i

NDICE GENERAL

Pgina

CARTA DE APROBACIN DE TESIS i

NDICE ii

NDICE DE FIGURAS v

NDICE DE TABLAS vi

NDICE DE GRFICAS vii

DEDICATORIA viii

AGRADECIMIENTOS x

RESUMEN xiii

ABSTRACT xiv

1. INTRODUCCIN 1

2. Antecedentes 2

2.1 Caractersticas de especie 2

3. FISIOLOGA DE LA REPRODUCCIN BOVINA 3

3.1 Eje hipotlamo-hipfisis 3

3.2 Secrecin hormonal 4

3.3 Ciclo Estrual 7

3.3.1 Sincronizacin del celo 9

3.3.2 Signos de celo en la vaca 10

3.3.3 Ovulacin mltiple 11

4. DINMICA FOLICULAR 14

5. MECANISMO DE UNIN HORMONA RECEPTOR 16

5.1 Transduccin de la seal 26

5.2 Alteraciones en la estructura del gen que regula al receptor de la 30

FSH.

6. JUSTIFICACIN 37

7. HIPTESIS 38

ii
8. OBJETIVOS 38

8.1 Objetivo general 38

8.2 Objetivos especficos 39

9. MATERIALES Y MTODOS 39

9.1 Localizacin geogrfica 39

9.2 Manejo de animales 39

9.2.1 Caractersticas y manejo de los animales experimentales 39

10. OBTENCIN DE ADN SANGUNEO, AMPLIFICACIN Y TIPIFICACIN 41

DEL LOCUS DE FSHR

10.1 Manejo del animal y obtencin de muestra 41

10.2 Fase de lavado y extraccin de clulas 42

10.3 Integridad de ADN 43

10.4 Cuantificacin de ADN 44

10.5 Tcnica de espectrofotometra 44

10.6 Protocolo para PCR 45

10.7 Digestin de FSHR 47

11. INDUCCIN DE OVULACIN MLTIPLE 48

11.1 Sincronizacin del estro 48

12. ANALISIS ESTADSTICO 49

12.1 Variabilidad gentica (ley del equilibrio de Hardy Weinberg) 49

12. Induccin de ovulacin mltiple. 50

13. RESULTADOS 51

13.1 Extraccin de ADN genmico 51

13.2 Amplificacin del gen FSHR por PCR 52

13.3 Determinacin del polimorfismo de FSHR (RFLP) 52

13.4 Prueba de equilibrio de Hardy Weinberg 54

13.4.1 Frecuencias genotpicas para el total de la muestra 54

13.4.2 Polimorfismo gnico por raza 55

iii
13.5 Evaluacin de las frecuencias gnicas mediante la prueba del 56
equilibrio de Hardy Weinberg para cada raza

13.6 Evaluacin de la respuesta a la induccin de ovulacin mltiple 56

14. DISCUSIN 60

14.1 Variabilidad gentica 60

14.2 Respuesta a la ovulacin mltiple 65

14.2.1 Cuerpos lteos como respuesta a la ovulacin mltiple 65

14.2.2 Efecto de las variables allicas sobre la respuesta a la 68

ovulacin mltiple

15. CONCLUSIONES 72

17. PERSPECTIVAS 73

18. BIBLIOGRAFA 75

19. PGINAS ELECTRNICAS 108

20 ARTCULO 113

iv
NDICE DE FIGURAS Pgina

1. Cambios hormonales durante el ciclo estrual bovino 7

2. Ondas foliculares durante el ciclo estrual 15

3. Diferenciacin temprana de las clulas de la granulosa durante la 17

foliculognesis preantral

4. Papel potencial intrafolicular de inhibina, activina y folistatina 20

secretadas por las clulas de la granulosa como respuesta al estmulo
de FSH

5. Ruta de transduccin de la seal de la FSH en las clulas de la 21

granulosa del folculo dominante

6. Estructura de la hormona folculo estimulante (FSH) 22

7. Unin del receptor de FSH a la hormona 23

8. Receptor de siete transmembranas 25

9. Diferentes sitios de glicolizacin 26

10. Transduccin de la seal 29

11. Gen que regula al receptor de FSH humano 31

12. El gen que regula al receptor de FSH bovino se encuentra en el 32

cromosoma 11

13. Fragmento del ADN de FSHR bovino correspondiente a las 33

transmembranas tres a siete del exn 10

14. Mutacin 34

15. Fragmento del FSHR bovino correspondiente a las transmembranas 46

tres a siete del exn 10

16. Sitio corte de la enzima AluI dentro del segmento amplificado del gen 48
FSHR

17. Fragmentos amplificados de 306 pb de gen FSHR. Electroforesis en gel 52

de agarosa al 1.8%

18. Digestin con enzima AluI en gel de agarosa al 2.5%. Pesos 53

encontrados (pb), Carril (M) marcador 100 pb, carril (C) vacas Ceb y
carril (H) vacas hbridas de Ceb

19. Digestin con enzima AluI en gel de agarosa al 2.5%. Pesos 53

encontrados (PB), Carril (M) marcador 100 pb, carril (C) vacas Ceb,
carril (H) vacas hbridas y carril (S) vacas Suizas europeas

20. Digestin con enzima AluI en gel de agarosa al 2.5%. Pesos 53

encontrados (pb): Carril (M) marcador 100pb, carril (S) vacas

v
 Suizas europeas

NDICE DE TABLAS
Pgina

1. Mtodo de integridad de ADN 43

2. Protocolo de amplificacin de FSHR 45

3. Nomenclatura de enzima de restriccin 47

4. Valores promedio EE del nmero de cuerpos lteos de los 56

animales que tuvieron respuesta a la ovulacin mltiple

5. Valores promedio del nmero de cuerpos lteos por raza 57

6. Resultados de la raza con la respuesta a OM (CL) 58

7. Valores promedio del nmero de cuerpos lteos por genotipo 58

8. Resultados del factor alelo con la respuesta a induccin de OM 59

(CL)

vi
INDICE DE GRFICAS Pgina

1. Frecuencias genotpicas dentro de la poblacin estudiada 54

2. Frecuencias gnicas dentro de la muestra estudiada

54
3. Alelos observados en cada raza
55
4. Frecuencias genotpicas por raza
55
5. Valores mximos y mnimos de cuerpos lteos como respuesta a
la induccin de ovulacin mltiple (OM) por raza 57

6. Valores mximos y mnimos de cuerpos lteos como respuesta a

la induccin de ovulacin mltiple (OM) por alelo encontrado 59

vii
 DEDICATORIA

Mi profundo agradecimiento:

A mis padres: Hctor Manuel Hernndez Gonzalez ()

Bertha Cruz de Hernndez,
a quienes debo todo lo que soy.

A mis hermanos, Hctor, Carlos (),

Charo, Blanca y Laura, por su
comprensin y apoyo.

A Mariana, por el paciente tiempo de espera

viii
 Dedicado con infinito agradecimiento a todas las pequeas y
grandes criaturas del mundo animal, que forman parte de la
maravillosa biodiversidad de este planeta tierra, por haberme
permitido compartir su entorno y para quienes pido que los humanos
algn da tengamos la suficiente conciencia para aprender a
respetarlos y a cuidar y amar todos y cada uno de sus hbitats, que al
final tambin son los nuestros

Agradezco a los animales que contribuyeron en este trabajo y a

los que da a da lo hacen para que los humanos alcancemos una vida
mejor

ix
 AGRADECIMIENTOS

A mi Comit Tutorial:

Dra. Patricia Cervantes Acosta, a quien agradezco el apoyo

incondicional, su experiencia en el laboratorio de Biologa Molecular,
parte fundamental de este trabajo, sus consejos y gua y sus palabras
suaves y fuertes, pero siempre necesarias para lograr la meta.

Dr. Rodolfo Canseco Sedano y Dr. Felipe Montiel Palacios, quienes con
entusiasmo y compromiso creyeron y trabajaron en este proyecto,
brindando su tiempo, esfuerzo y dedicacin para lograrlo.

Dr. Apolo Carrasco Garca, por el valioso tiempo invertido en este

trabajo, por sus consejos oportunos, por el tiempo de revisiones
interminables y por haberme alentado siempre en los momentos
difciles.

Dr. Miguel ngel Camacho Pernas, quien fue la parte medular en el

xito obtenido, por su Gua, por haber aportado su valiosa experiencia
durante los aos que compartimos este trabajo.

x
Al Instituto de Neuroetologa de la Universidad Veracruzana, por la
oportunidad brindada para realizar mis estudios de Doctorado.

A la facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad

Veracruzana, por las facilidades brindadas para la realizacin de este
trabajo.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACYT), por la beca

otorgada para realizar los estudios de Doctorado.

Al MVZ. MSc. Carlos Lamothe Zavaleta, Director de la Facultad de

Medicina Veterinaria y Zootecnia por el apoyo brindado.

Al Ing. Miguel Garca Requena, Propietario de la finca Oluta por

facilitar a los animales experimentales.

Al Campo Experimental La Posta del INIFAP, Paso del Toro Veracruz

por facilitar a los animales experimentales.

Al Dr. Antonio lvarez Martnez Investigador del Sistema Nacional

de Investigadores y al CENID-PAVET (INIFAP) Cuernavaca, Morelos,
por haberme brindado su experiencia y la oportunidad de
complementar este trabajo en el laboratorio de Biologa Molecular del
rea de Babesia, a la MC. Carmen Rojas Martnez, Tcnico de
laboratorio, por el apoyo y conocimientos brindados, a la Dra. Raquel
Coso, por su apoyo en el anlisis computacional de la secuencia del
ADN del Gen.

A los Drs. Antonio Hernndez Beltrn y Genaro Coria vila, por su

valioso aporte en este trabajo y por su participacin como Sinodales en
los exmenes finales.

Al Ing. ME. Rubn Garca Gonzlez y MVZ. EPA. Francisco Velzquez

Sarmiento por su valioso apoyo en el Anlisis estadstico. Al Dr.
Belisario Domnguez Mancera por sus consejos y apoyo en la
comprensin estadstica de este trabajo.

xi
Al grupo de mujeres trabajadoras, comprometidas dedicadas y
excelentes amigas, que brindaron todo su apoyo, consejos y cario en
los momentos buenos y malos:
QFB. ME. Irma Lievana Guevara, MVZ. MCA. Nelly Ibarra Priego,
MVZ. MC. Maria Luisa Robledo Salinas, MVZ. M.C. Margarita
Robledo Salinas, Dra. Dora Romero. MVZ. MC. Mara Esther Muoz
Prez, Dra. Lorena Lpez de Buen, MVZ. MCA. Mara Luisa Mndez
Ojeda, Dra. Concepcin Ahuja Aguirre.

A mis compaeros y amigos de la vida, quienes con el lema nunca te

detengas siempre brindaron su apoyo incondicional:
MC. Thelma Basurto Santos, Dra. Bertha Rueda Maldonado, MC. Luis
A. Landn Grandvallet, MVZ. Jorge Chvez Mndez.

Mis compaeros y amigos de la facultad:

MVZ. Jos Alberto Mndez Santos, MC. Armando Lpez Guerrero, MC.
Roberto Castillo Tlapa, MC. Lupita Vega, MC. Nelly Cisneros Rubio.
MC. Rosa Mara Cordero.

xii
Resumen

El objetivo de este estudio fue determinar el polimorfismo del gen del receptor de FSH
(FSHR) en bovinos, y su relacin con la respuesta ovrica a la induccin de ovulacin
mltiple. Se utilizaron 45 hembras bovinas divididas en tres grupos de acuerdo a su
genotipo: 1) Bos taurus (n=15), 2) Bos indicus (n=15) y 3) e hbrido (Bos taurus Bos
indicus, n=15). La caracterizacin del locus FSHR fue mediante PCR-RFLP a partir de ADN
sanguneo, y el genotipado se hizo por digestin con AluI. El equilibrio de Hardy Weinberg
(HW) se evalu mediante 2. Para el tratamiento de induccin de ovulacin mltiple se
utiliz FSH en dosis decreciente a partir del da 10 del ciclo estrual en todas las vacas.
Para el anlisis de la respuesta por genotipo se utiliz la prueba de Kruskal Wallis. Los
genotipos identificados fueron AA (243 y 63 pb), AB (306, 243 y 63 pb) y CC (243 y 150
pb) con una frecuencia genotpica de 0.511, 0.222 y 0.267, respectivamente. Las
frecuencias allicas A, B y C fueron 0.622, 0.111 y 0.266, respectivamente. No se
encontr equilibrio de HW (P<0.05) en el total de la poblacin. El anlisis por razas
demostr que los hatos Bos indicus e hbrido s se encuentran en equilibrio de HW
(P>0.05). El hato Bos taurus no mostr equilibrio de HW (P<0.05), y en estas hembras
se encontr el alelo C, no observado en los grupos Bos indicus e hbrido. Los resultados
para el anlisis de los alelos A, B y C con la variable de respuesta nmero de cuerpos
lteos (CL) a la palpacin rectal, mostraron que el genotipo AB es diferente con respecto
a los genotipos A y C (P<0.05), sin diferencia entre A y C (P<0.05). El genotipo AB
correspondiente a los grupos Bos indicus e hbrido respondi de manera menos eficiente
(3.8 1.3 CL) que los genotipos AA (9.1 1.9 CL) y CC (12.3 1.3 CL). En conclusin,
la variabilidad polimrfica del gen FSHR afect la respuesta a la ovulacin mltiple, la cual
entonces depende del genotipo.

