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LOT-2042

Processos Bioqumicos

Separao/ Purificao de
Produtos Biotecnolgicos

Profa. Dra. Rita de Cssia L.B. Rodrigues


Departamento de Biotecnologia LOT
E-mail: rita@debiq.eel.usp.br
ritaclb_rodrigues@hotmail.com

Fone: 3159-5027
Conceitos: Abordagem

Introduo s tcnicas de separao


de bioprodutos.

Rompimento celular

Separao de protenas

Centrifugao
Processamento
downstream
A viabilidade da produo e comercializao de
biomolculas depende do custo do produto

Cerca de 50 a 90% do custo da produo da


biomolcula corresponde as etapas de
purificao
Processamento
downstream

Downstream processing grupo


de tcnicas, tais como a centrifugao,
filtrao e cromatografia, usadas para
recuperar e purificar os produtos de uma
converso enzimtica ou de um processo
de produo microbiolgica.
PURIFICAO DE
BIOMOLCULAS
Rendimento Total (%) 120

100

80

60 95%
90%
40
85%
20 80%

0 70%
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Nmero de etapas do processo

Influncia do rendimento de cada etapa do


processo de purificao de produtos microbianos
sobre o rendimento do produto final
Cromatografia de Afinidade
Eletroforese preparativa

109
I
Cromatografia por adsoro
Processos com Membranas
Teraputico
II
US$/k

Filtrao
Extrao
g

Diagnstico
III Precipitao
Membranas
Industrial

BIOMOLCULAS etanol

gua

10-3
10-9 Concentrao do Material Inicial 103

(kg/m3)
Cultura Estoque Pr-inculo
UPSTREAM Preparo Meio de Cultura Esterilizao
Cultivo em Frascos Agitados Processo fermentativo
Produto Intracelular Produto Extracelular

DOWNSTREAM Processos de Separao de Clulas Processos de Separao de Clulas


Centrifugao/ Filtrao Centrifugao/Filtrao

Sobrenadante Clulas -PRODUTO- Sobrenadante Clulas


-PRODUTO-
Sub-Produto Rompimento Sub-produto
ou Resduo Celular ou Resduo

Fragmentos Celulares:
Filtrao
Fragmentos
Celulares
Sobrenadante
-PRODUTO-

Enriquecimento e Concentrao do Produto


Extrao Lquido-Lquido Ultrafiltrao
Precipitao (Sais, solventes) Flotao

Processos de Purificao de Alta Resoluo


Processos Cromatogrficos

Acondicionamento Trat. Finais Transporte


Concentrao:UF
Etapa do processo
Operaes Unitrias Princpio
filtrao convencional tamanho de partculas
centrifugao tamanho e densidade de partculas
Clarificao filtrao tangencial (membranas) Tamanho de partculas
floculao Hidrofobicidade de partculas
homegeneizao cisalhamento
Rompimento ultra-som cisalhamento
moagem em moinho de bolas cisalhamento
de clulas rompimento qumico ou enzimtico Hidrlise, solubilizao ou desidratao de molculas
que compem a parede ou membrana celular
Purificao precipitao solubilidade
de ultrafiltrao (membranas) Massa molar e raio hidrodinmico de molculas
baixa
resoluo extrao em sistemas de duas fases lquidas solubilidade

cromatografia de troca inica tipo e densidade de carga na superfcie da biomolcula

cromatografia de afinidade (biolgica ou stios especficos da superfcie de uma protena


Purificao qumica) (adsoro)
de alta cromatografia de imunoafinidade stios especficos da superfcie de uma protena
resoluo (adsoro antgeno/anticorpo)
cromatografia de interao hidrofbica hidrofobicidade

cromatografia de excluso molecular Massa molar

membranas adsortivas massa molar e caractersticas para adsoro ou stios


especficos da superfcie de uma protena
cristalizao Solubilidade e caractersticas de equilbrio lqsl
tratamentos
finais liofilizao caractersticas de equilbrio lquidoslido
secagem caractersticas de equilbrio lquidoslido
Processo de Downstream
depende do uso do produto
1. Preparao de enzimas para
suplementao animal no so
purificadas.
2. Enzimas para uso industrial podem ser
parcialmente purificadas (ex. Amilase
para industria de amido).
3. Enzimas para uso analtico (ex. Glicose
oxidase) e protenas farmacuticas so
altamente purificadas.
Animal feed enzyme Analytical enzyme Therapeutic protein
Fermentation Fermentation Fermentation

