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DOQ-CGCRE-008
Reviso 04 JUL/2011
DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011 Pgina 01/19
SUMRIO
1. Objetivo
2. Campo de Aplicao
3. Responsabilidade
4. Documentos Complementares
5. Siglas
6. Definies
7. Introduo
8. Validao
8.1. Planejamento da validao
8.2. Parmetros de validao
8.2.1. Seletividade
8.2.2. Linearidade
8.2.3. Faixa de trabalho e faixa linear
8.2.4. Limite de deteco
8.2.5. Limite de quantificao
8.2.6. Tendncia/recuperao
8.2.6.1. Materiais de referncia certificados
8.2.6.1.1. Erro relativo
8.2.6.1.2. ndice z
8.2.6.1.3. Erro normalizado
8.2.6.2. Ensaios de recuperao
8.2.6.3. Preciso
8.2.6.3.1. Repetitividade
8.2.6.3.1.1. Limite de repetitividade
8.2.6.3.2. Preciso intermediria
8.2.6.3.3. Reprodutibilidade
8.2.6.3.3.1. Limite de reprodutibilidade
8.2.6.3.4. Comparao da preciso entre mtodos
8.2.6.3.5. Avaliao da aceitabilidade das caractersticas de preciso de um mtodo de
anlise
8.2.6.3.5.1 Interpretao
8.2.6.3.5.2 Clculo do valor de Horwitz
8.2.6.4. Robustez
8.2.6.5. Comparaes interlaboratoriais
9. Documentao de mtodos validados
10. Documentos de Referncia
11. Histrico da Reviso
1 OBJETIVO
Este documento tem como objetivo auxiliar os laboratrios na tarefa de demonstrar que um
mtodo analtico, nas condies em que praticado, tem as caractersticas necessrias para a
obteno de resultados com a qualidade exigida.
2 CAMPO DE APLICAO
3 RESPONSABILIDADE
4 DOCUMENTOS COMPLEMENTARES
Aplicam-se as ltimas edies dos seguintes documentos:
5 SIGLAS
6 DEFINIES
Para o propsito deste documento, so adotadas as definies contidas no documento DOQ-
Cgcre-020, ABNT NBR ISO/IEC 17000, ABNT NBR ISO/IEC 17025 e no VIM.
7 INTRODUO
O laboratrio deve atender aos requisitos da ABNT NBR ISO/IEC 17025 para a seleo de
mtodos de ensaios (item 5.4.2), desenvolvimento de mtodos de ensaio pelo laboratrio (item
5.4.3), utilizao de mtodos no normalizados (item 5.4.4) e validao de mtodos (item 5.4.5).
fundamental que os laboratrios disponham de meios e critrios objetivos para demonstrar, por
meio da validao, que os mtodos de ensaio que executam conduzem a resultados confiveis e
adequados qualidade pretendida.
O laboratrio, ao empregar mtodos normalizados, necessita demonstrar que tem condies de
oper-los de maneira adequada, dentro das condies especficas existentes nas suas
instalaes antes de implant-los, no necessitando realizar os parmetros, descritos nos itens,
deste documento, referentes a seletividade (item 8.2.1), linearidade (item 8.2.2), faixa de trabalho
e faixa linear (item 8.2.3), comparao de mtodos (item 8.2.6.3.4), avaliao da aceitabilidade
(item 8.2.6.3.5) e robustez (item 8.2.6.4) e comparao da preciso entre os mtodos (item
8.2.6.3.4)desde que os parmetros de validao estejam declarados nos mtodos em questo.
Se um mtodo existente for modificado para atender aos requisitos especficos, ou um mtodo
totalmente novo for desenvolvido, o laboratrio deve se assegurar de que as caractersticas de
desempenho do mtodo atendem aos requisitos para as operaes analticas pretendidas.
8 VALIDAO
Com o objetivo de confirmar que os mtodos so apropriados para o uso pretendido, o laboratrio
deve validar:
Mtodos no normalizados;
Mtodos criados/desenvolvidos pelo prprio laboratrio;
Mtodos normalizados usados fora dos escopos para os quais foram concebidos;
Ampliaes e modificaes de mtodos normalizados.
