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Diagnstico laboratorial da

Aula 5 infeco pelo HIV

Em 1985, surgiu a primeira gerao de ensaios para o diagnstico da infeco pelo HIV. Esses
ensaios empregavam antgenos virais, obtidos a partir da lise viral em cultura de clulas.

A deteco de anticorpos era baseada na metodologia denominada ELISA indireto, detalhada na


imagem, a seguir.

Incubao Lavagem

Incubao Lavagem

Degradao do substrato
Reao de cor: presena de
anticorpos

Legenda
Fase slida Antgeno de HIV (Ag)
(Poo de uma placa de 96 poos) (Ligados fase slida poo da placa)
IgG Anti-HIV Substrato (S)
Presente na amostra do indivduo (Cromgeno + H2O2)

Conjugado (Conj)
Ac anti-IgG Humana + Enzima

Figura 1 Representao esquemtica de um ELISA indireto. Fonte: Telelab

Em 1986, o diagnstico laboratorial comeou a ser realizado no Brasil.

Em 1987, surgiu a segunda gerao de ensaios, que empregavam o mesmo formato indireto da
primeira gerao.

A diferena entre essas duas geraes foi a utilizao de antgenos recombinantes e peptdeos
sintticos, originados de regies especficas de protenas do vrus. A introduo de antgenos
recombinantes aumentou a sensibilidade e a especificidade dos ensaios.

No incio dos anos de 1990, o problema da variabilidade do HIV tornou-se evidente. Os ensaios
passaram a incluir antgenos para o HIV-2, com o objetivo de possibilitar o reconhecimento de
anticorpos anti-HIV-1 e anti-HIV-2. Adicionalmente, novos antgenos do HIV-1, grupos M, N e O
foram includos.

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Em 1994, surgiram os ensaios de terceira gerao, que passaram a utilizar outro formato,
denominado ELISA sanduche ou imunomtrico, detalhado na imagem abaixo.

Incubao Lavagem

Incubao Lavagem

Degradao do substrato
Reao de cor: presena de
anticorpos

Legenda
Fase slida Antgeno de HIV (Ag)
(Poo de uma placa de 96 poos) (Ligados fase slida poo da placa)
IgG Anti-HIV IgM Anti-HIV
Presente na amostra do indivduo Presente na amostra do indivduo
Conjugado (Conj) Substrato (S)
Peptdeos sintticos ou protenas (Cromgeno + H2O2)
recombinantes de HIV + enzima

Figura 2 Representao esquemtica de um ELISA sanduche


ou imunomtrico. Fonte: Telelab

A modificao do formato dos testes para ELISA sanduche ou imunomtrico tornou o ensaio
mais sensvel e especfico, pois todas as classes de anticorpos anti-HIV (IgG, IgM e IgA)
passaram a ser detectadas. Os ensaios de terceira gerao reduziram o perodo de janela
imunolgica.

A evoluo tecnolgica permitiu o desenvolvimento dos ensaios de quarta gerao. Esses


ensaios apresentam as mesmas caractersticas dos ensaios da gerao anterior, mas so
capazes de detectar, tambm, o antgeno p24.

Atualmente, uma grande variedade de mtodos manuais, semiautomatizados e automatizados,


baseados na reao antgeno-anticorpo, est disponvel para o diagnstico da infeco pelo HIV.

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Etapa de triagem da infeco pelo Notas:

HIV em laboratrios princpios 1 - fase slida superfcie


que pode ser utilizada para

metodolgicos dos testes


testes imunoenzimticos
ou fluorescentes. Incluem
materiais como placas
plsticas (poliestireno
Ensaio imunoenzimtico (ELISA) ou cloreto de polivinila),
prolas plsticas ou de
vidro, micropartculas
A sigla ELISA significa, em lngua inglesa, Enzyme Linked de ltex, de vidro ou
Immunosorbent Assay. No Brasil, so conhecidos como ensaios magnticas.
imunoenzimticos ou ELISA.
2 - espectrofotmetro
Esses ensaios apresentam uma fase slida1, que pode ser uma placa de equipamento utilizado no
plstico (poliestireno) com poos, ou prolas de plstico. mtodo ptico de leitura
de reaes que utiliza
diferentes filtros para
Atualmente os testes ELISA do tipo sanduche ou imunomtrico so determinar a presena e
(ou) a quantidade de um
muito utilizados no diagnstico da infeco pelo HIV. analito.