Centrifugation Centrifugation
Centrifugation to remove
to remove cells to remove cells
medium
Culture supernatant Culture supernatant Cell pellet
Protein Cell lysis
precipitation Centrifugation
Liquid preparation Protein fraction Intracellular fraction
to animal feed Protein
1 or 2 purification
market precipitation
steps
Semi-purified Protein fraction
protein 3-4 purification
steps
Lyophilisation
Bottling Homogeneous
protein
To chemicals market
Sterile
bottling
To pharmaceuticals market
Etapas do processamento
1-Separao de clulas
Protenas Intracelulares

Fermentao coleta e separao das clulas (centrifugao ou


filtrao) ruptura ( homogeneizao uma suspenso de clulas
submetida a atravessar um orifcio de dimetro interno estreito, sob
alta presso ou agitao na presena de abrasivos, como perlas de
vidro) centrifugao (para separao dos fragmentos celulares).

Protenas extracelulares
Neste caso, menor complexidade nas etapas iniciais
do processamento de Downstream.
Fermentao remoo das clulas por
centrifugao ou filtrao
Etapas do processamento

2 - Concentrao do produto protico


Pequenos volumes so mais convenientes para
se trabalhar
Mtodos:
Induo da precipitao do produto
utilizando, por exemplo, sais como sulfato de
amnio ou solventes como o etanol.
Ultrafiltrao.
Etapas do processamento
2 - Concentrao do produto protico

Ultrafiltrao

um mtodo popular de concentrao devido aos


seguintes fatores:

Altas taxas de recuperao do produto


Processo rpido
Equipamento para scale-up do processo j est
disponvel, e os custos so relativamente acessveis.
Etapas do processamento
2 - Concentrao do produto protico

Ultrafiltrao
Etapas do processamento
3 - Purificao
As tcnicas de purificao so baseadas nas caractersticas
fsico-qumicas das protenas, tais como tamanho,
carga, solubilidade, hidrofobicidade.

Estagios:
Design: uma srie de etapas de purificao, onde deve-se
conhecer:
qual o maior contaminante?
informaes detalhadas da origem do produto e dos contaminantes,
caractersticas fsicas do produto.

Scale-up: processo empregado para converter um procedimento


laboratorial em industrial, mediante aspectos econmicos
produto de alta qualidade e competitivo no mercado.
Etapas da cadeia de
purificao:

obteno do produto de interesse;

remoo da maior parte dos


contaminantes (incluindo DNA);

remoo de todos os vestgios de


contaminantes e formas variveis do
produto de interesse.
Mtodos de purificao

1-Filtrao
A eficincia deste mtodo depende da natureza fsica
das partculas do produto;
Pode ser usada antes da primeira etapa de purificao,
com o objetivo de concentrar a biomassa;

2-Ultrafiltrao: molculas de tamanhos diferentes


so separadas pela passagem, sob presso, de uma
disperso sobre uma membrana com poros de
tamanho definido.
Est tcnica aplicada para a separao de
macromolculas ou de vrus.
Mtodos de purificao

1-Filtrao
Mtodos de purificao
3-Centrifugao
- Tambm depende da natureza fsica do produto
de interesse;

- Permite o isolamento eficiente de partculas


subcelulares e organelas em suspenso num lquido
viscoso;

- Esta tcnica utiliza um fluido viscoso, com


gradiente de densidade constante. Aps a
centrifugao, as diferentes fraes podem ser
removidas.
Mtodos de purificao

3-Centrifugao
Mtodos de purificao
4-Precipitao

- Mtodo simples e relativamente econmico, mas


no muito utilizado para purificao de protenas
recombinantes em larga escala, pois faz uso de
agentes que devem ser eliminados depois;

- Pode ocorrer por salting-out, que a


precipitao devido ao aumento da fora inica do
meio (sulfato de amnio)

- Tambm pode ocorrer por mudana da constante


dieltrica, utilizando uma mistura de gua +
solvente orgnico (ex: polietilenoglicol, cido
tricloroactico).
Mtodos de purificao
5-Cromatografia

- baseado na separao envolvendo no processo


2 fases: fase estacionria e fase mvel

Fase estacionria ideal: Alta fora mecnica,


alta porosidade, alta capacidade,
biocompatibilidade e estabilidade da matriz frente a
uma variedade de solventes.
Mtodos de purificao

5-Cromatografia

Cromatografia por adsoro

Cromatografia por troca inica

Cromatografia de interaes hidrofbicas

Cromatografia de permeao em gel

Cromatografia de afinidade
Mtodos de purificao
1-Cromatografia de afinidade
baseado em interaes especficas entre um
ligante imobilizado e a protena de interesse.

