TECNICAS DE OBSERVACIN

MICROSCOPICA
 Lunes

TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCPICAS

1. Observacin en fresco
Son preferibles en las situaciones siguientes:

La morfologa de las bacterias se altera cuando se desecan y tien.

Cuando las bacterias se observan para determinar movilidad
Para observar los cambios citolgicos que ocurren durante la
divisin celular
Por este mtodo se observan fcilmente algunas inclusiones
celulares como vacuolas y materias grasa.

2. Observacin con tinciones

Para observar las caractersticas morfolgicas de las bacterias
Identificacin y diferenciacin de microbios entre especie y
dentro de la misma especie (tincin diferencial o selectiva).
 Lunes

TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCPICAS

1. Observacin en fresco
preparacin en fresco simple
preparacin en gota pendiente
2. Observacin con tinciones
Tincin simple: un solo colorante.
Tincin diferencial: ms de un colorante
Tincin especial
Tincin negativa: colorea el medio que rodea
a la bacteria permaneciendo sta sin teir.
Procedimiento para un preparado en fresco
("entre porta y cubre")

1. Colocar una gota de 2.- Tomar la muestra con el

SSF o agua en un porta asa de siembra o un gotero

Muestra

Porta objeto
 Observacin microscpica
1. Observacin en fresco
Bacterias: Leptospiras, treponemas (M.
campo oscuro)
 Observacin microscpica
1. Observacin en fresco : (SSF)
Parsitos : Trofozoitos, larvas.
 Observacin microscpica
1. Observacin en fresco
Hongos: Levaduras
 Observacin microscpica
1. Observacin en fresco con modificaciones
Hongos
NaOH 10% (hifas)
Procedimiento para un preparado en fresco
en gota pendiente
2. TINCIONES O COLORACIONES
 COLORANTE: DEFINICIN

Son compuestos orgnicos que tienen alguna

afinidad especfica por algn componente.

Los colorantes son compuestos qumicos

utilizados para aumentar el contraste
 COLORANTES: Tipos
a) Sales colorantes: ms comnmente usados
bsicos: Consisten en un catin coloreado unido a un anin
incoloro. Tien la clula bacteriana uniformemente (cidos
nucleicos y los polisacridos cidos )
(cromatina nuclear de pro y eucariotas)
(ms usados en citologa bacteriana).
Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+). la safranina, la fucsina bsica,
el cristal violeta

cidos: Tienen el catin incoloro unido a un anin coloreado.

No tien la clula bacteriana, pueden usarse como color de
contraste (coloracin negativa). Tien estructuras citoplasmticas
de las clulas eucariotas(Rx bsicas)
Ej: eosinato (-) de sodio (+),la fucsina cida y el rojo Congo.
 COLORANTES: Tipos
b) Colorantes liposolubles
Se combinan con los componentes lipdicos de
la clula, usados para revelar la localizacin de
los depsitos de grasa. Ej. Negro Sudn.
 COLORACIONES : Tipos
Vitales
Son aquellas que se practican sobre clulas que estn
vivas, mediante la introduccin de un colorante en la
circulacin de un organismo vivo.
Ejem: el verde Jano y el azul de metileno.
Supravitales
son aquellas que se realizan sobre clulas o tejidos vivos,
pero que estn aislados del organismo del que proceden.
No vitales
se realizan sobre clulas muertas.
 TCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIN COLOREADA
a) Frotis o pelcula (extensin)

b) La fijacin

c) Coloracin.
Tincin de clulas para la observacin
microscpica

Extensin de una fina capa

de clulas sobre el porta

Adicin del colorante

lavado y secado
Secado al aire

Se coloca una gota de aceite

de inmersin sobre el porta y
se observa con el objetivo de
Fijacin por flameado del porta 100X
 TCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIN COLOREADA
a) Frotis o pelcula (extensin)
Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados
 TCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIN COLOREADA
b) La fijacin:
Los microorganismos queden adheridos al portaobjeto ( coagula las sustancias proteicas)
TIPOS
CON CALOR (O MTODO DE KOCH)
FIJACIN QUMICA: alcohol metlico, formalina al 5 % (v/v), licor de Hoffman (partes iguales
de etanol absoluto y ter)

Metanol
 TCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIN COLOREADA
c) Coloracin. SIMPLE : Positiva o negativa
 Lunes
Tincin simple de azul de metileno.