xiii
Abstract

The aim of this study was to determine the polymorphism of the FSH receptor (FSHR)
gene in cattle, and its relationship with the ovarian response to induction of multiple
ovulation. Forty-five cows were divided into three groups according to their genotype: 1)
Bos taurus (n=15), 2) Bos indicus (n=15) and 3) hybrid (Bos taurus Bos indicus,
n=15). The characterization of the FSHR locus was made by PCR-RFLP from blood DNA,
and the genotyping was made by digestion with AluI. The genotypes were determined
through digestion with AluI. Hardy Weinberg (HW) equilibrium was assessed by 2. FSH in
decreasing doses was used for the induction of multiple ovulation, starting on day 10 of
the estrous cycle in all the cows. The Kruskal Wallis test was used to analyse the
genotype response. The identified genotypes were AA (243 and 63 pb), AB (306, 243 and
63 pb) and CC (243 and 150 pb) with a genotypic frequency of 0.511, 0.222 and 0.267,
respectively. Allelic frequencies A, B and C were 0.622, 0.111 and 0.266, respectively.
HW equilibrium (P<0.05) was not found in the whole population (46.4). The breed
analysis showed that the Bos indicus and hybrid groups are in HW equilibrium (P>0.05).
The Bos taurus herd showed no HW equilibrium (P<0.05). Allele C was found in the Bos
taurus cows but not in the Bos indicus and hybrid groups. The results for the analysis of
alleles A, B and C with number of corpora lutea (CL) at rectal palpation as the response
variable showed that genotype AB is different from genotypes A and C (P<0.05), with no
difference between A and C (P<0.05). The genotype AB from the Bos indicus and hybrid
groups had a less efficient response (3.8 1.3 CL) than genotypes AA (9.1 1.9 CL) and
CC (12.3 1.3 CL), which suggests that the polymorphism may affect the response. In
conclusion, the polymorphic variability of the FSHR gene affected the response to multiple
ovulation, which then depends on the genotype.

xiv
1. INTRODUCCIN

La hormona folculo estimulante (FSH) es esencial para la funcin reproductiva de los

animales ya que inicia y mantiene la espermatognesis en machos y el desarrollo folicular
en hembras a travs de un receptor especfico (FSHR) localizado en la superficie celular
de las gnadas (Ulloa-Aguirre et al., 2007).

El FSHR es homlogo al de otras hormonas glicoproteicas y al formar el complejo

hormona receptor inicia una cadena de reacciones intracelulares caractersticas de las
protenas G acopladas a receptores, que activan la va del AMPc (adenosin monofosfato
cclico), la estimulacin adenil ciclasa y la fosforilacin de protenas especficas (Yanofsky
et al., 2006).

La funcin de la FSH, su receptor y el gen que lo regula, juegan un papel clave en la

fisiologa reproductiva bovina. La estructura del gen que codifica para FSHR est
determinada por 10 exones y 11 intrones. Los primeros 9 exones encierran el dominio
extracelular mientras que el exn 10 encierra el dominio transmembranal (Houde et al.,
1994). La identificacin de mutaciones en este gen, que activan o inactivan su funcin,
ampli la comprensin del papel de esta hormona en la gametognesis.

La mayora de los estudios al respecto se realizaron en humanos (Simoni et al., 1997;

Simoni et al., 1999), donde se logr identificar a las variantes allicas del gen, dejando
claro que FSHR es polimrfico, lo que afecta la respuesta hormonal ovrica. Los
polimorfismos en animales domsticos se relacionan a fenotipos reproductivos y son
importantes como marcadores de rasgos de inters econmico en el cido
desoxirribonucleico (ADN) en una poblacin (Montaldo y Meza-Herrera, 2009).

Se sabe que las variantes allicas del gen de FSHR tienen un impacto fisiolgico sobre la
reproduccin, y an cuando no es muy claro su papel en el bovino, se busca ampliar el
conocimiento en esta especie. Por tal razn, el objetivo del presente trabajo fue
caracterizar el polimorfismo de FSHR en tres razas de bovinos en el trpico de Veracruz,
el efecto de su variabilidad allica del gen de FSHR con la respuesta a tratamientos de
ovulacin mltiple (OM) y demostrar la importancia del uso de marcadores moleculares
en las estrategias de mejoramiento gentico.

1
2. ANTECEDENTES

2.1 Caractersticas de especie

El concepto especie se define como el grupo de animales con caractersticas comunes que
se transmiten sin variacin de una generacin a otra. Las especies de ganado bovino se
clasifican en dos grupos: 1. Grupo europeo o Bos taurus, y 2. Grupo indopaquistano o Bos
indicus. Los animales de ambas especies se diferencian por sus caractersticas genotpicas
y fenotpicas, las que adems se utilizan para determinar el tipo de produccin en el que
sern utilizados (Gasque y Posadas, 2001).

En la nomenclatura clsica, se considera al grupo taurus e indicus como especies

distintas, aunque diversos autores han sugerido que son subespecies (Villegas et al,
2001). El comportamiento de ambos grupos es diferente en cuanto a su produccin y
fisiologa reproductiva (Aguirre et al., 2006). Las razas del grupo europeo son numerosas
y se distinguen dos subgrupos, las de produccin crnica y lechera, siendo estas ltimas
las ms productivas como resultado de una mayor aplicacin de ciencia y tcnica para su
crianza y desempeo, asociado a un hbitat climtico favorable (Dewey y Ng, 2001).

Las razas del grupo Bos indicus tienen una gran aceptacin en los pases tropicales de
Latinoamrica, por su fcil adaptacin a estas condiciones ambientales. Con la adopcin
de avances tecnolgicos, estas razas muestran un incremento en su productividad sin
compararse en rendimiento con las europeas. Por su capacidad de adaptacin a las
condiciones extremas del trpico, es la que prevalece a pesar de presentar una eficiencia
reproductiva inferior (Aguirre et al., 2006).

Con respecto a la fisiologa reproductiva del Bos indicus, Baca et al. (1998), reportaron
intervalos parto-primer servicio de 100 das, intervalos parto concepcin muy cercanos a
los 150 das e intervalos entre partos de ms de 450 das, lo que indica que a pesar de
utilizar programas asistidos con inseminacin artificial (IA) para mejorar la eficiencia
reproductiva, el rendimiento reproductivo del ganado en el trpico est influido
negativamente por factores que impiden la expresin del potencial gentico. En el trpico,
la variable fertilidad que exhiben los genotipos Bos indicus es una limitante que dificulta
la implementacin de los programas de transferencia de embriones (TE), adems, las

2
diferencias fisiolgicas y de comportamiento entre animales Bos indicus y Bos taurus
influyen decisivamente en el xito de los programas (Baruselli et al., 2006).

Las cruzas de ambas especies producen conjuntamente carne y leche y se utilizan para
aumentar la productividad del ganado. Actualmente, en el trpico el 50 a 60% de
cruzamientos corresponden a Bos indicus/Bos taurus, la eleccin depende del manejo
particular de la explotacin, pasto disponible y condiciones medioambientales. Sin
embargo, se observa que en la mayora de las regiones tropicales existe todava un
elevado porcentaje de programas reproductivos basados en monta natural, a pesar de
que las tcnicas reproductivas como la OM brindan la oportunidad de acelerar el avance
gentico al detectar vacas genticamente superiores, que brindan a la industria bovina la
oportunidad de utilizar material gentico de alta calidad (Segura y Montes 2001).

3. FISIOLOGA DE LA REPRODUCCIN BOVINA

3.1 Eje hipotlamo-hipfisis

El hipotlamo ocupa una porcin del diencfalo que forma el piso y parte de la pared
lateral del tercer ventrculo. Comprende el quiasma ptico, los cuerpos mamilares, el
tuber cinereum y el infundibulum (Ramirez, 2006). El tuber cinereum es la parte del piso
del tercer ventrculo que se extiende desde abajo hacia el infundibulum. La eminencia
media est integrada por la parte inferior del tuber cinereum la cual contiene una gran
cantidad de vasos sanguneos que drenan hacia el tallo hipofisiario y que luego
desembocan para descargar en un plexo secundario en la hipfisis anterior (Ojeda e
Icardo, 2006). Las neuronas hipotalmicas tambin funcionan como clulas endcrinas,
las que sintetizan pptidos y sus axones terminan en una red capilar, con lo que sus
productos secretorios son liberados directamente hacia la sangre (Levy, 2006).

En el hipotlamo las neuronas se agrupan en ncleos hipotalmicos que se caracterizan

por estar dispuestos de manera simtrica alrededor del tercer ventrculo, entre ellos se
encuentran los nucleos dorsomedial, posterior, ventromedial, arcuato, supraquiasmtico,
supraptico, anterior y paraventricular. La parte endcrina del hipotlamo se localiza en
el sistema neurosecretorio parvocelular, el que contiene neuronas secretorias
dopaminrgicas que regulan la funcin de la hipfisis anterior (Sanders, 2004). Las
neuronas productoras de hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH) estn reguladas

3
por neuronas aferentes distintas, por accin de varios neurotransmisores (incluyendo
norepinefrina, cido gamma-aminobutrico [GABA] y glutamato, entre otros). Los
agonistas adrenrgicos facilitan la liberacin de GnRH, mientras que los opiceos
endgenos la inhiben, los estrgenos aumentan la cantidad de receptores de GnRH y los
andrgenos la reducen (Bulum y Addashi, 2009).

Existen dos centros anatomofisiolgicos que secretan GnRH y que controlan la secrecin
de gonadotropinas: el que controla la secrecin preovulatoria de hormona luteinizante
(LH) y GnRH y se encuentra en el rea hipotalmica anterior, los ncleos prepticos y
supraquiasmticos, y los que controlan la secrecin tnica de LH y FSH, que se localizan
en el nucleo ventromedial, ncleo arquato y la eminencia media (Bulum y Addashi, 2009).
El hipotlamo regula diversos procesos vitales y acta como un centro de procesamiento
e integracin de la informacin recibida, y luego de traducirla, reacciona produciendo
hormonas liberadoras especficas (Sanders, 2004).

El hipotlamo y la hipfisis anterior en conjunto con los rganos reproductivos, aseguran

el ritmo de reproduccin, interrelacionando hipotlamo, hipfisis, ovario, hormona LH,
FSH y esteroides ovricos, para asegurar la maduracin folicular, ovulacin, implantacin
y mantener la gestacin, aspectos claramente influenciados por factores hereditarios,
nutricionales y ambientales que pueden modificar el ciclo en cualquier animal (Prieto y
Velzquez, 2002).

3.2 Secrecin hormonal

Las hormonas necesitan ser secretadas desde las clulas donde son sintetizadas para
ejercer su accin biolgica, aunque tambin pueden presentar una actividad parcrina y
autcrina y sufrir modificacines postranslacionales, las cuales ocurren en determinados
compartimientos subcelulares y son llevadas a cabo en una estricta sucesin de eventos
intracelulares, que dan origen a productos biolgicamente activos (Echeverras, 2006).

La produccin de hormonas reproductivas es controlada por un sistema de

retroalimentacin negativa, usualmente a travs de la interaccin del hipotlamo con la
hipfisis y sus rganos blanco (Hafez, 2002). Las caractersticas de este eje hormonal
dejan poco margen de error, sin embargo, se ha reportado para diferentes especies una

4
frecuencia elevada de alteraciones del ciclo reproductivo debidas a fallas en la interaccin
del mismo (Simoni et al., 1997; Rosell et al., 2003).

La GnRH es una hormona peptdica responsable de la liberacin de FSH y de LH de la

hipfisis anterior (Levy, 2006). La GnRH sintetizada y liberada en las neuronas
hipotlamicas es considerada una neurohormona, es decir, una hormona producida en
una clula neuronal y liberada en sus terminales neuronales situadas en la regin externa
de la eminencia media, donde es almacenada antes de ser liberada por extrusin del
contenido de los grnulos secretorios hacia el sistema portal (Bulum y Addashi, 2009).

De esta manera, la GnRH es liberada en forma de pulsos en el torrente sanguneo portal

hipofisiario y la circulacin portal la lleva a la glndula hipfisis, donde se une a su
receptor localizado en la membrana plsmtica de las clulas gonadotrpicas productoras
de FSH y LH, llamadas gonadotropos, los que en consecuencia, tambin las secretan en
forma pulstil (Bulum y Addashi, 2009). Las rutas neurosecretorias de GnRH incluyen las
neuronas del grupo medio basal que alcanzan la red primaria de capilares del sistema
portal hacia el cual la neurohormona es liberada y llevada a la hipfisis anterior; la GnRH
tiene una vida media plasmtica de tres a seis minutos (Ascoli y segaloff, 1996).

La hipfisis es un rgano glandular, pequeo y rojizo, situado en la silla turca y pendiente

del cerebro por un pedculo y tallo pituitario. Consta de un lbulo anterior y uno posterior
que se unen en la pars intermedia (Rubio, 2006). El lbulo anterior es la porcin ms
grande y est formado por cordones anastomosados, limitados por una lmina basal y
separados por capilares y espacio perivascular con cantidades variables de tejido
conectivo, estos cordones poseen varios tipos de clulas, algunas situadas en la periferia
(Sanders, 2004).