Sob condies fisiolgicas ocorre a ligao da protena


com o ligante.

Em seguida, lava-se a matriz com a finalidade de


remover contaminantes.

Assim, a protena purificada pode ser recuperada


atravs da adio de ligantes que competem pela
fase estacionria ou de mudanas nas condies
fsicas, reduzindo a afinidade.
Mtodos de purificao
Cromatografia de afinidade

Vantagens: a alta especificidade e a combinao de


concentrao e purificao em um s passo.

Desvantagens: a ligao da protena desejada nos


passos adicionais pode ser muito forte, necessitando de
condies severas para a separao desse complexo.
Consideraes para a produo e
purificao de protenas

1. Heterogeneidade de N- e C-terminais
muito importante o uso de mtodos que gerem
protenas com um NH2-terminal como o encontrado na
protena autntica.

Quando as protenas no so produzidas de forma


correta, o produto final pode ser uma mistura de
diversas variveis da protena em questo ou mesmo
conter protenas faltando um ou mais resduos de
amino-terminal. Isso chamado de heterogeneidade
de amino-terminal.

A heterogeneidade de amino- e/ou carboxi-terminal no


desejvel, uma vez que pode causar dificuldades na
purificao e caracterizao das protenas.
Consideraes para a produo e
purificao de protenas
2. Modificao qumica/ Alteraes
conformacionais

Transcritos que contm a sequencia inteira de cdigos


podem resultar em ismeros conformacionais da
protena por causa da estrutura secundria inesperada
que afeta a fidelidade da traduo.

Alm de alteraes conformacionais, as protenas


tambm podem sofrer mudanas qumicas durante o
processo de purificao. Essas alteraes podem
resultar em desnaturao parcial da protena. Por
outro lado, a desnaturao da protena pode ser a
causa das alteraes qumicas.
Consideraes para a produo e
purificao de protenas

3. Glicosilao
Muitas protenas teraputicas produzidas pela
tcnica do DNA recombinante so
glicoproteicas.

A presena e a natureza dos oligossacardeos nas


protenas afeta muitas caractersticas
importantes, entre as quais o tempo de meia-
vida, solubilidade, estabilidade e, s vezes, at
mesmo a funo farmacolgica.
Consideraes para a produo e
purificao de protenas

4. Processamento proteoltico
As proteases exercem um importante papel no
processamento, maturao, modificao ou
isolamento de protenas recombinantes.

Se a clula morre, as proteases so soltas e lisam a


clula. Portanto, importante controlar o
crescimento e as condies de cultivo para
minimizar esse efeito.
Consideraes para a produo e
purificao de protenas

5. Formao de corpo de incluso de protena na


clula
Na bactria normalmente protenas solveis podem
formar incluses granulares no citoplasma.

Essas incluses provavelmente ocorrem pelo acmulo


de agregados de protenas amorfas que se mantm
unidas por ligaes covalentes e no-covalentes.

Com a presena dessas incluses, podem ocorrer


problemas na purificao e na solubilidade da
protena.
Bibliografia

BIBLIOGRAFIA
Walsh, G. Biopharmaceuticals,
Biochemistry and Biotechnology, 2
edio, Ed. Wiley, 1998, p. 134-140
Para produtos intracelulares ou ligados membrana
CRITRIOS PARA SELEO DA TCNICA DE
ROMPIMENTO
- Tamanho da clula
- tolerncia a tenses de cisalhamento
- necessidade de controle de temperatura
- tempo de operao
- rendimento do processo
- gasto de energia
- custo e capital de investimento
Clulas envolvidas s com membranas (clulas animais e
hibridomas - so linhagens celulares desenvolvidas para produzir um anticorpo desejado em grande quantidade)
facilmente rompidas

Clulas com estruturas robustas


(microrganismos)
difcil rompimento
Bactrias Gram-negativas:
paredes mais rgidas que Gram+