Do mesmo modo, o responsvel pela realizao dos estudos deve ser competente na rea e
precisa ter conhecimento suficiente sobre o trabalho, sendo capaz de tomar as decises
apropriadas durante a realizao do mesmo.
Seletividade
Linearidade
Faixa de trabalho e Faixa linear
Limite de deteco
Limite de quantificao
Tendncia/recuperao
Preciso (repetitividade, preciso intermediria e reprodutibilidade)
Robustez
Os parmetros que necessitam ser calculados durante o processo de validao podem variar de
acordo com o tipo de ensaio, como mostra o quadro 1.
Tipo de ensaio
Parmetros Determinao do Anlise
Qualitativo componente (ou de elementos Propriedades
analito) em maior menores e Fsicas
teor (1) Traos (2)
Preciso
Seletividade
Tendncia / recuperao
Robustez
Sensibilidade /
linearidade / faixa de
trabalho
Limite de deteco
Limite de quantificao
Fonte: In-House Method Validation - A guide for Chemical Laboratories LGC / VAM, 2003
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8.2.1 Seletividade
b) Analisar amostras
Efeito de interferentes - a presena de Se alteram resultados,
contendo vrios interferentes
interferente acentua ou inibe a deteco ou aperfeioar o mtodo ou
suspeitos na presena do
quantificao do analito de interesse. selecionar outro mais adequado.
analito de interesse.
8.2.2 Linearidade
A maioria dos equipamentos de medio existentes estabelece a sua faixa dinmica linear.
necessrio, entretanto, verificar at que ponto a faixa de concentrao do analito coincide com a
faixa dinmica linear e assegurar que nenhum outro fenmeno tenha impacto indesejvel na
resposta.
A quantificao requer que se conhea a dependncia entre a resposta medida e a concentrao
do analito. A linearidade obtida por padronizao interna ou externa e formulada como
expresso matemtica usada para o clculo da concentrao do analito a ser determinado na
amostra real. A equao da reta que relaciona as duas variveis :
y = a + bx (1)
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sendo:
y = resposta medida (absorbncia, altura ou rea do pico, etc.);
x = concentrao;
a = interseo com o eixo y, quando x = 0;
b = inclinao da curva analtica = sensibilidade.
A parte estatstica somente uma orientao, e que o LD deva ser obtido experimentalmente, j
que, conforme descrito, o limite de deteco para um procedimento analtico pode variar em
funo do tipo da amostra e, por isso, no h uma frmula estatstica.
fundamental que avaliaes independentes sejam realizadas em amostras com concentrao
igual ao limite de deteco determinado.
O nmero de replicatas muito elevado pode superestimar o limite de deteco, por isto, este
nmero (n) deve expressar a rotina do laboratrio.
recomendado um mnimo de 7 replicatas para a determinao do LD.
Por exemplo, no caso de se analisar 7 alquotas, temos 7-1 = 6 graus de liberdade de uma matriz
de branco da amostra com adio da menor concentrao aceitvel do analito. Para esses graus
de liberdade, o valor de t unilateral, para 99% de confiana 3,143. O LD ser igual a 3,143 vezes
o desvio padro amostral.
O mtodo analtico deve ser especificado e o LD para cada analito deve ser expresso nas
unidades apropriadas, de acordo com o preconizado no mtodo analtico. A matriz da amostra
usada para determinar o LD deve ser identificada.
Matriz Determinao
LQ = X + 5s ou LQ = X + 6s ou LQ = X + 10s
Branco da amostra onde:
X = mdia dos valores dos brancos
s = desvio-padro amostral dos brancos
- Medir, uma vez cada replicata independente, a cada nvel de
concentrao.
Branco com adio de
- Calcular o desvio-padro amostral s do valor do analito, para cada
concentraes variadas do
concentrao.
analito, prximas ao LD
- Fazer o grfico concentrao versus s, e atribuir um valor para o
LQ, por inspeo.
O mtodo analtico deve ser especificado e o LQ para cada analito deve ser expresso nas
unidades apropriadas, de acordo com o preconizado no mtodo analtico. A matriz da amostra
usada para determinar o LQ deve ser identificada.