Descrio:

I. Na fase slida dos ELISA do tipo sanduche ou imunomtrico


esto fixados antgenos.

II. Esses antgenos ligam-se aos anticorpos (imunoglobulinas)


presentes na amostra.

III. Em seguida, adicionada uma soluo de protenas


recombinantes e peptdeos sintticos do HIV-1 e grupo O e HIV-2,
conjugadas com uma enzima.

IV. A revelao da reao ocorre pela adio de um substrato


(cromgeno e perxido de hidrognio H2O2), que produzir cor e
ser medida por um espectrofotmetro2.

V. Os resultados so determinados pela leitura da densidade tica,


obtida no final do ensaio. Cada conjunto diagnstico indica como
calcular o ponto de corte (cut off), a partir do qual as reaes so
interpretadas como reagentes, no reagentes ou indeterminadas.

Leia atentamente a bula do conjunto


diagnstico e siga rigorosamente as
instrues do fabricante.

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Observe, na figura a seguir, detalhes de um teste ELISA tipo sanduiche de terceira gerao para
pesquisa de anticorpos anti-HIV.

Incubao Lavagem

Incubao Lavagem

Degradao do substrato
Reao de cor: presena de
anticorpos

Legenda
Fase slida Antgeno de HIV (Ag)
(Poo de uma placa de 96 poos) (Ligados fase slida poo da placa)
IgG Anti-HIV IgM Anti-HIV
Presente na amostra do indivduo Presente na amostra do indivduo
Conjugado (Conj) Substrato (S)
Peptdeos sintticos ou protenas (Cromgeno + H2O2)
recombinantes de HIV + enzima

Figura 3 Representao esquemtica de um teste ELISA do tipo sanduche


ou imunomtrico de terceira gerao para deteco de anticorpos
do tipo IgG e IgM anti-HIV. Fonte: Telelab

Ensaio imunoenzimtico combinado ou ELISA combinado ou testes de 4.


gerao
Os testes ELISA de quarta gerao so capazes de detectar, simultaneamente, a presena de
antgenos e (ou) anticorpos em uma amostra.

Descrio:

I. Na fase slida, esto fixados: anticorpos contra o antgeno p24 e antgenos (protenas) do
HIV-1 (como as protenas gp160, gp120 e gp41), antgenos do grupo O e antgenos de HIV-2 .

II. A presena de anticorpos, na amostra, detectada pela adio de uma soluo de protenas
recombinantes e de peptdeos sintticos do HIV, conjugadas com uma enzima. A presena de
antgeno, na amostra, indicada pela adio de uma imunoglobulina anti-p24 conjugada a uma
enzima.

III. A revelao da reao acontece pela adio de um substrato (cromgeno e perxido de


hidrognio H2O2) que resultar na formao de cor, indicando a presena de antgenos ou de
anticorpos, na amostra. A intensidade da cor ser medida em um espectrofotmetro.

IV. Cada conjunto diagnstico indica como calcular o ponto de corte (cut off), a partir do qual
as reaes so interpretadas como reagentes, no reagentes ou indeterminadas.

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Ensaio imunoenzimtico de micropartculas (MEIA) 3 - biotina vitamina (B7)
do complexo B.
O ensaio imunoenzimtico de micropartculas, em ingls, denominado
Microparticle Enzyme Immunoassay (MEIA).