Leveduras e Fungos Filamentosos:


paredes celulares mais rgidas que bactrias, mas so de
maior tamanho.
Bactrias
10-80 nm parede celular
Gram (+)
espao periplasmtico
8 nm membrana citoplasmtica
CITOPLASMA

Bactrias 8 nm membrana externa parede celular


Gram (-) 3 nm murena
espao periplasmtico
8 nm membrana citoplasmtica

CITOPLASMA

Leveduras lipdios
protenas parede celular
manana
75 nm
glicano
membrana citoplasmtica

CITOPLASMA

Fungos Filamentosos
glicano

glicoprotena
quitina/microfibrila

membrana citoplasmtica

CITOPLASMA

Estruturas estilizadas de paredes celulares de diferentes microrganismos


Condies de crescimento microbiano
podem influenciar o rompimento
- Clulas cultivadas em meio sinttico podem ser
rompidas mais facilmente que em meios
complexos

- Clulas com elevadas velocidades especficas de


crescimento possuem parede celular menos
robusta
Tabela 2.1 Dimetros de molculas, organelas e clulas com interesse

biotecnolgico

Partcula Dimetro

Glicose-6-fosfato desidrogenase 140

Glicose oxidase 70

Ovoalbumina 58

Vrus 0,01 a 0,1 m

Mitocndria 0,4 a 4,0 m

Bactrias 0,5 a 5,0 m

E. coli 1 a 2 m

Leveduras 2 a 15 m

Fungos filamentosos 5 a 10 m

S. cerevisiae 4 a 5 m

Clulas animais em geral ~10 m

Clulas vermelhas do sangue 5 a 8 m

Clulas de planta 20 a 100 m

Clulas de fgado humano 30 a 40 m


O tamanho relativo dos microrganismo

Microrganismos por serem pequenos, abrangem uma


grande variedade de tamanhos
a partir do vrus de T4, vrus que so 0,02 m a bactrias
gigantes
maiores do que 700 m
Clula intacta

Rompimento total Permeabilizao seletiva


Biomolcula-alvo

Esquema comparativo entre rompimento total da clula


com permeabilizao seletiva
Alteraes Bioqumicas em
Alimentos
Alteraes Bioqumicas em Alimentos
Tabela 1: Classificao das alteraes que podem ocorrer durante
manipulao, processamento, ou armazenamento.
Atributo Alterao
Textura Perda de solubilidade
Perda da capacidade de reteno de gua
Endurecimento
Amolecimento

Sabor Desenvolvimento de rancidez (hidroltica ou oxidativa)


sabor cozido ou caramelo
outros odores indesejados
sabores desejados

Cor Escurecimento
Branqueamento
Desenvolvimento de cores desejadas (p.ex., escurecimento em produtos cozidos)

Valor nutricional Perda, degradao ou alterao da biodisponibilidade de protenas, lipdeos,


vitaminas, minerais e outros componentes benficos a sade.

Segurana Gerao de substncias txicas


Desenvolvimento de substncias com efeito protetor a sade
Inativao de substncias txicas
Alteraes Bioqumicas em Alimentos

Tabela 2: Algumas das reaes qumicas e bioqumicas que podem levar


alterao da qualidade ou segurana dos alimentos.
Tipo de reao Exemplos
Escurecimento no enzimtico Produtos cozidos, secos e de umidade intermediria.

Escurecimento enzimtico Frutas e vegetais cortados


Oxidao Lipdeos (odores indesejveis), degradao de vitaminas,
descolorao de pigmentos, protenas (perda do valor
nutricional)

Hidrlise Lipdeos, protenas, carboidratos, vitaminas,pigmentos.

Interao com metais Complexao (antocianinas), perda de Mg da clorofila, catlise


da oxidao.

Isomerizao de lipdeos Isomerizao cis trans, no conjugado , conjugado

Ciclizao de lipdeos cidos graxos monocclicos


Oxidao e polimerizao de lipdeos Formao de espuma durante a fritura
Desnaturao de protenas Coagulao da gema do ovo, inativao de enzimas

Interligao entre protenas Perda de valor nutricional durante processamento alcalino

Sntese e degradao de polissacardeos Ps-colheita de plantas


Alteraes glicolticas Ps-colheita do tecido vegetal, ps-morte do tecido animal
As reaes listadas na Tabela 3 (a seguir)
causam as alteraes listadas na Tabela 1

A integrao da informao contida em ambas as


tabelas pode conduzir ao entendimento das
causas de deteriorao dos alimentos.