No existe inervacin funcional significativa desde el hipotlamo o la neurohipfisis y en

cambio existe una ruta humoral va sistema porta hipotalmico-hipofisiario que provee las
seales necesarias para la comunicacin entre el hipotlamo y la hipfisis (Bulum y
Addashi, 2009).

La hipfisis es una glndula de sntesis y almacenaje, y sus clulas responden a efectos

estimulantes o inhibitorios, que por accin del AMPc activan el nivel de sntesis y la
liberacin por exocitosis, as como cambios en la fosforilacin de ciertas protenas

5
especficas al interior de la membrana celular, en los grnulos secretorios y en la
membrana plasmtica (Prieto y Velzquez, 2002). En el caso de las clulas secretorias de
FSH y LH, la mayora produce y libera ambas gonadotropinas y solo un pequeo nmero
libera alguna de las dos. El receptor de la GnRH (GnRHR) es un receptor con siete
dominios transmembranales acoplados a protenas G, que estimula la isoforma beta de la
fosfolipasa C fosfoinositida, la cual moviliza el calcio y activa la adenilciclasa y el AMPc. La
GnRH aumenta tambin la formacin de nueva GnRH estimulando la transcripcin del
RNAm especfico. Esto resulta en la activacin de protenas implicadas en la sntesis y
secrecin de las gonadotropinas LH y FSH (Gonzlez y Gonzlez, 2006).

Las hormonas gonadotrpicas actan al unirse a receptores especficos en el rgano

blanco. Sin embargo, existen informes de cambios estructurales en los genes de
receptores hormonales, los cuales tienen resultados no deseables en programas
reproductivos (Adashi y Hennebold, 1999), probando as que muchos de los trastornos
reproductivos son de origen gentico y afectan al ovario. En bovinos, Mapletoft et al.
(2002) reportaron una amplia variabilidad en la respuesta del eje hipotlamo-hipfisis-
gnada al estmulo hormonal, tanto de origen fisiolgico o utilizando diferentes
tratamientos para la induccin de OM.

El ovario se encuentra en un estado de aparente quietud o latencia hasta la pubertad,

cuando el animal alcanza el tamao y peso adecuados para enfrentar un estado de futura
madurez sexual o inicio del ciclo reproductivo, el cual es coordinado por las hormonas
FSH y LH, responsables de controlar la funcin ovrica, siendo la FSH esencial para la
funcin reproductiva normal, esto es, para el desarrollo folicular en las hembras y el logro
de una maduracin sexual normal (Pearly et al., 2002).

A nivel ovrico la FSH se une a los receptores que se encuentran expresados en la

membrana de las clulas de la granulosa regulando varias fases de la maduracin
folicular en respuesta a la liberacin peridica de FSH hipofisiaria (Simoni et al., 1997;
Dierich et al., 1998). Por su parte, la LH induce la ovulacin y luteinizacin de las clulas
de la granulosa y teca del ovario en donde se liberan los estrgenos, producidos por los
folculos y la progesterona secretada por el cuerpo lteo. As entonces, FSH y LH regulan
el ciclo reproductivo a travs de una serie de mecanismos de retroalimentacin que
actan sobre el hipotlamo y la hipfisis (Hafez, 2002; Gonzlez y Gonzlez 2006).

6
3.3 Ciclo estrual

En la hembra bovina el ciclo estrual tiene una duracin promedio de 21 das y se divide
en dos fases: folicular (proestro y estro) y luteal (metaestro y diestro) (Callejas, 2004).
La duracin del celo es aproximadamente de 12 a 16 h (Whittier, 2003), y la ovulacin
ocurre de 10 a 15 h despus del final del celo (Hafez, 2002). La fase folicular dura
aproximadamente 2 a 4 das y comienza en realidad al final del ciclo que la antecede, con
un aumento significativo y progresivo de los niveles circulantes de FSH, comprendiendo
las etapas de desarrollo y maduracin folicular foliculognesis. La fase ltea del ciclo
dura aproximadamente 18 das (Hafez, 2002) (Figura 1).

Progesterona

Estrgeno

LH
FSH

II

III

instruction.cvhs.okstate.edu/.../fr/HiFRp15.htm)

Figura 1. Cambios hormonales durante el ciclo estrual bovino. Primer panel, cambios en
hormonas secretadas por la Hipfisis, FSH y LH y en ovario, Estrgeno y Progesterona.
Segundo panel, cambios que ocurren en el ovario. Tercer panel indica el da del ciclo y
cuarto panel muestra los eventos que ocurren en las paredes uterinas.

La FSH es secretada en ondas a lo largo del ciclo, desempea un papel fundamental que
permite el crecimiento de un grupo de folculos, las hembras Bos taurus y Bos indicus

7
presentan generalmente dos a tres ondas de crecimiento folicular en su ciclo estrual,
variabilidad que no tiene relacin con la raza, edad y con el nivel de fertilidad de las
mismas (Mapletoft et al., 2002). El nmero de ondas de crecimiento folicular durante el
ciclo estrual es determinado por la longitud de la fase luteal (Gigli et al., 2006).

En los ciclos estruales de dos a tres ondas, la emergencia de la primera onda folicular
ocurre generalmente alrededor del da de la ovulacin. La emergencia de la segunda onda
ocurre en el da 9 a 10 para los ciclos de dos ondas y el da 8 a 9 para los de tres ondas.
En los ciclos de tres ondas, esta onda emerge en el da 15 a 16. En las ondas foliculares
anovulatorias, los folculos experimentan regresin sin ovular.

El folculo dominante presente en el inicio de la lutelisis ser el folculo dominante

ovulatorio y la emergencia de la prxima onda (primera del nuevo ciclo) se demorar
hasta el momento de la ovulacin. La primera, segunda y tercera onda folicular se
observan durante las fases luteal temprana, luteal media y folicular, respectivamente
(Ginther et al., 1997).

En las ondas foliculares no ovulatorias las concentraciones de estradiol circulante se

mantienen bajas y a pesar de que el folculo puede alcanzar el tamao preovulatorio, el
folculo dominante no logra las caractersticas funcionales preovulatorias tales como la
produccin de estradiol (Gigli et al., 2006).

El folculo dominante (folculo estrognicamente activo) de la ltima onda contina su

crecimiento y la biosntesis de estradiol hasta que se alcanza el nivel suficiente de
estradiol circulante para producir la retroalimentacin (feedback) positiva sobre el rea de
control cclico del hipotlamo, que aumenta los pulsos de GnRH/LH/FSH e induce el pico
preovulatorio de LH y FSH y por lo tanto, el proceso de la ovulacin (Hafez, 2002).

El mecanismo que regula la dinmica folicular est basado en las respuestas diferenciales
a la FSH y LH (Johnson et al., 2004), despus del pico de LH esta retroalimentacin se
interrumpe y las clulas de la granulosa se luteinizan y sintetizan progesterona.

En la cavidad dejada por el folculo despus de la ovulacin se forma una estructura

similar a un cogulo, el cuerpo hemorrgico, que se transforma en cuerpo lteo (CL)
hacia el da 5 del ciclo (da 0 = estro) iniciando la secrecin de progesterona (P4) (Hafez,

8
2002). Hacia el da 3, las concentraciones plasmticas de P4 son bajas (<1 ng/mL), del
da 7 al 18 aumentan (6 a 10 ng/mL), y durante la lutelisis disminuyen en 24 a 36 h
(Wright y Malmo, 1992). Hacia el da 15 del ciclo, la P4 declina bruscamente; por lo tanto,
la funcin del CL es ser el reloj biolgico que controla la duracin del ciclo estrual. El CL
degenera si la vaca no resulta gestante convirtindose en cuerpo albicans y
permaneciendo visible en el ovario durante varios ciclos subsecuentes (Callejas, 2004). Al
mismo tiempo, la FSH estimula el desarrollo del folculo que ovular en el siguiente ciclo,
lo que demuestra su importancia en la maduracin folicular (Hafez, 2002; Asprn, 2004).

3.3.1 Sincronizacin del celo

Entre las herramientas de manejo reproductivo que permiten mejorar la IA se encuentran

la sincronizacin de celos y de ovulaciones. Los mtodos hormonales de sincronizacin se
basan en el efecto luteoltico de la prostaglandina F2 (PGF2) o el efecto lteo de los
progestgenos. Las prostaglandinas solo funcionan en hembras bovinas ciclando (Asprn,
2004; Callejas, 2004).

Los progestgenos (progesterona o sus anlogos) ejercen una accin inhibitoria sobre la
manifestacin del celo. Al administrarlos en dispositivos vaginales (durante 7 das),
implantes subcutneos (9 das) o por va oral (14 das) actan como un CL. Mientras
ejercen su accin, la hembra no manifiesta estro, hasta su retiro. En animales que estn
en anestro logran inducir el estro y en animales ciclando funcionan en cualquier etapa del
ciclo estrual. Se puede emplear la IA a tiempo fijo despus de terminar la administracin
del progestgeno, pero se obtiene mejor fertilidad si se realiza a celo detectado (Asprn,
2004).

En vacas que reciben tratamiento para induccin de OM, la sincronizacin de celos se

realiza previo a ste (Wiltbank, 1997). Los protocolos de sincronizacin de estros son
exitosos si se aplican correctamente. Sin embargo, se pueden presentar variaciones en la
dinmica de las ondas foliculares, que dificultan el control preciso del momento del celo y
de la ovulacin (Mapletoft et al., 2002).

En un programa de transferecnia de embriones en bovinos, la deteccin de celo en la

donadora es un factor importante. Gngora y Hernndez (2006), determinaron una
amplia variacin en la duracin del estro (3 a 26 h), atribuida entre otros factores a la

9
raza y la poca del ao con una variacin de la duracin del ciclo estrual de 21 das
promedio.

3.3.2. Signos de celo en la vaca

El celo se caracteriza por la receptividad sexual de la vaca y la aceptacin de la monta; la

manifestacin de celo es debida a las altas concentraciones de estradiol presentes en esta
etapa del ciclo. El celo es ms corto y menos evidente en los animales Bos indicus,
comparados con Bos taurus cuya duracin vara entre 3 y 26 h con un promedio de 14 h
(Rae et al., 1999), mientras que en la raza Ceb el rango es de 2 a 22 h con un promedio
de 7 h (Galina y Arthur, 1990; Hansen, 2004).

El comienzo de la manifestacin de celo sigue diferentes patrones, con la mayor

actividad durante las ltimas horas de la tarde, a lo largo de la noche, y en las primeras
horas de la maana. Ms del 70% de la actividad de monta toma lugar entre las 7:00 pm
y las 7:00 am (Seplveda y Rodero, 2003).

El signo primario de estro es dejarse montar y permanecer inmvil durante la monta

(Dransfield et al., 1998). Durante el celo temprano y tardo se presentan signos
generales de nerviosismo, topeteo, olfateo de genitales o de orina de otros animales,
reflejo flehmen, recargar la barbilla en la espalda de otras, vulva hiperhmica e
inflamada y descarga de moco hialino cristalino y filante. Los signos secundarios de estro
son: disminucin del apetito y produccin de leche, animales sucios (estircol en los
flancos), raspaduras y posible prdida de pelos en la base de la cola (Seplveda y
Rodero, 2003).

Tanto en el estro natural como en el inducido hormonalmente, se observa que la

presencia en el hato de ms de una hembra en celo desencadena una interaccin sexual
de montas y otras conductas estimulantes de reclutamiento e intervencin sexual de
otras vacas, con la consiguiente formacin transitoria y mvil de grupos homosexuales
heterosexuales conocidos como grupos sexualmente activos (Galina et al., 1996;
Castellanos et al., 1997; Orihuela, 2000).

A pesar de que el celo se manifiesta por sus signos, existen fallas en su deteccin
principalmente por los siguientes factores: variabilidad en la duracin del ciclo, breve

10
perodo de presentacin de signos, actividad sexual nocturna y variaciones individuales en
el comportamiento sexual. Los factores que tienden a disminuir la expresin de celo son:
estrs calrico que inhibe el desarrollo del folculo dominante durante el periodo
preovulatorio en vacas (Bo, 2002; Cobanov y Schnitkey, 2003), alta humedad, viento,
lluvia, nieve y confinamiento (Anta et al., 1989).

Uno de los aspectos ms importantes y que tiene mayor influencia en los parmetros
reproductivos de la vaca en el trpico es la deficiente deteccin de celos. Se han
reportado valores del 36% en la observacin de calores en trpico, datos que contrastan
con explotaciones ubicadas en climas templados cuyos porcentajes varan entre un 40 y
un 65% (Favero et al., 1995).

3.3.3. Ovulacin mltiple

El conocimiento de la fisiologa del ciclo estrual permite la utilizacin sistemtica de

hormonas para mejorar la reproduccin y la eficiencia reproductiva de los animales,
como los tratamientos hormonales para inducir OM cuando se utilizan programas de
transferencia de embriones (TE), los que permiten utilizar de manera intensiva a hembras
genticamente superiores (Cruz, 2003). La tecnologa de la TE en bovinos requiere de la
seleccin y el manejo, tanto fsico como farmacolgico de donadoras y receptoras
(Mapletoft, 2006).