Descrio:

I. A fase slida formada por micropartculas de ltex recobertas


com antgenos do HIV (protenas recombinantes de HIV-1, incluindo
o grupo O, e de HIV-2), aos quais iro se ligar os anticorpos da
amostra.

II. As micropartculas ligam-se, irreversivelmente, a uma matriz de


fibra de vidro.

III. Em seguida, adicionado um conjugado composto de


antgenos recombinantes do HIV e peptdeos sintticos do envelope
do HIV-1 e HIV-2, ambos conjugados biotina3. Os antgenos
desse conjugado ligam-se aos anticorpos, formando um complexo
antgeno-anticorpo-antgeno.

IV. A seguir, adicionado um segundo conjugado composto de


anticorpos antibiotina conjugados com uma enzima , o qual se
liga ao complexo antgeno-anticorpo-antgeno.

V. A revelao da reao feita com a adio de um substrato


(4-Metilumbeliferil-Fosfato), que reage com a enzima, originando
um produto fluorescente (4-Metilumbeliferona), que ser medido
pelo equipamento.

VI. A presena ou ausncia de anticorpos anti-HIV-1 e (ou) anti-


HIV-2, na amostra, determinada pela intensidade da fluorescncia
obtida, comparada com o ponto de corte (cut off), a partir do
qual as reaes so interpretadas como reagentes, no reagentes
ou indeterminadas. Existem, no mercado, ensaios que utilizam a
metodologia MEIA e detectam, simultaneamente, antgeno p24 e
anticorpos anti-HIV-1 e anti-HIV-2.

Diagnstico do HIV - Aula 5 5


Veja, na figura a seguir, detalhes de um ensaio imunoenzimtico de micropartculas para pesquisa
de anticorpos anti-HIV.

Micropartculas com Ag Complexo Ag-Ac

Anticorpos da
amostra

Ag marcado
com biotina

Conjugado: anticorpo
antibiotina + fosfatase
alcalina

Substrato
4 metilumbileferil-fosfato

Degradao do substrato
produz fosforescncia

Ligao do conjugado ao
complexo Ag-Ac-Ag

Figura 4 Representao esquemtica de um ensaio imunoenzimtico de


micropartculas (MEIA) de 3. gerao. Fonte: Telelab

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Ensaio imunolgico com revelao 4 - rutnio elemento
eletroquimioluminescente (EQL) qumico metlico de
smbolo Ru, pertencente
ao grupo VIII da tabela
O ensaio imunolgico com revelao eletroquimioluminescente, em peridica, o mesmo da
platina.
ingls, denominado Electrochemiluminescence (EQL).

Descrio: 5 - estreptavidina
protena (obtida da bactria
Streptomyces avidinii)
I. A etapa inicial desta reao ocorre em meio lquido, por isso no que se liga fortemente
apresenta uma fase slida. molcula de biotina.

II. A primeira incubao consiste na mistura de:


amostra do usurio;
anticorpos monoclonais anti-p24 marcados com biotina;
antgenos recombinantes especficos do HIV marcados
com biotina;
peptdeos sintticos especficos do HIV marcados com
complexo de rutnio4;
anticorpos monoclonais anti-p24 marcados com complexo
de rutnio;
antgenos recombinantes especficos do HIV marcados
com complexo de rutnio.

III. Os anticorpos da amostra ligam-se aos antgenos marcados


com rutnio e aos marcados com biotina. Os antgenos da
amostra ligam-se aos anticorpos anti-p24 marcados com rutnio
e aos marcados com biotina. Formam, assim, complexos do tipo
sanduche (antgeno-anticorpo-antgeno e anticorpo-antgeno-
anticorpo).

IV. Em seguida, so adicionadas micropartculas revestidas com


estreptavidina5.

V. Na segunda incubao, os complexos do tipo sanduche


ligam-se fase slida, por meio da interao entre biotina e
estreptavidina.