A deteriorao de um alimento costuma ser


constituda por uma srie de eventos primrios,
seguidos de eventos secundrios (reaes e
interaes dos componentes dos alimentos) que,
por sua vez, tornam-se evidentes pela alterao
de atributos de qualidade.
Alteraes Bioqumicas em Alimentos
Tabela 3: Exemplos de relaes causa-efeito associadas a alteraes
em alimentos durante manipulao,armazenamento e processamento.
Evento primrio Efeito secundrio Atributo influenciado

Hidrlise de lipdeos cidos graxos livres reagem com Textura, sabor, valor nutricional
protena

Hidrlise de Acares reagem com protenas Textura, sabor, cor, valor


polissacardeos nutricional

Oxidao de lipdeos Produtos de oxidao reagem com Textura, sabor, cor, valor
diversos outros constituintes nutricional; pode ocorrer a
formao de substancias
txicas

Contuses em plantas Ruptura celular, liberao de enzimas, Textura, sabor,cor, valor


disponibilidade de oxignio nutricional

Aquecimento de Perda de integridade de parede e Textura, sabor, cor, valor


produtos da horticultura membrana celulares, liberao de nutricional
cidos, inativao de enzimas.

Aquecimento do tecido Desnaturao e agregao de Textura, sabor, cor , valor


muscular protenas, inativao de enzimas. nutricional.

Converso cis trans Aumento da taxa de polimerizao Formao excessiva de espuma


em lipdeos durante fritura durante a fritura, diminuio do
valor nutricional e
biodisponibilidade de lipdeos,
solidificao do leo de fritura.
Escurecimento Enzimtico e
No enzimtico
Alterao de alimentos

Todas as modificaes que se operam,


destruindo parcial ou totalmente as
caractersticas essenciais dos alimentos,
por comprometimento de suas qualidades
fsicas e qumicas, microbiolgicas,
sensoriais e nutritivas.

(Evangelista, J., 2000)


Alterao de alimentos
Alteraes na produo alcanam de 10 a 30%

Alimentos so classificados devido a resistncia s


alteraes e a quantidade de gua livre, em:

Perecveis leite, carne bovina, alimentos in natura;


Alterao de alimentos

Semi-perecveis - alguns legumes (beterraba,


batata madura) frutas maduras, amndoas.. etc.

No perecveis - tempo de conservao indefinido


acar, farinhas, leguminosas, cereais, alimentos
que sofreram algum processo de conservao.
Alterao de alimentos
Semi-perecveis - alguns legumes (beterraba, batata
madura) frutas maduras, amndoas.. etc.

No perecveis - tempo de
conservao indefinido
acar, farinhas, leguminosas,
cereais, alimentos que sofreram
algum processo de
conservao.
Alterao de alimentos

Dependendo do grau e tipo de alterao - alimento


pode ser consumido se no desfigurar suas qualidades
sensoriais e no oferecer perigo a quem o ingere.

Exemplos de produtos alterados e aproveitados:

leite talhado para fazer doce, requeijo;


Frutas fermentadas obteno de vinagres ;
Po dormido fazer farinha de rosca
Alterao de alimentos
Essas alteraes podem ser de origem biolgica, qumica e
fsica e englobam:

Crescimento e atividade dos microrganismos;


Ao das enzimas presentes;
Reaes qumicas no enzimticas;

Por ataque de insetos ou roedores;


Aes fsicas como as provocadas por agentes
mecnicos.
Alterao de alimentos

Queijo Camembert
Queijo Brie (Penicillium)
(Penicillium)
Alterao de alimentos
As reaes de escurecimento de alimentos esto entre
as mais importantes alteraes que sofrem os
alimentos, seja na forma in natura ou durante a cadeia
de processamento e armazenamento.

Por causa das alteraes que provocam, tm implicaes


tanto nutricionais, tecnolgicas e econmicas.

Por isto so motivos de intensa atividade de pesquisa.


Alterao de alimentos

Os principais grupos de reaes de escurecimento so


conhecidos como escurecimento enzimtico (REE)
da polifenoloxidase (PPO) e escurecimento no
enzimtico (RENE), causado pela reao de
Maillard (RM)

Outros mecanismos de escurecimento de alimentos, tais


como oxidao de vitamina C, ao das peroxidases, etc.
Escurecimento Enzimtico
Alteraes provocadas por enzimas;

enzimas do prprio produto;


enzimas produzidas por microrganismos.

