Tcnicas de Caracterizacin y

purificacin
 hidrofobicidad

carga
Propiedades de las protenas utilizadas
para caracterizar y purificar

Carga
Tamao
Forma
Actividad biologica
Hidrofobicidad
PM
Estabilidad relativa
Solubilidad
Punto isoelectrico
 Fraccionamiento por campo elctrico
(electroforesis)

Movilidad electrofortica =

f = coeficiente de friccin = A

Para una esfera A = 6 r

V=4/3 r3

Vesp = V/PM
Electroforesis en papel
Proteinograma
Electroforesis en gel de poliacrilamida
(PAGE)

A PH = 8 - 9
 Tipos de Electroforesis

PAGE Nativa
PAGE Desnaturalizante (SDS , SDS+ condiciones reductoras, urea)
Isoelectroenfoque
Bidimensional
Electroforesis nativa
1 2 3 4
q/m = q/m = q/m = q/m

Kr

Kr

PM nativo

Efecto colador
t

t = tiempo de
incubacin a
75C
 PAGE SDS

SDS

La mayora de las protenas incorporan el SDS con una relacin constante de

masa, de ah que las molculas en SDS tengan la misma densidad de carga,
por lo tanto :

Movilidad = 1/PM
Determinacin de PM
 Isoelectroenfoque

Resolucin:
diferencia protenas
que difieren en 0.02
unidades de pH en
sus pI
Bidimensional
 Fraccionamiento basado en el coeficiente de
reparto

El coeficiente de reparto caracteriza la distribucin de una sustancia

entre dos fases: la fase mvil y la fase estacionaria
K = Cs/Cm

Fases: liquido-liquido, liquido-solido

Fase estacionaria:
Partculas de slidos
Partculas de slidos con lquido
Elucin

Contnua

Batch

Gradiente
Fases slidas y estacionarias
 Tipos de cromatografas

Intercambio inico

Tcnica independiente de la forma, tamao y PM

Soportes: Celulosa, agarosa, vinilbenceno
Antes hacer un desalado (dilisis, filtracin en gel)
En general elucin por gradiente (de PH o con agentes caotrpicos)
Gradiente de pH
Gradiente de fuerza ionica
 Filtracin molecular o Exclusin
molecular

Separa por distinto tamao molecular (cutoff o limite de exclusion)

Se puede usar para desalado
Se puede usar para estimar PM
Para purificacin se usa generalmente hacia el final
 Vt=v0+vi+vg

Vg=volumen del gel

V0=volumen por fuera de los poros (volumen de exclusion)
Vi=volumen de los poros (volumen de inclusion)

ve
 Cromatografa de fase reversa

Se basa en interacciones hidrofbicas

La fase estacionaria son generalmente compuestos alifticos de
distinta longitud de cadena (C4, C8, C16 etc)
Elucin por gradiente (usando mezclas de agua y solventes
orgnicos)
Muy alta capacidad resolutiva (mezclando distintas propiedades
fisicoquimicas)
 Cromatografa de Afinidad

Reconocimiento de ligandos
Alta resolucin y especificidad ( disminuye mucho el numero de pasos
en la purificacin)
Alto tiempo de preparacin
Fraccionamiento basado en propiedades
dinmicas
 Sedimentacin

T. Svedverg
1884-1971

La unidad Svedverg se refiere a 1 10-13 segundos

 Tipos de protocolos en sedimentacin
1. Centrifugacin en un gradiente de densidad
zonal centrifugation:
sirve para separa molculas por tamao y/o conformacin: glicerol,
sacarosa. Protenas, macromolculas

Equilibrium centrigugation:
Sirve para separar molculas que difieran en su densidad
(isopycnic centrifugation) Cl2Cs.
DNA, lipoproteinas. Tambin Ficoll, Percoll para clulas

2. Centrifugacin por velocidad:

Particularmente sensible a cambios de masa y de conformacin molecular.
Se puede determinar S y el PM
Determinacin de S
Ultracentrifugacin a
45000rpm. Se tomaron
medidas de abs a 280
cada 12 min
Determinacin del PM por sedimentacin
 Otras tcnicas basadas en parmetros
hidrodinmicos

Difusin

Viscocidad
 Tcnicas de desalado

Ultracentrifugacin
Dilisis
Columnas de desalado