VI. A mistura de reao aspirada para uma clula de leitura, em


que as micropartculas so fixadas, magneticamente, superfcie
de um eletrodo. Os elementos no ligados so removidos. A
aplicao de uma corrente eltrica ao eletrodo induz uma emisso
quimioluminescente, que medida por um fotomultiplicador.

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VII. A presena, ou ausncia, de anticorpos anti-HIV-1 e (ou) anti-HIV-2 ou de antgeno
p24 na amostra determinada pela intensidade da emisso quimioluminescente obtida,
comparada com o ponto de corte (cut off), a partir do qual as reaes so interpretadas
como reagentes, no reagentes ou indeterminadas.

Observe, na figura a seguir, detalhes de um EQL para o diagnstico da infeco pelo HIV.

Eletroquimioluminiscncia
Biotina Rutnio Esferas magnticas
recobertas com
estreptoavidina

Figura 5 Representao esquemtica de um ensaio imunolgico com revelao


eletroquimioluminescente (EQL) de 4. gerao. Fonte: Telelab

Ensaio imunolgico com revelao fluorescente (ELFA)


O ensaio imunolgico com revelao fluorescente, em ingls, denominado Enzyme-linked
Fluorescent Assay (ELFA).

Descrio:

I. A fase slida um cone:

a parte superior do cone recoberta com anticorpos anti-p24 e permite a deteco


do antgeno p24 da amostra;
a parte inferior do cone recoberta por antgenos recombinantes e peptdeos
sintticos (protenas) do HIV-1, incluindo os do grupo O e HIV-2 e permite a deteco
dos anticorpos anti-HIV.

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II. No cone se misturam a amostra do usurio e um reagente contendo anticorpo anti-p24
marcado com biotina. Nesta etapa, ocorre:

a lise do vrus da amostra para liberao dos antgenos p24, que se ligaro aos
anticorpos anti-p24, fixados na parte superior do cone. Os anticorpos anti-p24
marcados com biotina tambm se ligam aos antgenos p24 presentes na amostra;
simultaneamente, os anticorpos anti-HIV presentes na amostra ligam-se aos
antgenos da parte inferior do cone.
III. Em uma segunda etapa, adicionado apenas na parte inferior do cone um conjugado
composto de antgenos de HIV marcados com biotina. Esses antgenos ligam-se aos
anticorpos presentes na amostra.

IV. Na terceira etapa, adiciona-se outro conjugado composto de estreptavidina marcada com
uma enzima. Essa estreptavidina liga-se s biotinas presentes tanto na parte superior quanto
na parte inferior do cone.

V. A reao revelada com a adio de um substrato da enzima marcado com uma


substncia fluorescente. A ao da enzima sobre o substrato origina um produto
fluorescente captado e medido pelo equipamento. A intensidade da fluorescncia obtida
comparada com o ponto de corte (cut off), a partir do qual as reaes so interpretadas
como reagentes, no reagentes ou indeterminadas.

Veja, na figura a seguir, detalhes de um ensaio imunolgico com revelao fluorescente para o
diagnstico da infeco pelo HIV.

Legenda
Antgeno biotinilado Anti p24 biotinilada
Ac IgM da amostra Anticorpos anti p24 Ac IgG da amostra
Antgeno de HIV p24

Figura 6 Representao esquemtica de um ensaio imunolgico com revelao fluorescente (ELFA). Fonte: Telelab

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Ensaio imunolgico quimioluminescente (CLIA)
O ensaio imunolgico quimioluminescente, em ingls, denominado Chemiluminescent
Imunoassay (CLIA).

Descrio:

I. Os antgenos recombinantes do HIV-1, incluindo o grupo O e HIV-2, esto fixados na


fase slida poo de reao. Os anticorpos presentes na amostra ligam-se aos antgenos
fixados na fase slida, formando um complexo antgeno-anticorpo.

II. Em uma segunda etapa, adicionado um conjugado composto de antgenos


recombinantes de HIV marcados com uma enzima (peroxidase). O conjugado liga-se
especificamente aos anticorpos do complexo antgeno-anticorpo, formado durante a primeira
etapa.