Raramente conferem nocividade ao produto;

Alteram caractersticas sensoriais do produto mais


atingidos: sabor, aroma e cor
Enzimas

So Protenas embora existam:


Ribozimas pequenos RNAs catalticos
Abzimas anticorpos catalticos

Eficientes catalisadores
Aceleram as reaes por um fator de 108 a 1010
Atuam em pequenas concentraes: 10-3 a 10-4 %
do catalisador
Enzimas

Atuam sob condies amenas de reao


pH na faixa 5-8, geralmente 7

Temperatura: 20-40oC, existindo tambm na


faixa de 50-70oC

Minimiza problemas de reaes laterais


indesejadas como: decomposio,
isomerizao e rearranjo.
Classe da Enzima Nmero Tipo de reao
Classificadas Disponveis

1.oxidoredutases 650 90 Reduo-oxidao:


oxigenao de ligaes de C-
H, C-C, C=C; ou remoo total
ou adio de equivalentes de
tomos de hidrognio
2.transferases 720 90 Transferncia de grupos:
aldedico, cetnico, acila,
acar, fosfato ou metila
3.hidrolases 636 150 Hidrlise: formao de
steres, amidas, lactonas,
lactamas, epxidos,
nitrilasanidridos, glicosdeos,
organohaletos
4.liases 255 35 Adio-eliminao de
pequenas molculas nas
ligaes C=C, C=N, C=O
5.isomerases 120 6 Isomerizao tais como
racemizao, epimerizao,
re-arranjos
6.ligases 80 5 Formao-clivagem de
ligaes C-O, C-S, C-N, C-C
com concomitante clivagem
de trifosfato
Enzimas em Alimentos

Papel destacado - Influem na composio,


processamento e deteriorao dos alimentos

Portanto, ora so teis ora so indesejveis

Deteco da atividade em determinado produto


pode servir de indicador da eficincia de uma
determinada operao;

Ex. vegetais branqueados atividade da peroxidase =


indicador do processo trmico empregado
Enzimas em Alimentos:
Efeito desejveis

Modificar matrias-primas e/ou obter


produtos especficos
Panificao
Modificao enzimtica de materiais amilceos
Fabricao de sucos de frutas
Modificao de protenas
Fabricao de bebidas alcolicas
Fabricao de laticnios
Enzimas em Alimentos:
Efeito indesejveis

Escurecimento de frutas e vegetais


causado pelas polifenoloxidases
Rancidez de farinhas causada pela ao
de lipases e lipoxigenases
Amolecimento de tecidos vegetais
provocado pelas enzimas pcticas
Escurecimento Enzimtico
Alteraes como:

Diminuio da textura de frutas e de vegetais atividade


das enzimas pectinolticas leva a formao da massa
de tomate por exemplo;

Supermaturao das frutas deve ser evitada pelo


branqueamento;

Sucos de frutas ctricas pode provocar precipitao do


liquido;
Escurecimento Enzimtico
Escurecimento Enzimtico
Escurecimento Enzimtico
Duas enzimas so relevantes na degradao oxidativa dos
compostos fenlicos por causarem a produo de
polmeros de colorao marrom (melaninas): a
polifenoloxidase (PPO) e a peroxidase (POD)
(TOMS-BARBERN e SPN, 2001).

Funo = oxidam os polifenis a quinonas;


Escurecimento Enzimtico
Compostos fenlicos

So considerados como metablitos secundrios.

Estruturalmente contm um anel aromtico com um


ou mais grupos hidroxilas, juntamente com outros
substitutos.