Nota: Para a anlise em nvel de traos, recomendado adotar o LQ como a concentrao mais
baixa da curva analtica.
8.2.6 Tendncia/Recuperao
Os processos normalmente utilizados para avaliar a tendncia de um mtodo so, entre outros:
uso de materiais de referncia certificados (MRC), participao em comparaes interlaboratoriais
e realizao de ensaios de recuperao.
A tendncia, quando aplicada a uma srie de resultados de ensaio, implica numa combinao de
componentes de erros aleatrios e sistemticos.
A determinao da tendncia com relao aos valores de referncia apropriados importante no
estabelecimento da rastreabilidade aos padres reconhecidos.
A tendncia pode ser expressa como recuperao analtica, definida como:
valorobservado
x 100%.
valoresperado
Esta tendncia deve ser corrigida ou demonstrada ser desprezvel, mas em ambos os casos, a
incerteza associada com a determinao da tendncia permanece como um componente
essencial da incerteza global.
Nota: A exatido avaliada numericamente atravs da tendncia.
O uso correto dos MRC consiste na sua anlise para avaliar o desempenho do laboratrio. Na
avaliao da tendncia utilizando um material de referncia certificado, os valores obtidos pelo
laboratrio mdia e o desvio padro amostral de uma srie de ensaios em replicata devem ser
comparados com os valores certificados do material de referncia. Para esta comparao podem
ser utilizados diversos critrios de deciso, entre os quais:
erro relativo;
ndice z (z-score), e
erro normalizado.
Quando o valor obtido no estiver dentro do intervalo da regio de aceitao para o valor
certificado, o laboratrio deve procurar as causas desse desvio e procurar elimin-las.
A avaliao feita com o seguinte critrio de deciso, de acordo com a ISO Guia 43:
Sendo:
Uref = incerteza associada ao MRC
Se | En | 1, ento pode ser considerado que o resultado do laboratrio adequado.
8.2.6.3 Preciso
Normalmente determinada para circunstncias especficas de medio e as trs formas mais
comuns de express-la so: por meio da repetitividade, preciso intermediria e da
reprodutibilidade, sendo usualmente expressas pelo desvio padro e coeficiente de variao.
O coeficiente de variao (CV, usualmente expresso em %), tambm conhecido como desvio
padro relativo (DPR), calculado da seguinte forma:
DP
C.V. = DPR = 100 (6)
CMD
Sendo:
DP = desvio-padro;
CMD = concentrao mdia determinada
8.2.6.3.1 Repetitividade
As condies de repetitividade podem ser caracterizadas utilizando:
Mesmo procedimento de medio;
Mesmo observador;
Mesmo instrumento usado sob mesmas condies;
Mesmo local, e
Repeties no menor espao de tempo possvel.
O nmero de replicatas para cada nvel de concentrao deve expressar a rotina do laboratrio.
r t (n-1,1- ) 2. S (7)
Sendo:
S = desvio-padro amostral associado aos resultados considerados para cada nvel de
concentrao
Caso o laboratrio obtenha resultados diferentes para r nos diferentes nveis de concentrao, o
limite de repetitividade (r) calculado de acordo com a norma ISO 5725-2.
A preciso intermediria, de acordo com a ISO 5725-3, refere-se preciso avaliada sobre a
mesma amostra, amostras idnticas ou padres, utilizando o mesmo mtodo, no mesmo
laboratrio, mas definindo exatamente quais as condies a variar (uma ou mais), tais como:
diferentes analistas;
diferentes equipamentos;
diferentes tempos.
t n
1 2 (8)
Spi( j ,k ) y jk yj
t (n 1) j 1 k 1
Nesse caso, a determinao da preciso intermediria feita por meio de t valores de n ensaios
de amostras ou padres. A preciso intermediria baseia-se na disperso entre ensaios.
recomendado que o valor t (n-1), seja, pelo menos, igual a 15.