Las investigaciones se han orientado al estudio de la reduccin de la alta variabilidad en

en el nmero de ovulaciones que se presenta entre animales como respuesta a los
tratamientos para OM (Cushman et al., 1999). La variacin observada en la respuesta
podra deberse a el nmero de folculos presentes en el ovario capaces de responder al
inicio del tratamiento de OM (Mapletof et al., 2002). Estudios in vitro han demostrado que
la FSH puede acelerar el rango de desarrollo de los folculos preantrales (Hulshof et al.,
1995; Gutirrez et al., 2006), permitiendo mejorar la fertilidad e incrementar la
respuesta a la OM (Lucy et al., 1992).

Normalmente se obtienen aproximadamente 10 cras nacidas de una hembra bovina bien

alimentada durante toda su vida reproductiva; con la tcnica de la OM se puede obtener
aproximadamente hasta 15 embriones cada mes de una sola hembra, y con la tcnica de
la TE, stos se pueden transferir a varias receptoras y as obtener 10 becerros por mes

11
del mismo animal (Calva et al., 2001). La OM, es la induccin de ms de una ovulacin,
mediante la aplicacin de hormonas que estimulan los folculos antrales produciendo un
crecimiento intensivo, con la finalidad de que al momento de la IA, se produzca ms de
un embrin (Armstrong, 1993). Se aplican FSH LH, las cuales inducen desarrollo de
varios folculos dominantes en ambos ovarios (Hafez, 2002).

Los tratamientos de induccin de OM utilizan inyecciones de gonadotropinas exgenas en

el diestro, en la mitad de la fase ltea (da 8 a 14), para reclutar mayor nmero de
folculos cerca del final de esta fase para ser ovulados en la siguiente fase folicular. Para
que el tratamiento sea exitoso, se deber tomar la segunda oleada folicular, que es
cuando hay mayor nmero de folculos en crecimiento y ocurre en el da 9 10 del ciclo
para aquellos que tienen dos oleadas y entre el da 8 a 9 para aquellos que tienen tres
(Mapletoft et al., 2002).

Cuando se utiliza FSH, la aplicacin inicia en el da 10 despus de la deteccin de celo y

debido a que la vida media biolgica de la FSH suprafisiolgica en la vaca es de 5 h
menos sta debe ser inyectada dos veces al da para que la induccin sea exitosa
(Mapletoft et al., 2002). Las preparaciones de FSH generalmente se aplican en series de
ocho inyecciones a dosis descendentes por 4 das, reportndose con este mtodo mayor
produccin de embriones transferibles que con otras preparaciones como la
gonadotropina corinica equina (eCG) (Crister et al., 1980).

Los tratamientos de induccin de OM en algunos casos causan un dramtico aumento en

el nmero de folculos que se desarrollan en los ovarios, as como en el nmero de vulos
disponibles para ser liberados al momento de la ovulacin (Mapletoft et al., 2006). Se ha
reportado tambin que la raza influye en los resultados (Rodrguez et al., 2007). Existe
variabilidad entre animales y tambin en el mismo animal de un tratamiento a otro, la
cual podra explicarse por diferencias genticas entre animales que determinan cmo
respondern a dosis supra-fisiolgicas de gonadotropinas (Mapletoft et al., 2002).

Otros factores que influyen en el resultado incluyen el estatus nutricional, historia

reproductiva, edad, estacin del ao, raza y estado ovrico al momento de aplicar el
tratamiento as como el efecto de ovulaciones mltiples repetidas (Mapletoft et al., 2006).
Sin embargo, la variabilidad en la respuesta ovrica tambin ha sido relacionada a
diferencias en los tratamientos de OM, tales como la preparacin de gonadotropina

12
utilizada, la dosis total, la duracin y tiempo del tratamiento, la edad y el uso de
hormonas adicionales en el esquema de tratamiento (Mapletoft, 2006; Malhi et al., 2008).

Looney (1986), inform que en un estudio de 2048 colecciones en donadoras, se colect

una media de 11.5 vulos/embriones de los cuales 6.2 fueron embriones transferibles.
Sin embargo, la variabilidad fue muy grande tanto en respuesta ovulatoria como en
calidad, 24% de las colecciones no produjo embriones viables, 64% produjo un
porcentaje muy bajo de embriones transferibles y 30% produjo el 70% de los embriones,
lo que coincide con lo reportado por Hasler (1992) y Seidel (1991). El alto grado de
variacin en la respuesta crea problemas que afectan tanto a la eficiencia como al
beneficio de los programas de TE (Hasler, 1992).

Cualquier hato est expuesto a resultados negativos; los resultados pueden indicar la
presencia de cambios en la actividad gentica. Esto significa que algunos animales
parecen ser resistentes a los tratamientos y algunos no y que la seleccin de animales
resistentes a los tratamientos (con la posibilidad de pruebas genticas) es la estrategia
para eliminar este problema en las explotaciones lo que permitira la seleccin de
hembras con alta respuesta a la aplicacin de FSH (Nett et al., 2006).

Moor et al. (1984), sugirieron que tanto la tasa de ovulacin como el nmero de
embriones viables producidos son relativamente consistentes dentro de los mismos
individuos; los animales que responden poco en un ensayo lo siguen haciendo en
tratamientos subsiguientes, mientras que aquellos animales que respondieron bien
inicialmente, lo continan haciendo de ese modo.

Aunque hubo una gran variabilidad entre vacas, se ha visto que el nmero de folculos es
similar en los ovarios de la misma vaca. Adems, el nmero de folculos >1.7 mm de
dimetro en un ovario, se correlacion positivamente con la respuesta superovulatoria a
los tratamientos con gonadotropinas. Singh et al. (2004), demostraron que el nmero de
folculos presentes en el momento de la emergencia de la onda folicular permite predecir
la respuesta superovulatoria.

En conjunto, esa informacin puede ser interpretada para sugerir que la variabilidad
reside en la estructura gentica fisiolgica del animal, ms que en factores exgenos.

13
Ciertamente, las vacas y novillas seleccionadas por la produccin de gemelos, tienen
mayores respuestas superovulatorias que los controles (Mapletoft et al., 2002).

Sin embargo, otros autores reportan que existe evidencia que indica que el
microambiente folicular puede afectar la calidad del ovocito, su habilidad para ser
fertilizado y el subsecuente desarrollo embrionario lo que comprueba que la dinmica
endcrina folicular esta profundamente afectada por el balance endcrino y los perfiles
hormonales de la donadora (Greve y Callesen, 2005).

Por muchos aos, los esfuerzos de los criadores de animales han sido dirigidos hacia el
mejoramiento de rasgos concernientes a una mayor produccin y durante los ltimos
aos, el mejoramiento gentico ha incrementado la eficiencia econmica de muchos
animales domsticos, la investigacin gentica ha impulsado la descripcin de valores
particulares de animales lite para rasgos especficos, respaldados por mtodos
estadsticos apropiados para optimizar la manipulacin gentica (Marson et al., 2005).

4. DINMICA FOLICULAR

El ovario bovino contiene un gran nmero de folculos primordiales al nacimiento, pero

menos del 1% de los folculos presentes en el ovario ovulan durante la vida media
reproductiva de la vaca, desconocindose el mecanismo por el cual ciertos folculos son
elegidos para dejar la reserva de folculos primordiales y convertirse en folculos primarios
continuando su desarrollo (Eppig, 2003).

El reclutamiento folicular inicia en la pubertad y resulta del incremento de los niveles de

FSH en la circulacin sangunea. No se conoce el mecanismo por el cual antes de la
pubertad, un folculo primordial deja de formar parte de la reserva e inicia su crecimiento
aunque se han sealado algunos factores de crecimiento, ciertas neurotropinas y a la
hormona inhibidora de los conductos de Mller involucrados en el proceso (Espinosa et
al., 2007).

El crecimiento folicular en el ovario se realiza en forma de ondas (Figura 2) conformadas

por cohortes de folculos que son seleccionados para crecer a partir de las reservas en
reposo mediante un crecimiento rpido (Monniaux et al., 1997), siendo necesarios
alrededor de 60 das para que un folculo primordial llegue a preovulatorio o de Graff, y

14
alrededor de 47 das para que llegue de la etapa antral temprana (0.1 mm) a
preovulatoria (13 a 16 mm) (Lussier et al., 1987).

Lutelisis
mm
Ovulacinn

D
I
Reclutamiento
M
E Seleccin

T
R Dominante
O
Atrsico
F
O
L
I
C
U
L
A
R

Poza de reposo Das del ciclo estrual

folicular

Figura 2. Ondas foliculares durante el ciclo estrual.

(http://beef.unl.edu/learning/estrous.shtml.)

La primera fase de la foliculognesis conocida como preantral o fase independiente de

gonadotropinas se caracteriza por el crecimiento y diferenciacin del ovocito. La segunda
fase llamada antral o fase dependiente de gonadotropinas, es caracterizada por un gran
aumento en la talla del folculo, aproximadamente arriba de 25 mm (Erickson, 2003).

El desarrollo de las clulas de la granulosa es controlado por la FSH durante la

foliculogensis, lo que causa la proliferacin y subsecuente diferenciacin con la
formacin del antro folicular, secretndose fluidos, iones y protenas caractersticas del
fluido folicular para finalmente producir esteroides va la sntesis de novo de factores
esteroidognicos y factores de transcripcin que controlan el proceso (Sasson et al.,
2003). En la segunda fase o fase antral, la FSH y LH inducen cambios importantes en el

15
folculo ovrico mediados por la accin de los receptores expresados en las clulas de la
granulosa, as como otros factores autcrinos-parcrinos que pueden estimular la
proliferacin celular y modular la accin de las gonadotropinas (Henao et al., 2000;
Richards et al., 2002; Erickson, 2003).

Adems, existe evidencia que muestra el papel de varios factores de crecimiento

sistmicos, intraovricos o ambos en la regulacin intraovrica, entre los que se incluyen
el factor de crecimiento insulnico I y II (IGF-I e IGF-II) y sus protenas unidoras (IGF-
BPs), el factor de crecimiento epidermal (EGF), folistatina y los miembros de la
superfamilia TGF (incluidas inhibinas y activinas) como coreguladores del desarrollo
folicular (Glister et al., 2001).

Sin embargo, son inhibina, activina y folistatina las que regulan la foliculognesis
mediante la activacin de genes e interacciones autcrinas y parcrinas por mecanismos
no del todo conocidos, inhibiendo o estimulando el crecimiento de los folculos
respectivamente (Hafez, 2002, Hohmann et al., 2005).

La folistatina y la activina han sido encontradas en las clulas de la granulosa de los

folculos primarios, en las clulas de la teca de folculos antrales, cuerpos lteos, epitelios
de la superficie ovrica y clulas del cmulus y de la granulosa de folculos antrales (Silva
et al., 2004).

5. MECANISMO DE UNIN HORMONA-RECEPTOR

La folistatina, glicoprotena rica en cistena, es codificada por un solo gen y es un

importante regulador de la diferenciacin celular y su funcin, debido a su habilidad para
unir y neutralizar activinas y protenas morfogenticas del hueso (bone morphogenetic
proteins). El RNAm del gen de expresin de la folistatina (FSRP, follistatin-related protein)
es estimulado por accin de FSH (Jorgez et al., 2004).

El tiempo de efecto sobre el mRNA del gen es bifsico ya que FSH aumenta el mRNA en
dos horas, y posteriormente reduce el nivel de control. En ratas, la expresin de la
folistatina es regulada a su vez por la va de la protena Kinasa A y la protena Kinasa C
(Tano et al., 1995). Una vez activada, la folistatina se une a la activina y a la inhibina con
una elevada afinidad para que stas puedan iniciar su funcin (Knigth y Glister, 2001).

16
A su vez, la expresin del receptor FSHR se produce por estimulacin de la activina y solo
de esta manera el folculo preantral llega a tener respuesta a la FSH (Woodruff et al.,
1988) (Figura 3), lo que aunado a la posterior interaccin de la sealizacin en cascada
de pptidos y hormonas esteroides en el ovario, producen el crecimiento folicular,
ovulacin y luteinizacin (Burks et al., 2000; Richards et al., 2002).

ACTIVINA
FSH
ADENIL CICLASA
ADENIL CICLASA

ACTIVINA
ACTIVINA

RECEPTOR
FSH PKA

GEN
GEN RECEPTOR
RECEPTOR DIFERENCIACIN
DEFSH
DE FSH 1. Fluido Folicular
2. Uniones en hendidura
GEN
GENDE ACTIVINA
DE ACTIVINA 3. Receptores de FSH
4. P450 Aromataza
FOLISTATINA
FOLISTATINA

FSH CLULA
CLULAGRANULOSA PREANTRAL
GRANULOSA PREANTRAL

Figura 3. Diferenciacin temprana de las clulas de la granulosa durante la

foliculognesis preantral (Erickson, 2003).

La activina por su parte es codificada por un solo gen, aunque existen diferentes
isoformas que alcanzan la glicolizacin en diferentes sitios (Shintani et al., 1997). La
localizacin del receptor de activina (ActR-IA) durante todo el desarrollo folicular y luteal
indica su papel en el sistema regulatorio local.