Frotis y fijacin

1.- Poner una gota de agua 2.- Tomar la muestra con el 3.-Extender sobre el agua y
en un porta asa de siembra fijar a la llama del mechero

Tincin

1.- Cubrir la preparacin 2.- Lavar con agua, dejar

con Azul de Metileno 5 secar y observar al
microscopio

Micrococcus luteus
 Lunes
Tincin negativa.

1.- Colocar una gota de

Nigrosina en un porta
2.- Tomar muestra del
microorganismo con el
asa, flamear el tubo y tapar
3.- Mezclar con la
Nigrosina y extender por
todo el porta. Secar al
aire y observar

cpsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se observan como cuerpos
refringentes y espiroquetas
 Hongos
Tincin negativa
 TCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIN COLOREADA
c) Coloracin. Diferencial o compuesta
se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos

Etapas :
1. tincin primaria
2. Tincin de contraste o secundaria
- Ejemplo.: COLORACION GRAM, COLORACION DE ZIEHL-
NEELSEN, ESPORAS
 TERMINOS
Los mordientes, aunque no son
colorantes, intensifican la tincin
porque aumentan la afinidad de la
clula por el colorante. Tambin se
pueden utilizar para producir un
engrosamiento de ciertas estructuras
celulares externas, como los flagelos,
que debido a su delgadez no podran
ser visualizados de otra forma.
Diferencias en la pared celular
 Lunes

Tincin
L-3.2.3.- Tincin de Gram
Frotis y fijacin

1.- Poner una gota 2.- Tomar la muestra 3.- Extender sobre el
de agua en un porta con el asa de siembra agua y fijar a la llama 1.- Cubrir la 2.- Aadir Lugol
del mechero preparacin con (mordiente) durante 1
Cristal Violeta 2

3.- Decolorar con

4.- Lavar con agua 5.- Teir con Safranina 1 6.- Lavar con agua,
Alcohol 96 hasta que
no suelte colorante dejar secar y observar
al microscopio
 Tincin de Gram
Tincin del frotis
Previamente fijado al calor,
Paso 1 con cristal violeta
Durante 1 minuto.
Todas las clulas se tien
de color azul-violeta.

Aadir Lugol,
Paso 2 dejar actuar 2 minutos

Todas las clulas siguen

de color azul-violeta.
Gram +

Decolorar con alcohol

Las clulas Gram +
Paso 3 siguen de color azul-violeta.
Las Gram negativas
se decoloran.

Tincin de contraste
Con safranina 2 minutos.

Las clulas G+
se ven azul-violeta.
Paso 4
Las G- rosas o rojas.

Gram -
PROCEDIMIENTO COLORACION
GRAM
 Lunes

Tincin de Gram

Cocos Gram - Bacilos Gram -

 COLORACIN DE ZIEHL- NEELSEN

fundamento de esta tcnica diferencial se basa en la propiedad

de la pared celular Orden Actinomycetales. (acidos miclicos)
Resiste la decoloracin con alcohol y un cido fuerte cuando
VARIANTES
Caliente : Mycobacterium
En fro (o de Kinyoun) : Cryptosporidium, Cyclospora E
 Miercoles
Tincin de cido-alcohol-resistente.
Frotis y fijacin Tincin

1.-Poner una gota de agua 2.- Tomar la muestra de un 3.-Extender sobre el agua y
en un porta cultivo de Mycobacterium fijar a la llama del mechero

1.-Cubrir la preparacin
con Fuchina fenicada

2.-Calentar con un hisopo de

algodn empapado en alcohol 4.-Teir con Azul de
3.-Lavar con agua y Metileno 1
y prendido con la llama del
decolorar con alcohol
mechero hasta la emisin de
cido
vapores. Mantener durante 5
minutos.