A composio fenlica de frutas e hortalias varia de


acordo com a espcie, cultivo, grau de amadurecimento
e condies ambientais de desenvolvimento e de
armazenamento
Escurecimento Enzimtico
Compostos fenlicos
O tipo e a concentrao do substrato fenlico afetam diretamente o
escurecimento enzimtico, conforme afirmam MARTN-BELLOSO e
SOLIVA-FORTUNY (2006).
Escurecimento Enzimtico
Escurecimento Enzimtico
Agente causador de alterao :

ENZIMA POLIFENOL OXIDASE

Produzem quinonas
Oxidam compostos substancias que
fenlicos do alimento possuem carbonilas
(taninos e tirosina)

Geram Polimerizadas
MELANOIDINAS =
COLORAO
ESCURA
Escurecimento Enzimtico

Os sucos ctricos ricos em Vitamina C tem ao de impedir


o desenvolvimento dessa reao;

O cido ascrbico atua sequestrando o cobre, grupo


prosttico da polifenoloxidase, e reduzindo quinonas de
volta a fenis, antes de formarem pigmentos escuros
(SAPERS, G.M.; MILLER, R.L, 1998).
Escurecimento Enzimtico

ARAJO (1999) acrescenta que no tecido vegetal intacto de


frutas e hortalias tambm pode ocorrer escurecimento.
Situaes de inibio da respirao durante o
armazenamento em atmosfera controlada, o uso de
embalagem imprpria, a deficincia de cido ascrbico no
tecido vegetal, o armazenamento a frio e a radiao
ionizante.

WHITAKER e LEE (1995) acreditam que mais de 50% das


perdas em frutas ocorrem como resultado do
escurecimento enzimtico.
Escurecimento Enzimtico
MARSHALL, HIM e WEI (2000) indicaram que a alface e
outros vegetais verdes folhosos, a batata e fontes de
amido (como a batata-doce, fruta-po, inhame,
cogumelos e bananas), alm de diversas frutas e
hortalias tropicais e subtropicais so susceptveis ao
escurecimento enzimtico, causando perdas econmicas
para os agricultores.

O controle do escurecimento, portanto, torna-se crtico para


a diminuio das perdas comerciais do agricultor e para a
indstria de transformao
Escurecimento Enzimtico
Fatores que afetam o escurecimento enzimtico:

Temperatura

Modificao da atmosfera

Agentes qumicos antioxidantes

Modificao gentica caracterizar e inativar os genes


que codificam as enzimas PPO E POD.
Escurecimento Enzimtico
Alterao indesejvel:

Problema do escurecimento enzimtico sob o aspecto nutricional

Possibilidade das o-quinonas interagirem com grupos amina e


tiol, reduzindo a disponibilidade da lisina, metionina, tiamina e
outros nutrientes essenciais (ARAJO, 1999).
ALM DE ALTERAR A COR DOS ALIMENTOS

Alterao desejvel:

desenvolvimento do sabor e da cor do ch preto;


na diminuio do amargor e adstringncia dos produtos do cacau,
etc.
Escurecimento No Enzimtico
Escurecimento No Enzimtico

Escurecimento ou browning - srie de reaes


qumicas que levam a formao de pigmentos
escuros, de cor marrom melanoidinas ou melaninas
(polmeros insaturados coloridos de variada composio);

Trs mecanismos ou tipos principais de escurecimento


qumico:

A reao de Maillard;
O mecanismo do cido ascrbico ;
Caramelizao.
Escurecimento No Enzimtico

Para que essas reaes ocorram h necessidade da presena


de alguns fatores combinados como:

temperatura,
tempo,
umidade,
meio cido ou alcalino e
Componentes dos alimentos mais susceptveis a
participarem da reao.
No caso da reao de Maillard, alm da cor tem-se a
formao do aroma.
Escurecimento No Enzimtico
Escurecimento No Enzimtico
Escurecimento No Enzimtico

1- Reao de Maillard

A reao acontece quando o grupo amino de aminocidos e compostos


carbonilas de acares redutores, em especial glicose; frutose;
maltose e lactose reagem entre si quando aquecidos.

A reao abrange uma srie de segmentos onde ocorrem combinaes,


rearranjos e fragmentao de molculas, tendo como produto final as
melanoidinas (pigmento marrom), o qual tem grande influncia na
qualidade de alimentos processados. (ASHOOR & ZENT, 1984;
CHEFTEL, 1992; EVANGELISTA, 1992;)
Escurecimento No Enzimtico

1- Reao de Maillard

O incio da reao de Maillard se d com a unio dos grupos amino e


carbonila.

GLICOSILAMINA
Escurecimento No Enzimtico

1- Reao de Maillard
A partir dessa reao, se verifica:

o rearranjo conhecido como de Amadori, que a isomerizao da


glicosilamina;

a formao da base de Schiff;

a degradao de Strecker (perda de CO2) e algumas reaes


intermedirias,

formao do hidroximetil furfural (HMF),

polimerizao do HMF

Formao da melanoidina.
EVANGELISTA, 1992; CHEFTEL, 1992)
Escurecimento No Enzimtico
1- Reao de Maillard

Caractersticas:

Ocorre preferencialmente em meio alcalino;


Presena de gua e calor.