Quando n = 2 a equao (8) toma a forma:
t
1 (9)
Si( j ,k ) . ( y j1 y j 2 )2
2.t j 1
Sendo
n
1 (10)
Si( j ,k ) ( yk y )2
n 1 k 1
em que Si (j,k) o desvio padro de preciso intermediria relativo a esse grupo, onde os
smbolos relativos s condies intermedirias de preciso podem aparecer entre parntesis (Ex:
Si (T.O) significa tempo e operadores diferentes). Este mtodo revela-se menos eficiente quando
comparado com os anteriores.
Sendo:
n = n de ensaios efetuados por amostra ou padro;
yk = cada resultado obtido;
y = representa a mdia aritmtica de cada resultado obtido.
8.2.6.3.3 Reprodutibilidade
Embora a reprodutibilidade no seja um componente de validao de mtodo executado por um
nico laboratrio, considerada importante quando um laboratrio busca a verificao do
desempenho dos seus mtodos em relao aos dados de validao obtidos por meio de
comparao interlaboratorial.
A partir do desvio padro obtido sob condies de reprodutibilidade possvel calcular o limite de
reprodutibilidade (R), o qual permite ao analista decidir se a diferena entre os valores da
duplicata das amostras analisadas sob condies de reprodutibilidade significante.
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R t (n-1,1- ) 2 . SR (11)
Sendo:
SR = desvio-padro associado aos resultados de todos os laboratrios
SR= Slab 2 + Sr 2
Onde:
Slab = mdia das varincias dos resultados de cada laboratrio
Sr = varincia das mdias dos laboratrios
O clculo da reprodutibilidade efetuado para cada nvel, separadamente, aps eliminao dos
valores discrepantes (ISO 5725-2).
No quadro 5, est apresentado um resumo da determinao da repetitividade, preciso
intermediria e reprodutibilidade.
Considerando adequada a exatido dos mtodos, quando se pretende avaliar se dois mtodos (A
e B) tem diferenas significativas entre si, em termos de preciso, pode-se recorrer ao teste F.
Este baseia-se no clculo da razo entre as varincias dos dois mtodos (Fcalc = sA2/sB2),
colocando-se a maior no numerador, de modo que a razo seja maior ou igual a 1. Em seguida,
compara-se este valor obtido com o valor tabelado de F. Se Fcalculado Ftabelado, os dois mtodos
no apresentam diferenas significativas entre si, relativamente s suas precises.
O teste t student pode tambm ser utilizado para verificar se as mdias dos resultados de dois
mtodos podem ser consideradas estatisticamente iguais.
Assim, HOR, o valor HORRAT para reprodutibilidade, o valor do desvio padro relativo (CV) da
reprodutibilidade dividido pelo valor do desvio padro relativo (CV) da reprodutibilidade calculado
a partir da equao de Horwitz, na concentrao de interesse.
8.2.6.3.5.1 Interpretao
Se os valores de HORRAT forem menores ou iguais a 2, os valores da reprodutibilidade do
mtodos podem ser considerados satisfatrios. Os laboratrios devem se assegurar de que os
mtodos que eles empregam atendem esse critrio.
8.2.6.4 Robustez
Para determinar a robustez de um mtodo de ensaio, pode-se recorrer ao teste de Youden. Trata-
se de um teste que permite no s avaliar a robustez do mtodo, como tambm ordenar a
influncia de cada uma das variaes nos resultados finais, indicando qual o tipo de influncia de
cada uma dessas variaes. Convm salientar que quanto maior for a robustez de um mtodo,
maior ser a confiana desse relacionamento sua preciso.
10 DOCUMENTOS DE REFERNCIA
AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard Methods for the Examination of
Water and Wastewater, 21st ed. Washington, 2005.
AOAC (Association of Official Analytical Chemists). AOAC Official methods of analysis.
Appendix D: guidelines for collaborative study procedures to validate characteristics of a
method of analysis. Washington: AOAC, 2002.
ASTM E178:2002 Standard Practice for Dealing With Outlying Observations.
BARRET, V.; LEWIS, T. Outliers in statistical data. 3 ed. New York: John Wiley, 1994. 604 p.
BELSLEY, D.A.; KUH, E.; WELSCH, R.E. Regression diagnostics: identifying influential data
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BROWN, M.B.; FORSYTHE, A.B. Robust tests for the equality of variances. J. Am. Stat.