La activina promueve el crecimiento en las clulas de la granulosa, estimula la expresin

del FSHR, y activa la esteroidognesis a travs de un efecto parcrino sobre las clulas de
la teca, que a su vez promueven la produccin de andrgenos por estimulacin de la LH y
la produccin de inhibina y sus subunidades. La unin de la subunidad con la subunidad

17
A forma la inhibina A, la unin de la subunidad con la B forma la inhibina B. En
cambio la unin de dos subunidades A o dos subunidades B dan lugar a la hormona
activina (Glister et al., 2001). Estas protenas deben su nombre a su respectivo papel
para estimular e inhibir la secrecin de FSH en la hipfisis (Jorgez et al., 2004).

La cada de niveles de inhibina A durante la fase luteal tarda pareciera ser el regulador
predominante del aumento de los niveles sricos de FSH durante la transicin lteo
folicular, en contraste, las concentraciones altas de inhibina B durante la fase folicular
temprana son responsables de la disminucin de los niveles sricos de FSH, su caida y la
seleccin de un solo folculo dominante, lo que muestra un patrn diferencial especfico de
inhibina A (Hohmann et al., 2005).

La funcin de la activina es actuar sobre el gen de expresin del receptor de FSH, para
que inicie el acoplamiento hormona receptor y una vez que el efecto de la FSH es
mediado por el receptor FHSR, el mantenimiento de los niveles de receptores no depende
de la activina sino de la FSH (Inoue et al., 2003).

La activina adems de inducir la expresin de los receptores de FSH, promueve la

proliferacin de las cluas de la granulosa, la expresin de P450 aromatasa y de
estrgenos por las clulas de la teca, as como la maduracin del ovocito. Al mismo
tiempo, la folistatina induce la produccin de inhibina por el folculo dominante y junto
con los estrgenos es responsable del estmulo atrsico en los folculos subordinados,
inicio de la promocin de la expresin de LHR en las clulas de la granulosa del folculo
dominante y produccin del estmulo inhibitorio sobre la liberacin de FSH de la
adenohipfisis, haciendo que el crecimiento del folculo dominante sea dependiente de LH
hasta alcanzar el tamao preovulatorio (Henao et al., 2000; Fortune et al., 2001).

La FSH estimula tambin la expresin de receptores a LH y estos a su vez a la

progesterona, al mismo tiempo que la folistatina suprime el nivel de activina en las
clulas de la granulosa y por lo tanto su efecto sobre la expresin de los FSHR (Kishi et
al., 1998).

Los mecanismos locales de retroalimentacin terminan la accin de la activina solo

despus de un corto perodo de tiempo. Esta reduccin de la actividad de la activina

18
inducida por la FSH puede ser importante para el crecimiento normal de cada folculo
(Tano et al., 1995).

La estimulacin de la FSH a las clulas de la granulosa dura aproximadamente 24 a 48 h,

aunque despus de 8 h se inhibe la transcripcin del gen que regula al receptor y despus
de 6 h promedio, la unin al promotor de la hormona (en el dominio extracelular)
disminuye en un 68%. A las 48 h de estimulacin aumentan los niveles basales de FSH
debido a que deja de captarse por los receptores (Simoni et al., 1997).

Una vez acoplada la hormona con el receptor, se incia la sealizacin en cascada y la

fosforilacin del receptor es evidente en pocos minutos y a una dosis promedio de 30
ng/ml se sostiene hasta una hora, sin embargo la exposicin continua a FSH produce una
disminucin en la respuesta debido a un proceso de desensibilizacin ocasionada por
accin de la protena Kinasa (Shenoy y Lefkowitz, 2005).

De esta manera, los receptores fosforilados se unen a las protenas -arrestina 1 y -

arrestina 2 con una gran afinidad, y son estas protenas las que inducen que el receptor
se desacople de la protena G en la terminal carboxi para posteriormente internalizar y
dirigir al receptor a los pozos recubiertos de clatrina para el proceso de endocitosis y su
posterior degradacin en los lisosomas celulares (Krupnick et al., 1997; Shenoy y
Lefkowitz, 2005; Piketty et al., 2006).

A medida que avanza el desarrollo folicular y se completa la formacin del antro, las
concentraciones crecientes de estrgenos incrementan la sntesis de la inhibina, que a su
vez acta como inhibidor de la produccin de FSH (Montao y Ruiz, 2005), y de la
folistatina, que permitir la expresin de los receptores de LH (LHR) en las clulas de la
granulosa y la teca. El incremento en la secrecin de inhibinas permitir la sntesis de
novo de andrgenos principalmente androsteniona y la expresin de receptores LHR en
las clulas de la teca (Kishi et al., 1998).

Al mismo tiempo, las arrestinas crean un puente para interactuar con algunas otras
protenas en varias vas de sealizacin en la clula (Kara et al., 2006) por ejemplo, en
coordinacin con los mecanismos de la protena G, activa la va de sealizacin de las
protenas ERK 1 y 2, que posteriormente intervienen en la fase activa de LH (Kara et al.,
2006). Las activinas tambin participan en la expresin de aromatasa en las clulas de la

19
granulosa inhibiendo a la vez la expresin de los LHR tanto en clulas de la granulosa
como de la teca (Gigli et al., 2006; Knight y Glister, 2006), (Figura 4).

Suprime la Estimula la 1
2 maduracin
maduracin ovocito
del ovocito del ovocito

Clulas de la granulosa Clulas de la granulosa

Inhibe Aumento en la
proliferacin y
expresin del
FSHR
inhibina Libre

Activina Folistatina

Estimula Suprime Estimula Une y

neutraliza

Clulas de la Teca Andrgenos Estrgeno

aromatasa

Figura 4: Papel potencial intrafolicular de inhibina, activina y folistatina secretadas por

las clulas de la granulosa como respuesta al estmulo de FSH (Knight y Glister, 2001).

Por accin de la FSH, la teca expresa su estado de diferenciacin o formacin del antro,
expresndose una serie de genes, como la protena reguladora aguda esteroidognica
(StAR), una parte intrnseca del sistema de enzimas citocromo P450cc, obligatoria para la
rpida regulacin de la esteroidognesis (P450 aromatasa, responsable de la adquisicin
del potencial de estrgenos en el folculo) (Knight y Glister, 2001; Sasson et al., 2003).
Por virtud de la expresin de estos genes, las clulas intersticiales de la teca tienen la
capacidad de producir androstendiona (Nussey y Whitehead, 2001). El mecanismo
primario por el cual FSH controla la seleccin es por la estimulacin del receptor y por las
vas de transduccin de la seal en las clulas de la granulosa.

20
Por la expresin de P450 aromatasa y 17-HSD (17 beta dehidroxiesteroide-
dehidrogenasa), las clulas de la granulosa se vuelven altamente activas para convertir
androstediona a estradiol. El progresivo aumento en el nivel de la expresin del gen
CYP19 y P450 aromatasa hace posible la expresin de receptores a LH (Henao et al.,
2000; Fortune et al., 2001; Montao y Ruiz, 2005). Aunque LH no es esencial para la
eleccin del folculo, tiene cierta importancia en la regulacin de la formacin del folculo
dominante a travs de su capacidad para estimular la expresin del sustrato de
aromatasa androstendiona (Marsters et al., 2003) (Figura5).

FSH
Receptor Adenil ciclasa Andrgenos
FSHR derivados de la teca

Andrgenos
Protena G

Protena P450
MITOSIS Aromataza
Kinasa A

estrgenos

estrgenos
Receptor LH

Figura 5. Ruta de transduccin de la seal de la FSH en las clulas de la granulosa del

folculo dominante (Erickson, 1994).

Los receptores de estrgenos va su receptor (ESR1 y 2), adems de facilitar la

diferenciacin de las clulas de la granulosa al aumentar la expresin del receptor de LH,
actan transcribiendo factores que regulan la expresin de genes especficos y protenas
(Luo y Wiltbank, 2006). El desarrollo de la teca est acompaado por la formacin de
numerosos vasos presumiblemente a travs de una angiognesis por la accin de los
factores de crecimiento angiognicos que estimulan la vascularizacin (Antezak y Van
Vlerkom, 2000; Gigli et al., 2006). El desarrollo del folculo hasta la ovulacin depende

21
del xito en la unin hormona FSH y su receptor. Sin embargo, la presencia de
alteraciones en la interaccin FSH-FSHR, provocadas por diversos factores como cambios
en la estructura del gen que regula al receptor de FSH, pueden afectar la habilidad
reproductiva de acuerdo con estudios realizados en mujeres por Gromoll et al. (1996).

Al respecto, Aittomaki et al. (1995) reportaron en humanos el hallazgo de seis familias

con problemas de infertilidad debidos a cambios en una de las bases nucletidas que
forman el gen que regula al receptor, provocando que la FSH no pueda unirse a su
receptor (FSHR) y por lo tanto que existan fallas en la respuesta ovrica, probando que la
FSH y su receptor en el folculo constituyen la unidad estructural y funcional de los
ovarios permitiendo la maduracin folicular (Gigli et al., 2006; Thomas y Vanderhyden,
2006).

La FSH est compuesta por dos subunidades no covalentes, y codificadas por genes
ubicados en cromosomas diferentes (Graus et al., 2001) (Figura 6). La subunidad alfa es
comn para todas las hormonas glicoproticas mientras que la subunidad beta confiere la
especificidad hormonal (Pierce y Parsons, 1981). Sin embargo, el control de su secrecin
depende por la interaccin de inhibinas, que inhiben su secrecin, y de activinas que
estimulan su secrecin (Carroll et al., 1991).

Figura 6. Estructura de la hormona folculo estimulante. http://www.yasara.org/molecular-

graphics.

22
La FSH secretada para cumplir su accin biolgica ejerce su accin a travs de un
mecanismo en el cual la hormona llega al interior de las clulas blanco al unirse a
receptores especficos que se encuentran en la membrana plasmtica (Kilgour et al.,
1998; Campbell et al., 2004; Wunsch et al., 2007). La expresin de estos receptores en
las clulas de la granulosa depende de la etapa de la diferenciacin celular en el ovario
(Donadeu y Ascoli, 2005). La FSH demuestra que es capaz de unirse a su receptor en la
clula de la granulosa por la produccin de folculos y vulos, respuesta que se ve
aumentada en vacas con induccin de OM por la alta produccin de vulos (Kanitz et al.,
2002; Mapletoff et al., 2002).

Los receptores para FSH son expresados tanto en clulas maduras como inmaduras, y
cumplen dos funciones principales: el receptor debe reconocer a la hormona, que es la
sustancia biolgicamente activa, por medio de un acople o ligadura de sta, y la
combinacin receptor-hormona inicia los eventos qumicos que dan lugar a la accin
biolgica del sistema hormonal especfico, en este caso la maduracin folicular (Sasson et
al., 2003) (Figura 7).

Beta
Hormona
extracelular
unindose al
dominio de su
receptor

Dominio Alfa
extracelular

Dominio de las 7
transmembranas o
hlices

Protena G
http://www.hhmi.org/news/popups/
hendrickson2_pop.html

Figura 7 Unin del receptor de FSH a la hormona

http://www.hhmi.org/news/popus/hendrickson2_pop.htlm

23
Sin embargo, por diferentes razones algunos receptores en el rgano blanco no
reconocen la seal hormonal (Allen et al., 2003). Se ha comprobado que solo algunas
clulas responden a la seal, ya que el sistema receptor especfico puede afectarse por la
presencia de variantes allicas en los genes que regulan a los receptores hormonales, las
cuales afectan la respuesta de la interaccin hormona-receptor pudiendo producir
infertilidad (Sudo et al., 2002; Allen et al., 2003, Thron et al., 2007).

La membrana celular no es un dispositivo rgido sino dotado de un alto grado de fluidez,

gracias a la cual las protenas asociadas a la membrana tienen libertad para desplazarse
en todas direcciones del plano formado por la doble capa, por ello se habla de receptores
mviles. Normalmente la ocupacin de un nmero pequeo de receptores (~ 10%) es
suficiente para conseguir una respuesta biolgica mxima, siendo el resto una reserva de
receptores; el nmero de receptores de un tipo determinado en la superficie de una clula
puede variar entre 10 000 y 20 000 (Teijn et al., 2006).

La cantidad de receptores intracelulares es generalmente mucho menor. No es necesario

que la totalidad de los receptores de la clula est unida a hormona para obtener una
respuesta mxima. Comnmente esto ocurre cuando alrededor del 20% de los receptores
est ocupado por hormona. El resto corresponde a los llamados receptores de reserva
(Brandan, 2002).

Los receptores hormonales tienen como caracterstica su alta especificidad, la que

permite a la clula diana discriminar entre la mirada de seales que le llegan por va
endocrina y local. Con respecto al nmero de receptores que una clula posee para una
hormona, ste debe ser finito y cuantificable. La unin del receptor con la hormona debe
correlacionarse con un efecto biolgico, en el caso de la FSH, sera el crecimiento y
maduracin folicular (Harvey et al., 2005). La cantidad de receptores para un
determinado ligando vara en distintos estados fisiolgicos. Generalmente, la
concentracin de hormona presente regula la cantidad de receptores especficos en la
clula blanco.

