ASHOOR & ZENT, 1984; CHEFTEL, 1992; EVANGELISTA, 1992;)

Escurecimento Não Enzimático

Escurecimento Não Enzimático 1- Reação de Maillard O início da reação de Maillard se dá com

1- Reação de Maillard

O início da reação de Maillard se dá com a união dos grupos amino e carbonila.

1- Reação de Maillard O início da reação de Maillard se dá com a união dos

GLICOSILAMINA

Escurecimento Não Enzimático

1- Reação de Maillard

A partir dessa reação, se verifica:

o rearranjo conhecido como de Amadori, que é a isomerização da glicosilamina;

a formação da base de Schiff;

a degradação de Strecker (perda de CO 2 ) e algumas reações intermediárias,

formação do hidroximetil furfural (HMF),

polimerização do HMF

Formação da melanoidina.

EVANGELISTA, 1992; CHEFTEL, 1992)

Escurecimento Não Enzimático

1- Reação de Maillard

Escurecimento Não Enzimático 1- Reação de Maillard Características:  Ocorre preferencialmente em meio alcalino;

Características:

Ocorre preferencialmente em meio alcalino;

Presença de água e calor.

Temperatura duplicada a cada 10°C entre 40° e 70°C;

pH em meio ácido, retarda a reação;

Velocidade da reação é máxima quando em pH neutro (pH 6,0 e 7,0);

Velocidade também é maior para monossacarídeos e com o aminoácido lisina.

Escurecimento Não Enzimático

2- Caramelização:

Ocorre quando compostos poliidroxicarbonilados (açucares ou certos ácidos) são aquecidos em temperaturas relativamente altas (130 a 170°C).

Inicialmente sofrem desidratação;

Condensação e polimerização formando moléculas

complexas de peso variado; Formação de aldeídos muito ativos como o HMF = confere o aroma característico do açúcar caramelizado.

HMF sofre polimerização - melanoidinas

Escurecimento Não Enzimático

2- Caramelização:

em meio ácido ou alcalino, o açúcar redutor isomeriza e forma enol.

Numa segunda etapa em meio ácido, desidrata,"encolhe" e forma o HMF; em meio alcalino se fragmenta em

compostos lábeis.

Na terceira etapa formam-se polímeros que são as melanoidinas de coloração escura.

São reações auto-catalizadas pelo desprendimento

de água, aceleradas pelo calor e umidade.

Escurecimento Não Enzimático

2- Caramelização:

Escurecimento Não Enzimático 2- Caramelização: 
Escurecimento Não Enzimático 2- Caramelização: 

Escurecimento Não Enzimático

2- Caramelização:

pH alcalino = menos cor pH ácido = mais cor e mais sabor

Escurecimento Não Enzimático

Escurecimento Não Enzimático
Escurecimento Não Enzimático

Escurecimento Não Enzimático

Escurecimento Não Enzimático 3- Mecanismo do ácido ascórbico: z O ácido ascórbico tem sido considerado como

3- Mecanismo do ácido ascórbico:

z O ácido ascórbico tem sido considerado como o responsável pelo escurecimento de sucos cítricos concentrados, principalmente os de limão e tangerina. O ácido ascórbico, quando aquecido em meio ácido,

origina compostos de coloração escura.

Ácido

ascórbico

origina compostos de coloração escura. Ácido ascórbico ácido deidroascórbico ácido 2, 3 diceto - hexurônico

ácido

deidroascórbico

compostos de coloração escura. Ácido ascórbico ácido deidroascórbico ácido 2, 3 diceto - hexurônico FURFURAL

ácido 2, 3

diceto - hexurônico

compostos de coloração escura. Ácido ascórbico ácido deidroascórbico ácido 2, 3 diceto - hexurônico FURFURAL

FURFURAL

Escurecimento Não Enzimático

Escurecimento Não Enzimático z Ranço oxidativo ou autooxidação z Cadeias insaturadas dos ácidos graxos se rompem

z Ranço oxidativo ou autooxidação

z Cadeias insaturadas dos ácidos graxos se rompem

z

z Cadeias insaturadas dos ácidos graxos se rompem z Peróxidos z aldeídos, álcool, cetonas, hidrocarbonetos z

Peróxidos

insaturadas dos ácidos graxos se rompem z Peróxidos z aldeídos, álcool, cetonas, hidrocarbonetos z odor

z aldeídos, álcool, cetonas, hidrocarbonetos

z Peróxidos z aldeídos, álcool, cetonas, hidrocarbonetos z odor desagradável z O Ranço oxidativo é acelerado

z odor desagradável

z O Ranço oxidativo é acelerado por oxigênio, luz, temperatura, metais,

z enzimas (lipoxidase), presença de oxidantes naturais

Processamento de alimentos

Processamento de alimentos  Estudo de caso: HIGIENE E SANITIZAÇÃO NA INDUSTRIA DE VEGETAIS (ANVISA)

Estudo de caso:

HIGIENE E SANITIZAÇÃO NA INDUSTRIA DE VEGETAIS (ANVISA)

Processamento de alimentos

Processamento de alimentos  Processamento de frutas e hortaliças apertizadas: Entre as operações mais comuns podem

Processamento de frutas e hortaliças apertizadas:

Entre as operações mais comuns podem ser citadas:

Colheita

Transporte

Seleção

Limpeza

Classificação

Branqueamento

Acondicionamento

Exaustão (Calor ou Meios mecânicos)

Fechamento

Tratamento térmico (pressão atmosférica, pressão elevada, temperaturas elevadas (UHT).

Resfriamento

Empacotamento e armazenamento

Tratamento térmico do produtos apertizados (equipamentos utilizados: autoclave, cozedor-rotativo, esterilizador hidrostático, flash 18, esterilização à chama, processamento asséptico)

HIGIENIZAÇÃO NO PROCESSAMENTO DE PALMITO

HIGIENIZAÇÃO NO PROCESSAMENTO DE PALMITO

Processamento de palmito

Processamento de palmito
Formulação para 100 litros de salmoura de espera • 5 kg de sal de cozinha

Formulação para 100 litros de salmoura de espera

5 kg de sal de cozinha

1 kg de ácido cítrico 96 litros de água

Formulação para 100 litros de salmoura ácida:

3 kg de sal de cozinha 860 g de ácido cítrico (podendo variar ± 150g, dependendo da acidez inicial do palmito ao natural) 96,3 litros de água

Exaustão em banho maria

Exaustão em banho maria

Exaustão em túnel a vapor. Entrada do túnel (foto acima) e saída do túnel (Foto

Exaustão em túnel a vapor. Entrada do túnel (foto acima) e saída do túnel (Foto abaixo).

Esterilização

Esterilização

Controle de qualidade de palmito

Controle de qualidade de palmito DEFEITOS - Alteração do pH: salmoura - Estufamento: microrganismos - Escurecimento:

DEFEITOS - Alteração do pH: salmoura - Estufamento: microrganismos

- Escurecimento: processamento

Indústria de Processamento de Alimentos

Indústria de Processamento de Alimentos Conhecer os fundamentos tecnológicos comprovadamente eficientes da higiene da

Conhecer os fundamentos tecnológicos

comprovadamente eficientes da higiene da matéria-prima, (incluindo a água), das superfícies de processamento e dos ambientes de processamento