Temperatura duplicada a cada 10C entre 40 e 70C;


pH em meio cido, retarda a reao;
Velocidade da reao mxima quando em pH neutro
(pH 6,0 e 7,0);
Velocidade tambm maior para monossacardeos e com
o aminocido lisina.
Escurecimento No Enzimtico

2- Caramelizao:

Ocorre quando compostos poliidroxicarbonilados


(aucares ou certos cidos) so aquecidos em
temperaturas relativamente altas (130 a 170C).

Inicialmente sofrem desidratao;


Condensao e polimerizao formando molculas
complexas de peso variado;
Formao de aldedos muito ativos como o HMF =
confere o aroma caracterstico do acar caramelizado.

HMF sofre polimerizao - melanoidinas


Escurecimento No Enzimtico

2- Caramelizao:

em meio cido ou alcalino, o acar redutor isomeriza e


forma enol.

Numa segunda etapa em meio cido, desidrata,"encolhe"


e forma o HMF; em meio alcalino se fragmenta em
compostos lbeis.

Na terceira etapa formam-se polmeros que so as


melanoidinas de colorao escura.

So reaes auto-catalizadas pelo desprendimento


de gua, aceleradas pelo calor e umidade.
Escurecimento No Enzimtico
2- Caramelizao:

Escurecimento No Enzimtico

2- Caramelizao:

pH alcalino = menos cor


pH cido = mais cor e mais sabor
Escurecimento No Enzimtico
Escurecimento No Enzimtico
3- Mecanismo do cido ascrbico:

z O cido ascrbico tem sido considerado como o responsvel pelo


escurecimento de sucos ctricos concentrados, principalmente os de
limo e tangerina. O cido ascrbico, quando aquecido em meio cido,
origina compostos de colorao escura.

cido cido cido 2, 3


ascrbico deidroascrbico diceto - hexurnico

FURFURAL
Escurecimento No Enzimtico
z Rano oxidativo ou autooxidao

z Cadeias insaturadas dos cidos graxos se rompem

z Perxidos

z aldedos, lcool, cetonas, hidrocarbonetos

z odor desagradvel

z O Rano oxidativo acelerado por oxignio, luz, temperatura,


metais,
z enzimas (lipoxidase), presena de oxidantes naturais
Processamento de alimentos
Estudo de caso:

HIGIENE E SANITIZAO NA INDUSTRIA


DE VEGETAIS
(ANVISA)
Processamento de alimentos
Processamento de frutas e hortalias apertizadas:
Entre as operaes mais comuns podem ser citadas:
Colheita
Transporte
Seleo
Limpeza
Classificao
Branqueamento
Acondicionamento
Exausto (Calor ou Meios mecnicos)
Fechamento
Tratamento trmico (presso atmosfrica, presso elevada, temperaturas elevadas
(UHT).
Resfriamento
Empacotamento e armazenamento
Tratamento trmico do produtos apertizados (equipamentos utilizados: autoclave,
cozedor-rotativo, esterilizador hidrosttico, flash 18, esterilizao chama,
processamento assptico)
HIGIENIZAO NO PROCESSAMENTO DE PALMITO
Processamento de palmito
Formulao para 100 litros de Formulao para 100 litros de
salmoura de espera salmoura cida:
5 kg de sal de cozinha 3 kg de sal de cozinha
1 kg de cido ctrico 860 g de cido ctrico (podendo
96 litros de gua variar 150g, dependendo da
acidez inicial do palmito ao natural)
96,3 litros de gua
Exausto em banho maria
Exausto em tnel a vapor. Entrada do tnel (foto acima) e sada
do tnel (Foto abaixo).
Esterilizao
Controle de qualidade de palmito

DEFEITOS
- Alterao do pH: salmoura
- Estufamento: microrganismos
- Escurecimento: processamento
Indstria de Processamento de Alimentos

Conhecer os fundamentos tecnolgicos


comprovadamente eficientes da higiene da
matria-prima, (incluindo a gua), das superfcies
de processamento e dos ambientes de
processamento