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GARFIELD, F.M. Quality Assurance Principles for Analytical Laboratories. AOAC. Arlington.
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GREEN, J.M. A Practical Guide to Analytical Method Validation. Analytical Chemistry. 1996.
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GRUBBS, F. E.; BECK, G. Extension of sample sizes and percentage points for signicance
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GRUBBS, F. E. Procedures for detecting outlying observations in samples. Technometrics, v.
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HORWITZ, W. Evaluation of Analytical Methods Used for Regulation of Food and Drugs.
Analytical Chemistry, 54 (1982) 67A
HUBER, Ludwig, Validation and Qualification in Analytical Laboratories. Interpharm Press.
1999.
ISO 5725-1:1994. Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and Results -
Part 1: General principles and definitions.
ISO 5725-2:1994(1998). Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and
Results - Part 2: basic method for the Determination of Repeatability and Reprodutibility of a
Standard Measurement Method.
ISO 5725-3:1994(2001). Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and
Results - Part 3: Intermediate Measures of Precision of a Standard Measurement Method.
ISO 5725-4:1994. Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and Results -
Part 4: Basic Methods for the Determination of the Trueness of a Standard Measurement
method.
ISO 5725-6:1994(2001). Accuracy (trueness and precision) of Measurement Methods and
Results - Part 6: Use in Practice of Accuracy Values.
DOQ-CGCRE-008 Reviso 04 Jul/2011 Pgina 18/19
IUPAC; HORWITZ, W. Protocol for the design, conduct and interpretation of method-
performance studies. Pure &Appl. Chem., 67(2): 331-343, 1995.
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LEVENE, H. Robust tests for equality of variances. In: OLKIN, I.; GHURYE, S.G.;
HOEFFDING, W.; MADOW, W.G.; MANN, H.B. (Ed.) Contributions to probability and statistics.
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NATA. Technical Note 17. Format and Content of Test Methods and Procedures for Validation
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RELACRE. Guia Relacre 13. Validao de Mtodos Internos de Ensaio em Anlise Qumica.
Portugal. 2000.
SOUZA, S.V.C.; JUNQUEIRA, R.G. A procedure to assess linearity by ordinary least squares
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THOMPSON, M. Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations
in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing. Analyst, v.125, p. 385-6, 2000.
VIM - Vocabulrio Internacional de Termos Fundamentais e Gerais de Metrologia (VIM).
Traduo do documento VIM JCGM 200-2008, dezembro de 2008.
WEISBERG, S. Applied linear regression. New York: Wiley, 1985. 324 p.
WOOD, R., How to validate analytical methods. Trends in Analytical Chemistry, v. 18, n. 9, 10
September 1999, pp. 624-632(9).
Membros do Grupo Tcnico responsvel pela reviso 02: Eduardo Castello Branco T.
Guimares (Coordenador do trabalho) - UERJ / LABCON; Akie Kawakami vila - FIOCRUZ /
Biomanguinhos; Alfredo Rodriguez de Oliveira - Especialista em Qumica Ambiental; Ilse Maria
Guilhermino Lemos - Especialista em Qumica do Petrleo; Janana Marques Rodrigues
Caixeiro - INMETRO / DQUIM; Kikue Higashi - Especialista em Qumica Ambiental; Olga
Benrio Ramos Leal - INMETRO / DICLA; Patrcia Ritter Martins - PETROBRAS / CENPES,
com a colaborao de: Paulo Afonso Lopes da Silva - Ph. D., Estatstico; Renata M. Borges -
INMETRO / Dicla
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Membros do Grupo Tcnico responsvel pela reviso 03: Eduardo Castello Branco T.
Guimares - Coordenador do trabalho - IQ / UERJ; Adriane Castro Pereira - Laboratrio
Biominerais Ltda.; Akie Kawakami vila - Fundao BIO RIO; Eliane Cristina Pires do Rego
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INMETRO / DQUIM; Patrcia Ritter Martins - CENPES / PETROBRAS; Renata M. Borges
INMETRO / DICLA; Roberto Gonalves Junqueira - ALM/FAFAR /UFMG; Tnia Barretto
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