Un aumento sostenido del nivel de hormona provoca disminucin del nmero de

receptores disponibles o su inactivacin. Este fenmeno es denominado regulacin "hacia
abajo" ("down regulation"). El fenmeno contrario, aumento del nmero de receptores en
la membrana externa, regulacin "hacia arriba" o "up regulation", se produce cuando hay

24
deficiencia del ligando especfico (Brandan, 2002). Los receptores FSHR pertenecen a una
familia comn de receptores acoplados a protenas G (GPCRS, Neves et al., 2002). Estos
receptores estn formados por siete hlices insertadas en el plasmalema celular (Luttrell,
2006; Cordom, 2008) y que atraviesan siete veces la membrana (Neves et al., 2002;
Kroese et al., 2003; Luttrell, 2006; Figura 8).

Bucles extracelulares

Terminal N

Sitios de
glicolizacin

Bucles intracelulares
Membrana
Citoplas ma
celular
Protena G

Terminal carboxyl
(C) http:/ /www.c ns forum.c om/c ontent /pict ures /im agebank/hirespng/ 5H
T_s truc _level2.png

Figura 8. Receptor de 7 transmembranas. (http://www.cnsforum.com/content/pictures/

imagebank/hirespng/5HT_struc_level2.png)

El receptor est organizado en tres dominios: 1) el dominio de la terminal unidora de

ligandos NH2 extracelular, compuesta de 349 aminocidos y tres sitios de glicolizacin
con cuatro potentes sitios de fosforilacin; 2) el dominio de la transmembrana celular
compuesta de siete hlices que anclan el receptor a la membrana plasmtica codificados
por un dominio transmembranal de 264 aminocidos ubicados en el exn 10 en el bovino
y un duster de cistenas entre la unin extracelular y transmembranal; y 3) el dominio de
la terminal intracelular COOH (Houde et al., 1994). (Figura 9).

25
 Existen 3 sitios de
El receptor de FSH se
glicolizacin en el
sintetiza en las clulas
dominio extracelular
de la granulosa y de
de FSHR, en los
ah se transporta a la
receptores distribuidos
superficie de la
Posibles sit ios de glicoliz acin en toda la superficie
membrana.
de la clula en forma
de parches (Davis et
Terminal N
Buc les ex trac elulares
al., 1995).

Membrana

Bucles intracelulares Terminal C

Durante la sntesis, el
La adquisicin del receptor es glicolizado y
receptor es esencial este proceso es
para la diferenciacin ne cesario para una
de las clulas de la apropiada formacin de
granulosa y la protena naciente y
maduracin folicular para su expresin en el
(Knigth y Glister, plasmalema (Davis et
2001). al.,1 995).

Figura 9. Diferentes sitios de glicolizacin (Davis et al., 1995).

La FSH al unirse a su receptor con alta afinidad induce una serie de cambios
conformacionales que activan a las protenas G, encargadas de iniciar la respuesta
intracelular (Simoni et al., 1997; Cordom, 2008). Una vez que el receptor es expresado
en las clulas de la granulosa por accin de la activina, se inicia la sealizacin en
cascada en el interior de la clula (Hunzicker-Dunn and Maizels, 2006).

5.1 Transduccin de la seal

El acoplamiento entre la hormona y el receptor ocurre a travs del dominio extracelular

del receptor, siendo la expresin del gen de FSHR altamente gonada-clula especfico
(Huhtaniemi y Toppari, 2005). Los receptores acoplados a protenas G (GPCRs)
pertenecen a una gran y muy diversa familia de receptores de membrana que inducen
informacin acerca de la presencia de diversos estmulos extracelulares al interior de la
clula en donde todos los receptores unidos a protenas G tienen una arquitectura comn

26
formada por 7 hlices que atraviesan la membrana conectados por ondas extracelulares y
la respuesta celular resulta de la accin del receptor como un ligando que activa la
guanina (G) (Lutrell, 2006).

Las protenas G trimricas estn constituidas por tres subunidades (, , y ), las que se
encuentran ancladas en el lado citoslico (interno) de la membrana plasmtica y pueden
presentar dos estados: el activo y el inactivo; la subunidad tiene un sitio de unin al

guanosin difosfato (GDP) ocupado por una molcula de este nucletido, en el estado
activo la subunidad est separada fsicamente de las otras dos y tiene un sitio de unin
a nucletidos de guanina ocupado por una molcula de guanosin trifosfato (GTP), a la vez
que presenta una conformacin distinta que en el estado inactivo. Estas protenas, al
unirse a las hormonas estimulan la sntesis y/o liberacin de segundos mensajeros o
mediadores intracelulares, tales como el AMPc intracelular o el Ca2+ (Lodish et al.,
2000).

Para que se produzca una respuesta celular, se requieren de cientos de miles a millones
de molculas de AMPc por clula, por ello, la seal producida por la hormona en unos
cientos de receptores -adrenrgicos presentes en la membrana celular ha de ser
amplificada. Esta "amplificacin" es posible gracias a la rpida difusin que tienen en la
membrana tanto el receptor como la protena G, lo que les permite interactuar y de esta
manera activar a la adenil ciclasa durante el tiempo que dura el complejo protena G (Gs)
Gs-GTP, el AMPc es degradado por la formacin de una protena de serina/treonina
denominada protena Kinasa A (PKA), lo que se denomina ruta de la protena Kinasa A
(Walker et al., 1995).

El AMPc dependiente de la protena Kinasa A es activado por una seal enviada por la
protena G, a su vez activada por el receptor para FSH, va la adenil ciclasa y el AMPc
(Simoni et al., 1997; Marion et al., 2002). La ruta completa utiliza cuatro molculas de
AMPc en la reaccin que forma un complejo entre las dos subunidades reguladoras (R),
liberndose dos subunidades catalticas (C) de la protena Kinasa (Gerits et al., 2008).

Posterior a la liberacin de las subunidades regulatorias se inicia la fosforilacin de

protenas permitiendo la accin fisiolgica en el ncleo de la clula en donde se unen las
protenas para producir un efecto celular (Sassone-Corsi, 2002), en donde pueden actuar

27
para regular o modificar actividades enzimticas por induccin o represin de genes
(Walker y Habener, 1996, Huhtaniemi y Toppari, 2005; Hunzicker-Dunn y Maizels, 2006).

Despes de la activacin de genes producida por la FSH como respuesta a la sealizacin

hormonal, la LH induce la reprogramacin de perfiles de expresin de ciertos genes en las
clulas somticas foliculares (clulas de la teca y granulosa), cambios en las propiedades
secretorias de las clulas del cmulo alrededor del ovocito, expansin del cmulo, reinicio
de la meiosis y ruptura del estigma folicular (Prochazka et al., 2003). El receptor de LH
(LHR) se expresa activamente en las clulas de la granulosa, en la lnea de la cavidad
antral del folculo preovulatorio (clulas murales de la granulosa) (Hsieh, et al., 2007).

Para explicar cmo la seal de FSH se propaga de la periferia hacia el complejo cmulo-
ovocito se ha propuesto un modelo donde se liberan factores producidos por las clulas
murales de la granulosa de una manera autcrina parcrina para transducir los efectos de
la LH en el folculo (Park et al., 2003). El pico de LH activa en las clulas de la granulosa
de los foliculos preovulatorios la sealizacin de las protenas RAS y ERK 1 y 2 (seales
extracelulares reguladas por las Kinasas) (Fan et al., 2009).

Como el receptor de LH es similar al de FSH, el AMPc es tambin mediador de la accin

de LH, sin embargo, la LH induce adems la expresin de un factor de crecimiento
epidermal (EGFR) que se une a su receptor (EGF) y activa otra va de sealizacin, la va
de las MAP-cinasas, que son protenas cinasas de serina y treonina que inducen la
activacin de las protenas RAS y ERK 1 y 2 o ruta de las MAP cinasas, y que pueden
actuar como mediadores intrafoliculares para estimular al cmulo en el complejo ovocito-
clulas (COC) (Laviada, 2005, Fan et al., 2009).

Las protenas RAS son protenas de unin de nucletidos de guanina que funcionan de
forma anloga a las subunidades alfa de las protenas G, alternando entre la forma activa
unida al GTP y la forma inactiva unida al GDP, de esta manera, las protenas RAS activan
a las protenas ERK, las que regulan redes de sealizacin, crecimiento y proliferacin
celular (Fernndez et al., 2004). Las protenas RAS son un tipo de protenas de una
familia de aproximadamente 50 proteinas relacionadas, denominadas protenas pequeas
de unin a GTP, porque el tamao de RAS y de las otras protenas es la mitad que el de la
subunidad alfa de las protenas G (Kierszenbaum, 2008).

28
Las vas de cinasas MAP esta constituida por 3 protenas cinasas: cinasa MAP terminal y 2
cinasas anteriores (anlogas a Raf y MEK) que regulan su actividad, culminando la
sealizacin con la ERK (cinasa regulada por seales extracelulares) que conduce
principalmente a la supervivencia, diferenciacin o proliferacin celular, con el resultado
final de la fosforilacin de mltiples factores de transcripcin en el ncleo (Lizcano, 2006).
Estudios de laboratorio han mostrado el efecto de ERK 1 y 2 en las clulas de la granulosa
de folculos preovulatorios, pero no en pequeos folculos en crecimiento. Una mutacin
de la protena RAS provocara la disrupcin del mecanismo provocando algunas patologas
ovricas, cncer e infertilidad (Fan et al., 2009). De esta manera, el control de la FSH
sobre la actividad gentica diferencial en las clulas de la granulosa es la base del
proceso del crecimiento del folculo dominante y el desarrollo del estado preovulatorio
(Simoni et al., 1997) (Figura 10).

Vas de la seal de transduccin.

Canal de calcio

Ruta de la protena
Subunidades
Regulatoria y kinasa A
catalticas de
la Protena K
Fosforilacin de protenas
Factores de transcripcin
mRNA de transcripcin
Ncleo

Sitios CREB y CREM (cAMP Protenas unidoras y moduladoras

Response Binding Protein), inducen o reprimen genes de
respuesta

(Simoni et al., 1997)

Figura 10. Transduccin de la seal (Simoni et al., 1997).

Aittomaki et al. (1995), demostraron que las variaciones estructurales (mutaciones o

polimorfismos) del gen del receptor de la hormona FSH, pueden activar o inactivar la
funcin de la misma, entendindose que el ADN frecuentemente sufre cambios qumicos,

29
especialmente cuando se replica, resultando en alteraciones estructurales de la
conformacin del ADN (Benjamn, 2001; Loutradis et al., 2006, Thron-Grad et al.,
2007).

5.2 Alteraciones en la estructura del gen que regula al receptor de la FSH

Se entiende por mutacin, el cambio permanente y transmisible en el material gentico

que ocurre generalmente en un solo gen (Benjamn, 2001). Estas alteraciones en los
genes suceden con ms frecuencia de lo que se crea, y actualmente se conocen
enfermedades por resistencia a la mayora de las hormonas.

Estas enfermedades a menudo se deben a mutaciones que afectan la accin hormonal,

pero tambin pueden estar causadas por defectos adquiridos de los receptores o de los
mecanismos efectores posreceptor de la accin hormonal (Allen et al., 2003). Cuando
existen defectos de resistencia total suelen incidir sobre hormonas que no son
imprescindibles para la vida, pues de lo contrario estos defectos conduciran a muerte
fetal y aborto (Brandan, 2002). Las alteraciones del gen de FSHR han sido incluidas en la
bsqueda de causas de infertilidad (Whithney et al., 1995, Thron-Grard et al., 2007).
Aittomaki et al. (1995), reportaron una mutacin inactivante localizada en el dominio
extracelular del FSHR que pudo ser identificada y que ocasion el sndrome de
resistencia caracterizado por gnadas no funcionales y amenorrea primaria en humanos.

Esto evidencia que una mutacin puede inactivar parcialmente al FSHR causando
regresin del folculo antral o de estados posteriores del crecimiento folicular, indicando
los diferentes grados de actividad FSH-FSHR (Perez et al., 2000, Wunsch et al., 2005). En
el bovino se han detectado cambios en la presencia de variantes allicas en el FSHR
debidos a que el gen que regula al receptor hormonal presenta variaciones en su
estructura gentica (Tambasco et al., 2000; Vasconcellos et al., 2003; Falconer et al.,
2005). La accin del gen que regula al FSHR resulta en algunos casos en resistencia
hormonal debido a la pobre o nula especificidad de la accin hormonal hacia su receptor
por la presencia de polimorfismos o cambios en la secuencia de ADN en el gen
(mutaciones activantes e inactivantes), lo que resulta en deficiencias aisladas de FSH que
han sido descubiertas en las subunidades de los genes receptores de gonadotropinas
(Simoni et al., 1997; Temen y Huhtaniemi, 2000).

30
Las mutaciones producen aberraciones en el sistema de regulacin teniendo
consecuencias clnicas que causan resistencia a las gonadotropinas produciendo una
accin inapropiada (Jameson, 2004). Un cambio en la secuencia de bases del receptor de
FSH afecta el aminocido correspondiente en el proceso de transduccin, por lo tanto, es
una mutacin que dirige la incorporacin de un aminocido diferente y el resultado puede
ser una protena no funcional (Gromoll et al., 1996). Dentro de las mutaciones que han
sido documentadas para el receptor de FSH se encuentran: fallas ovricas, fallas en la
espermatognesis, modo de herencia y localizacin del cromosoma 2 par 21 en humanos
(Zhang et al., 1988; Gromoll et al., 1994). El gen que regula al FSHR al sufrir cambios en
su molcula altera la interaccin con una enzima en el lado citoplasmtico de la
membrana celular (Figura 11). Los cambios conformacionales en la enzima, a su vez,
alteran la activacin de su sitio cataltico. De igual manera, las variaciones genticas para
genes receptores de hormonas en animales, juegan un papel importante en la respuesta
a los diferentes tratamientos utilizados para manipular la eficiencia reproductiva (Simoni
et al., 1997).