5.-Lavar con agua, dejar

secar y observar al
microscopio
Tincin de esporas. Miercoles

Tincin
Frotis y fijacin

1.-Poner una gota de 2.-Tomar la muestra de 3.-Extender sobre el 1.-Cubrir la

agua en un porta un cultivo de Bacillus agua y fijar a la llama preparacin con
del mechero Verde Malaquita

5.-Lavar con agua,

2.-Calentar, con un 3.-Lavar con agua 4.-Teir con Safranina 1
dejar secar y observar
hisopo de algodn
al microscopio
empapado en alcohol
y prendido con la
Esporas
llama del mechero,
hasta la emisin de
vapores. Mantener
caliente durante 5
minutos. Bacterias
 La tincin de flagelos de Leifson
1.Se fija qumicamente la suspensin bacteriana,
mediante formol, y se hace la extensin en un
portaobjetos.
2.Se deja secar al aire, sin calentamiento alguno.
3.Se cubre la preparacin con una mezcla de cido
tnico y el colorante rosanilina, de preparacin
extempornea. El cido tnico engruesa los flagelos y
la rosanilina los tie.
4.Se retira el exceso de colorante con agua.
5. Por ltimo, se deja secar al aire, antes de su
observacin al microscopio.
 Figura 3.11Tinciones especficas. (a) La tincin de Wirtz-Conklin se utiliza para observar
endosporas. Bacilius cereus (b) La tincin de Leifson revela que este microorganismo posee
flagelos, lo cual contribuye a su identificacin como Spirillum volutans..(c) La tincin negativa
con tinta china permite observar que esta bacteria posee cpsula, lo que facilita su
identiticacin como Klebsiella pneumoniae, agente causal de la neumona.
 Tcnicas de tincin para bacterias
Tincin Uso Tcnicas
Tinciones Un colorante; proporciona contraste para Se tine con un colorante bsico (azul de metileno, cristal violeta, o fucsina
simples observar mejor un organismo completo bsica) durante unos 5 minutos. Aclarar brevemente con agua. Se tien casi
todas las bacterias; la rnayora de los tejidos no se tien.
Tnciones
diferenciales
Tincin de Gram Dos o ms colorantes; distingue entre Se cubre la preparacin de bacterias fijadas con cristal violeta y despus con
bacterias Gram positivas y Gram negativas una solucin de iodo (mordiente). Todas las clulas quedan tenidas de color
violeta oscuro. Se decolora con acetona al 95%.

Las clulas Gram positivas permanecen tenidas, pero las negativas pierden el
colorante. Se tie con safranina (contraste). El color violeta de las Gram
positivas se vuelve ms oscuro y las Gram negativas se tien de rosa.
Tincin de Dos colorantes; distingue entre las Se tien las clulas con fucsina bsica y se calienta a emisin de vapores
cido-alcohol micobacterias (cido-alcohol resistentes) y el durante 5 minutos. Todas las bacterias se tinen de rojo. Se decolora
resistencia resto de las bacterias brevemente con una mezcla de alcohol-HCl. Las bacterias resistentes
(Ziehl-Neelsen) permanecen teidas de rojo; todas las dems se decoloran. Se trata con el
colorante de contraste azul de metileno. Las bacterias cido-alcohol resistentes
continan tenidas de rojo, las otras se tien de azul.
Tinciones
especificas
Tincin de Tie selectivamente las endosporas Se cubre la preparacin con verde de malaquita y se calienta a emisin de
esporas de vapores durante 60 segundos. Se lava con agua durante 30 segundos y se tie
Wirtz-Cortitlin con safranina. Las endosporas retienen el color verde; el resto de la clula toma
el color rosa.
Tincin de Permite observar los flagelos A las clulas previamente fijadas, se le aade una mezcla de cido tnico
flagelos de (mordiente) y del colorante rosanilina. El mordiente engruesa los flagelos y el
Leifson colorante los fine.
Tincin negativa Revela la presencia de cpsulas Se utiliza tinta china o nigrosina para tenir una preparacin en fresco del
espcimen. Las particulas de colorante no pueden penetrar en la cpsula, que
se observa como una regin clara alrededor de la clula.
 Imgenes de Paramecium al mismo aumento (1000x), pero con distintos
microscopios. (a) La microscopa de campo claro permite observar la forma y las
estructuras internas de mayor tamao, como el ncleo. (b) La imagen de
contraste de fases muestra mayor detalle interno, y el caracterstico halo. (c) La
microscopa de campo oscuro revela la presencia de cilios. (d) La imagen de
Nomarsky es casi tridimensional.
 PARASITOS: Plasmodium
GIEMSA O WRIGHT
COLORACION LEISHMAN
 HONGOS
AZUL DE LACTOFENOL
T. MENTAGROPHYTES
COLORACION DE TEJIDOS
HEMTOXILINA /EOSINA
Hay alguna pregunta?
o de lo contrario

seguimos en la
prxima clase !!!