III. Na terceira etapa, adicionado o substrato (um derivado do luminol e um sal percido) e
um agente de transferncia de eltrons.

IV. A reao entre o conjugado e o substrato origina um produto luminoso, captado e medido
pelo equipamento.

V. A presena ou ausncia de anticorpos anti-HIV-1 e (ou) HIV-2 na amostra determinada


pela intensidade de luz obtida numa amostra, comparada com o ponto de corte (cut
off), a partir do qual as reaes so interpretadas como reagentes, no reagentes ou
indeterminadas.

!
Vm sendo desenvolvidos ensaios que utilizam a metodologia CLIA
e detectam simultaneamente antgeno p24 e anticorpos anti-HIV-1
e HIV-2.

Veja, na figura a seguir, detalhes de um ensaio imunolgico com revelao quimioluminescente


para o diagnstico da infeco pelo HIV.

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LUMINESCNCIA

Sistema de revelao

Anticorpo

Antgeno

Figura 7 Representao esquemtica de um ensaio imunolgico


quimioluminescente (CLIA). Fonte: Telelab

Ensaio imunolgico quimioluminescente magntico (CMIA)


O ensaio imunolgico quimioluminescente magntico, em ingls, denominado
Chemiluminescent Magnetic Immunoassay (CMIA).

Descrio:

I. Combina o uso de micropartculas magnticas com a leitura da reao


quimioluminescente.

II. A fase slida formada por micropartculas magnticas recobertas por antgenos
recombinantes de HIV-1, incluindo o grupo O e HIV-2 e anticorpos monoclonais anti-p24.

III. Os anticorpos da amostra ligam-se aos antgenos recombinantes que recobrem as


partculas magnticas. Os antgenos p24 presentes na amostra ligam-se aos anticorpos
anti-p24.

IV. Em uma segunda etapa, so adicionados antgenos recombinantes de HIV-1, peptdeos


sintticos do HIV-1 e HIV-2 e anticorpos monoclonais anti-p24, marcados por um derivado
da acridina.

V. Em seguida, adicionado o substrato da enzima com perxido de hidrognio e hidrxido


de sdio.

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VI. A reao produz luz, que medida pelo equipamento.

VII. A presena ou ausncia de anticorpos anti-HIV-1 e (ou) HIV-2 ou de antgenos


determinada pela intensidade de luz obtida numa amostra, comparada com o ponto de corte
(cut off), a partir do qual as reaes so interpretadas como reagentes, no reagentes ou
indeterminadas.

Veja, na figura a seguir, detalhes de um ensaio imunolgico quimioluminescente magntico para o


diagnstico da infeco pelo HIV.

Etapa 1 Etapa 2
Mistura de micropartculas recobertas Adio do conjugado e gerao
Deteco de Anticorpos
anti-HIV-1 e Anti HIV-2

com antgenos e amostra do sinal

Micropartculas revestidas
com antgenos capturam Anticorpos da amostra
os anticorpos se ligam aos antgenos e Conjugado se liga aos
formam complexo ag-ac complexos ag-ac
Produo de Luz
Antgeno p24 de HIV
Deteco de

Formam-se complexos ac-ag


Micropartculas revestidas com
Conjugado de anti-p24 se liga
anticorpos anti-p24 capturam os
aos complexos ac-ag
antgenos da amostra

Figura 8 Representao esquemtica de ensaio imunolgico quimioluminescente magntico (CMIA). Fonte: Telelab

!
Os ensaios combinados, ou de 4. gerao, detectam a presena
da p24, na amostra do usurio. Assim, utilizam anticorpos
anti-p24 para detectar a presena desse antgeno. Por isso, nos
testes combinados, so utilizados outros antgenos do HIV-1,
como as glicoprotenas gp160, gp120 e gp41, para detectar a
presena de anticorpos, na amostra.

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