Exones

Intrones

Figura 11. Gen que regula al receptor de FSH Humano (Simoni et al., 1997).

Se sabe que los estmulos ambientales pueden ser algunos de los factores que induzcan
mutaciones "adaptativas" que capacitan a una clula a alterar especficamente sus genes
(Jaenisch y Bird, 2003). Themmen y Huhtaniemi (2000) estudiaron a las hormonas y sus
receptores con tcnicas moleculares, demostrando que existen raras mutaciones inactivas
que producen fenotipos distintivos de deficiencias aisladas de FSH que han sido
descubiertas en las subunidades de los genes receptores de gonadotropinas en los que se
han detectado mutaciones activantes e inactivantes, la mayora en los genes receptores

31
de la LH, y solo unas pocas en el gen para el FSHR. Estas mutaciones producen
aberraciones en el sistema de regulacin y amplan el conocimiento de las consecuencias
clnicas de la resistencia a las gonadotropinas y su accin inapropiada (Jameson, 2004),
lo que constituye una poderosa herramienta para explorar la fisiologa de la funcin de las
gonadotropinas y proveen un excelente ejemplo del poder del acercamiento molecular en
el estudio de la variacin de la respuesta a las diferentes hormonas.

En 1970 se realizaron los estudios preliminares que informaron que las gnadas poseen
sitios de unin especficos para FSH (Simoni et al., 1997). Posteriormente, en 1989, se
reportaron las primeras secuencias de un fragmento de ADN de un receptor de FSH
(Parmentier et al., 1989), y en 1990 se logr clonar el ADN para el FSHR (Sprengel et al.,
1990). En estudios subsecuentes, Remy et al. (1995) mapearon y encontraron el gen que
regula a este receptor en el cromosoma 3 de la oveja, reportndolo posteriormente
Gromoll et al. (1994, 1996) en el cromosoma 2 par 21 en humanos. El gen del FSHR para
Bos taurus fue estudiado por Houde et al. (1994), quienes detallaron la composicin
complementaria de la estructura del ADN, codificaron la secuencia completa de pares de
bases y demostraron que se encuentra en el cromosoma 11 (Genbank accesin number,
L22319) (Houde et al., 1994; Rahal et al., 2000) (Figura 12).

Figura 12. El gen que regula al FSHR bovino se encuentra en el cromosoma 11 (Houde
et al., 1994).

32
Houde et al. (1994), obtuvieron la composicin complementaria de la estructura del ADN
por amplificacin con PCR transcriptasa reversa (RT-PCR), codificando la secuencia
completa de aminocidos para FSHR (Figura 13). Rahal et al. (2000) identificaron en
ganado Bos indicus dos sitios especficos que presentaron cambios en dicha secuencia y
que dan lugar a mutaciones.

Figura 13. Fragmento del ADN de FSHR Bovino correspondiente a las transmembranas
tres a siete del exn 10. Los nucletidos y aminocidos se encuentran numerados a la
derecha (Houde et al., 1994).

Las mutaciones tienen diferentes manifestaciones clnicas, las cuales alteran la funcin
gonado-hipofisiaria y ocasionan que los receptores para FSH presentes en las membranas
celulares al recibir el estimulo hormonal puedan desensibilizarse, es decir, que la seal
hormonal sea retransmitida de manera menos eficiente, proceso causado por un
desacoplamiento del receptor y la transduccin intracelular de la protena G, as como por

33
la internacin del receptor (Aittomaki et al., 1996, Gromoll et al., 1996). La internacin
de los receptores en la superficie de las clulas es un mecanismo por el cual el receptor
controla su proceso de insercin; cuando ste no se realiza eficientemente resulta en un
decremento de la densidad de los sitios de unin de la hormona expuestos
extracelularmente en la respuesta de las clulas blanco testiculares y ovricas (Liang y
Huganir, 2001).

Se ha comprobado la existencia de mutaciones gnicas que alteran el significado del

codn y codifican para otro aminocido, como las mutaciones missense o mutaciones no
sinonmicas del gen FSHR, que activan o inactivan la funcin de la FSH. Se espera que
ms adelante su interpretacin permita comprender el papel de esta hormona y su
respuesta en la gametognesis (Aittomaki et al., 1995). Una mutacin (Figura 14)
cambia la secuencia del codn (secuencia de tres nucletidos o triplete en la hebra
codificadora del ADN o RNAm) que representa un aminocido especfico en el cdigo
gentico, y se traduce en su aminocido correspondiente en el proceso de traduccin, por
lo tanto, es una mutacin que dirige la incorporacin de un aminocido diferente y el
resultado puede ser una protena no funcional (Benjamn, 2001).

MUTACIN

Cdigo original de ADN para una secuencia de

aminocidos

ADN
Bases

Aminocido Sustitucin de un
solo nucletido

Aminocido incorrecto el cual puede producir una

protena errnea

Figura 14. Mutacin: cambio de una sola base en un codn lo que da como resultado
una mutacin. http://urgi.versailles.inra.fr/projects/GnpSNP/general_documentation.php

34
Los marcadores moleculares determinan polimorfismos o mutaciones de un slo
nucletido (Single Nucleotide Polimorphism, SNPs), y polimorfismos de longitud de
fragmentos de restriccin (Restriction-Fragment-Length-Polymorphisms, RFLP), los cuales
son segmentos de ADN que sirven de referencia para seguir la transmisin de un
segmento de cromosoma de una generacin a otra (Cargill et al., 1999; Marson et al.,
2005).

En la produccin animal, el uso de marcadores moleculares se utiliza para definir el

genotipo y predecir el comportamiento de un animal para una caracterstica especfica
valiosa para ser aadida en programas reproductivos, a travs de estrategias conocidas
como seleccin asistida para marcadores (MAS, marker-assisted selection), con el fin de
facilitar la explotacin de la diversidad gentica existente en las diferentes razas que
componen una explotacin, debido a que estos marcadores de ADN son por definicin
polimrficos y el anlisis de la funcin de un gen puede ser utilizado para determinar el
polimorfismo que podra ser un marcador de utilidad para rasgos reproductivos deseados
(Beuzen et al., 2000).

Los diferencias presentes en el gen del receptor FSHR indican que el genotipo del animal
juega un papel muy importante en la respuesta fisiolgica del rgano blanco al estmulo
hormonal (Marson et al., 2005), lo que sugiere que las variantes allicas inducen
diferencia en la respuesta, lo que indica una fina sintonizacin en la regulacin de la
retroalimentacin de FSH, dependiente del genotipo del FSHR (Perez et al., 2000).

El hallazgo de que las variantes allicas del receptor de FSH determinan la sensibilidad a
la FSH, abre una nueva perspectiva en endocrinologa y debera impulsar la continuacin
de la investigacin en este tema (Perez et al., 2000). El comportamiento de los genotipos
en las explotaciones bovinas que estn compuestas en algunos casos de animales
originarios del mestizaje de varias razas, tanto de Bos indicus como de Bos taurus, ha
permitido caracterizar los polimorfismos presentes en las diferentes razas teniendo como
objetivo la evolucin en los sistemas de cruzamiento, que pretenden la utilizacin de
animales hbridos para obtener efectos de heterosis y la complementariedad con respecto
a razas de rasgos econmicamente importantes (Marson et al., 2005).

Diversas investigaciones han demostrado las caractersticas genticas de las poblaciones

y han identificado los genes importantes para la determinacin de estas caractersticas de

35
inters en la produccin de ganado, utilizando tcnicas de biologa molecular que emplean
marcadores moleculares, como los RFLP (Tambasco et al., 2000; Milazzotto, 2001;
Campagnari, 2002; Marzn et al., 2005, 2008). Rahal et al. (2000), analizaron el ADN de
bovinos Bos indicus (Nelore) por PCR-RLFP tomando un fragmento de 230 pares de bases
del exn 10, y lograron caracterizar dos polimorfismos en los nucletidos posicin 1570 y
1657. Marzn et al. (2005, 2008), estudiaron una poblacin de 370 bovinos de carne de
la cruza Bos taurus/Bos indicus concentrados en seis grupos de diferente composicin,
con el objetivo de caracterizar genticamente esta poblacin y determinar la estructura y
variabilidad gentica en las diferentes cruzas, pudiendo definir genticamente por PCR-
RFLPs a los genes receptores para LH y FSH. El anlisis permiti identificar 2 genotipos de
cada gen: GG, CG y CC para FSHR/AluI, y TT, CT y CC para LHR/HhaI.

Basados en los resultados por RFLP para LHR (Milazzotto, 2001) y FSHR (Campagnari,
2002), se seleccionaron dos fragmentos de los genes, los cuales fueron analizados con
PCR-RLFP. Los genotipos fueron identificados mediante electroforesis en gel de agarosa, y
por la ausencia o presencia de sitios de restriccin utilizando la enzima AluI para el gen
FSHR, y se reflej una elevada variabilidad gentica en esta poblacin y tambin un bajo
grado de diferenciacin gentica entre las seis razas (Milazzotto, 2001; Campagnari,
2002).

De acuerdo con Tambasco et al. (2000) y Vasconcellos et al. (2003), la acumulacin de

algunos genotipos y mutaciones puede resultar en un estado de desequilibrio en la
poblacin bovina (Bos taurus/Bos indicus). Este resultado se obtiene utilizando la ley de
equilibrio de Hardy Weimberg para el clculo del equilibrio gentico en las poblaciones
(Suarez et al., 2000).

Vozzi et al. (2007), informaron que los programas de mejoramiento generalmente

amplifican la prdida de variabilidad gentica, especialmente debido al incremento en los
niveles de la prdida de alelos de sus progenitores a travs de la seleccin gentica y la
deriva, las cuales limitan la contribucin gentica de razas valiosas. Steigleder et al.
(2004) estudiaron la variabilidad gentica de una poblacin de ganado, y encontraron que
los valores y el flujo de genes en cada grupo revel una considerable prdida de la
diversidad, comprometiendo con ello la mejora gentica de los rasgos de importancia
econmica. Campagnari (2002) identific los genotipos para los genes de receptores

36
FSHR y LHR utilizando anlisis PCR-RFLP, encontrando que las frecuencias allicas para
FSHR fueron similares entre las razas Bos taurus y Bos indicus.

Entre los efectos de las variantes allicas, Dierich et al. (1998) encontraron ratas con
tero delgado y ovarios pequeos, siendo en algunos casos estriles debido a un bloqueo
en la folculognesis antes de la formacin del folculo antral. Aunque la expresin a nivel
del gen se altera solo moderadamente, se observaron drsticos cambios sexuales
especficos en los niveles de varias hormonas.

Esto demuestra que cualquier perturbacin entre la interaccin de la FSH y su receptor

debilita la gametognesis y la maduracin folicular, el papel central de la FSH y sus
receptores (Aittomaki et al., 1995; Nieschlag et al., 1999; Acherman et al., 2001; Sudo
et al., 2002; Allen et al., 2003). Dada la importancia de estos hallazgos, debern
realizarse estudios que permitan entender el comportamiento del gen de FSHR en la
fisiologa bovina y su interaccin hormonal.

6. JUSTIFICACIN

Se ha tenido xito al demostrar las caractersticas genticas de poblaciones mediante la

identificacin de ciertos tipos de genes de inters en la produccin bovina al utilizar
tcnicas de biologa molecular mediante el uso de marcadores moleculares genticos,
como los RFLP. El conocimiento y caracterizacin de los genes de una raza mediante
marcadores moleculares permite la seleccin de genes valiosos de caractersticas
deseables, por lo que el uso de la biotecnologa permite estudiar las caractersticas
genticas de las diferentes razas que identifican genes que codifican para caractersticas
importantes.

La ventaja de utilizar el anlisis PCR-RFLP es que permite conocer los genotipos presentes
en las diferentes razas y caracterizar la heterocigosis para mejorar el conocimiento de la
estructura gentica de las poblaciones, aspecto que facilita la eleccin del potencial
gentico a ser utilizado en futuros cruzamientos. La induccin de OM utilizando FSH en
programas de transferencia embrionaria ha crecido considerablemente a nivel mundial.
Sin embargo, la respuesta ovrica necesaria para el xito de estos tratamientos es
variable, y puede verse afectada por perturbaciones entre la interaccin de la FSH y el
gen que regula a su receptor, lo que debilita la gametognesis y en consecuencia el papel

37
central de la FSH y sus receptores en la maduracin fisiolgica normal de ovocitos. Esto
explica la necesidad de conocer las caractersticas allicas presentes en las diferentes
razas explotadas en el trpico utilizadas en este tipo de programas.

En humanos, los polimorfismos del gen de FSHR producen respuestas variables,

patologas clnicas e infertilidad. Desafortunadamente, no existen estudios en bovinos
que correlacionen la presencia de polimorfismos del gen FSHR en diferentes razas con la
respuesta reproductiva utilizando tratamientos de manipulacin hormonal como es el caso
de la induccin de OM, por lo que es importante aumentar el conocimiento acerca de
estas variantes allicas, su efecto en la respuesta hormonal y su posible efecto en la alta
variabilidad encontrada como respuesta a los tratamientos hormonales. Debido a lo
anterior, es necesario iniciar estudios en bovinos que correlacionen la presencia de
polimorfismos con la respuesta al tratamiento para inducir OM, utilizando marcadores
genticos para identificar el comportamiento de este gen, ya que los marcadores
moleculares podran proporcionar informacin acerca del comportamiento de estas razas
en programas de seleccin en produccin y podran identificar individuos con rasgos
valiosos en su especie.

7. HIPTESIS

Las frecuencias gnicas y genotpicas (Ley de Hardy Weinberg) del gen FSHR, varan
entre vacas Bos taurus, Bos indicus e hbridas afectando la respuesta a la ovulacin
mltiple.

La diferencia en las variables polimrficas del gen del receptor de FSH (FSHR), modifica la
respuesta a la ovulacin mltiple.

8. OBJETIVOS

8.1 Objetivo General

Estudiar el polimorfismo molecular del gen que regula al receptor de la hormona folculo
estimulante (FSHR), en dos especies de bovinos y sus cruzas en el trpico de Veracruz y
correlacionar el efecto de la variabilidad allica del gen del receptor con la respuesta a
ovulacin mltiple.

38
8.2 Objetivos Especficos

1. Identificar las frecuencias del gen de FSHR dentro del hato a partir de las frecuencias
genotpicas y gnicas utilizando la ley de equilibrio de la poblacin de Hardy Weinberg, el
nmero de alelos por locus y la heterocigosidad estimada.

2. Determinar si existe una correlacin entre las diferentes formas del gen de FSHR y la
respuesta a la induccin de ovulacin mltiple.

9. MATERIALES Y MTODOS

9.1 Localizacin geogrfica

El presente trabajo se realiz en dos explotaciones, la primera denominada Finca Oluta,

es una explotacin comercial de bovinos productores de carne (Bos indicus y Bos taurus),
ubicada en el municipio de Veracruz, Ver., localizada a 19 12' latitud norte y 19 08'
longitud oeste, a una altura de 10 msnm, con clima tropical hmedo, temperatura media
anual de 25.3C, y precipitacin pluvial media anual de 1,500 mm.

La segunda es el Campo Experimental La Posta del Instituto Nacional de Investigaciones

Forestales Agrcolas y Pecuarias (INIFAP) con ganado hbrido (1/4 Ceb-3/4 Holstein y
1/4 Ceb-3/4 Suizo americano); ubicada en el municipio de Medelln de Bravo, Ver., en
las coordenadas 19 03 latitud norte y 96 09 longitud oeste, a una altura de 52 msnm,
con clima clido-hmedo-extremoso, temperatura promedio de 25.3C y precipitacin
pluvial media anual es de 1,417.8 mm.

9.2 Manejo de animales

9.2.1 Caractersticas y manejo de los animales experimentales

Los tratamientos de todos los animales fueron realizados en condiciones climticas

relativas a temperatura y humedad similares. Se utilizaron 45 hembras bovinas,
divididas en tres grupos: grupo 1: n=15 vacas Ceb, (Sardo negro, Nelore e Indubrasil),
grupo 2: n=15 vacas hbridas de Ceb (3/4 Holstein 1/4 Ceb y 3/4 Suizo americano 1/4

39
Ceb) y grupo 3: n=15 vacas Suizo europeo, con los siguientes parmetros
reproductivos: edad del animal 5-7 aos, partos entre 1 y 7, mnimo 90 das posparto, al
menos 2 celos con intervalo normal de tiempo, intervalos entre partos de 60 a 90 das y
servicios por concepcin de 1.5 a 2.

En la finca Oluta se cuenta con los registros individuales de cada hato desde el
momento del nacimiento. Para la raza cebuna se seleccionaron los registros de las
siguientes razas, 26 Sardo negro, 100 Nelore y 80 Suizo europeo. Posteriormente, se
identificaron con numeracin progresiva de acuerdo con el orden de inclusin en el
estudio.

Adems, se examinaron a travs de palpacin rectal durante los primeros meses previos
al estudio a fin de evaluar que se encontraran libres de patologas clnicas en el aparato
genital, verificar la presencia de estructuras ovricas y posteriormente, por medio de
ultrasonografa, se confirm la evaluacin inicial. El manejo reproductivo de la explotacin
es a travs de IA durante los meses de julio a diciembre y monta natural controlada con
empadre continuo durante el ao. Las hembras se inseminan por primera vez a los 2 aos
de edad despus del periodo posparto.

Asimismo, se mantuvieron bajo el manejo constante de la explotacin, con respecto a las

condiciones de alimentacin (pastoreo). El sistema de amamantamiento empleado en el
rancho es continuo, tradicional en la zona, consistente en que el becerro permanece con
la madre desde que nace hasta su destete a los 7 meses de vida.

Las vacas se manejaron en pastoreo en aproximadamente 300 ha sembradas con pasto

estrella de frica (Cynodon plectostachyus), estrella Santo Domingo (Cynodon
nlemfuensis), Pangola (Digitaria decumbens), Privilegio (Panicum maximum), estando
presentes algunos pastos nativos como el Paspalum spp. y Axonopus spp., predominando
las praderas mixtas dentro de las instalaciones del productor ubicado en estas reas del
trpico.

Los animales de La Posta son parte de un sistema de produccin de doble propsito

carne y leche. Cuenta con 53 ha con un total de 127 animales, de los cuales 41 vacas se
encuentran en produccin. En el presente estudio se utilizaron 15 hembras hbridas 3/4
Holstein 1/4 Ceb, 3/4 Suizo americano 1/4 Ceb. Las hembras se encuentran en

40
empadre continuo con IA, la observacin de calores es apoyada con toro marcador
(desviacin de pene), maana y tarde. Se realiza palpacin rectal cada 15 das y antes
del parto pasan al paridero. Se inseminan 28 a 30 das posteriores al parto y el
diagnstico de gestacin se realiza a los 45 das despus del ltimo servicio. Se llevan a
cabo calendarios de sanidad (desparasitacin externa cada 21 das e interna cada 120
das y vacunaciones contra enfermedades comunes como derriengue, pasterelosis,
clostridiasis, complejo respiratorio bovino y brucelosis).

Los potreros se encuentran empastados con Pangola (Digitaria decumbens), Braquiaria

(Brachiaria brizantha CVmarand), Mombaza (Panicum maximum CV Mombasa),
Braquiaria de cumens (Brachiaria decumbens CV Australiana), y Tanzania (Panicum
maximum). Los potreros estn divididos con cerco elctrico y convencional.

Se practica pastoreo rotacional y se dejan 14 ha para ensilaje (Silo de pastel) que ser
utilizado en poca de secas. En caso de no haber suficiente silo se les da tambin bagazo
de caa con melaza y urea al 3% (3 a 4 Kg por animal) y suplementacin alimenticia
(1.5 Kg) con el 16% de protena. El agua se encuentra disponible en bebederos repartidos
por el potrero.

10. OBTENCIN DE ADN SANGUNEO, AMPLIFICACIN Y TIPIFICACIN DEL

LOCUS FSHR

10.1 Manejo del animal y obtencin de muestra

Para la extraccin de ADN genmico, se obtuvieron muestras sanguneas de la siguiente

manera. Todas las hembras fueron colocadas en mangas de manejo e inmovilizadas
mediante prensa. Se utilizaron tubos vacutainer al vaco con anticoagulante EDTA
disdica 0.5 M y agujas desechables calibre 18 x 1.5. El sitio de venopuncin fue la
vena coccgea, previo lavado y desinfeccin del rea con una solucin de cloruro de
benzalconio (1:10) como antisptico.

Las muestras de sangre obtenidas, fueron conservadas en hieleras y posteriormente

refrigeradas hasta el momento de su anlisis en el laboratorio de Biologa Molecular de la
Unidad de Diagnstico, ubicado en la Posta Zootcnica Torren del Molino perteneciente
a la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Veracruzana.

41
10.2 Fase de lavado de clulas y extraccin de ADN

Para lograr ADN con la pureza y concentracin adecuadas, la extraccin se hizo a partir
de leucocitos de sangre perifrica por el mtodo de precipitacin salina (salting-out)
(Gorodezky et al., 2000; Sambrook y Russell, 2001). Todos los materiales y reactivos
fueron esterilizados previo a su utilizacin.

El mtodo de la extraccin de ADN se fundamenta en la lisis de eritrocitos y el lavado de

clulas blancas para la obtencin de ADN genmico, mediante la utilizacin de reactivos y
enzimas (proteinasa K y RNasa) (Sambrook y Russell, 2001), lo que permiti la obtencin
del material gentico. Despus de la extraccin, se verific la integridad del ADN
purificado por electroforesis en gel de agarosa. La amplificacin del locus FSHR se realiz
por medio de la tcnica de PCR y la tipificacin del locus por la tcnica de RFLP segn el
mtodo mencionado por Campagnari et al. (2002) para FSHR.

El lavado de clulas sanguneas para la extraccin del ADN, permiti eliminar los glbulos
rojos, de la siguiente manera: para la obtencin del paquete de clulas nucleadas, se
coloc en un micro tubo de 2.0 mL, (Eppendorf, Alemania) 500 L de sangre completa
individual, al que se le adicion 1 mL de H2O ddest (agua desionizada estril) fra, stos
se colocaron en un mezclador de alta velocidad (Max-MixII Thermolyne), para
posteriormente centrifugar (Microcentrfuga SIGMA 1-15 , USA) a 12000 rpm/10 min a
4 C.

El sobrenadante fue extrado utilizando puntas y pipetas Eppendorff de varios calibres. Se

agregaron nuevamente 500 l de sangre centrifugando en iguales condiciones. Se
efectuaron hasta dos lavados ms para obtener un paquete libre de hemoglobina. El
paquete se resuspendi en una solucin de lisis (10mM Tris-HCl pH8, 400mM NaCl, 20mM
EDTA, 0.5% SDS), se mezcl y se dej en reposo por 10 min a temperatura ambiente.

La solucin de lisis rompe las paredes celulares para obtener el ADN, el cual sale junto
con todos los componentes celulares. Se aadi RNAsa [f] 15 g/ml (PROMEGA USA); y
se agreg 1 L/ml e incub en un horno con agitacin (BOEKEL Scientific USA) a 37
C/1 h; posteriormente se aadi proteinasa K (PROMEGA, USA) [f] de 70 g/ml de los
cuales se adicion 1.75L/ml, se incub toda la noche a 55 C. Para la precipitacin de

42
las protenas, se adicion NaCl [f] 2M (Tcnica Qumica Mx) al sobrenadante del ltimo
lavado, se mezcl por 15 seg y centrfug a 12000 rpm/10 min a 4 C. El NaCl permite
que se precipiten todos los desechos y que el ADN quede suspendido. Posteriormente, sin
arrastrar el paquete de protenas, se transfiri el sobrenadante a otro tubo, y se adicion
750 L de isopropanol fro (PROMEGA, USA). Se agit hasta precipitar el ADN, dejando
en reposo por 30 min en bao de hielo, a continuacin, se centrifug a 12000 rpm/10
min/4 C. Para obtener el paquete de ADN, se elimin el sobrenadante. El isopropanol fro
alinea el ADN y permite que se desprendan los hidrxidos y queden nicamente los
nucletidos que forman el ADN.

Se eliminaron totalmente las sales del pellet de ADN precipitado, lavando dos veces el
ADN con 500 l de etanol al 70% (ALYT- reactivos analticos), centrifugando a 12000g/10
min/4C y decantando el sobrenadante. El etanol se utiliza para enjuagar el ADN. Se
elimin la totalidad del etanol en una centrifuga de evaporacin al vaco a 55C durante
10 min. Posteriormente, el ADN se rehidrat resuspendiendolo en 100 L de agua
destilada, mezclando cuidadosamente con la punta de una pipeta y se congel a -20C
hasta su anlisis (Gorodezky et al., 2000; Sambrook y Russell, 2001).

10.3 Integridad de ADN

Para confirmar que las muestras de ADN posean condiciones adecuadas para la
amplificacin por PCR, se realiz electroforesis en gel de agarosa (PROMEGA, USA) al
1% para lo cual se utiliz TAE al 1X (44.5mM Tris-HCl, pH 8.0; 44.5mM cido brico;
1mM EDTA) como buffer de corrida, teido con bromuro de Etidio (PROMEGA, USA) 1 L
[0.5 mg/ml], se us un marcador DNA- de peso molecular alto (PROMEGA, USA) y 3 L
ADN por 20 min a 60 voltios (V) (Sistema de Electroforesis Thermo Electron
Corporation USA) Tabla 1.
Tabla 1. Mtodo de Integridad de ADN
Mtodo de integridad de ADN
Pozo 1 Pozos sucesivos (2-16)
Marcador Lambda 3 L -----------
Blue Orange 2 L 2 L
ADN -------- 3 L
Medio TAE1X ------- 5 L

43
Los tres elementos se mezclaron por pipeteo antes de agregar al pozo, las muestras se
corrieron aproximadamente 20 min. La integridad de cada banda y su identificacin se
revisaron en un transiluminador de luz UV (Spectroline USA), la imagen se analiz
mediante un sistema de documentacin automtica de geles Gene-Snap (Spectronic
Corporation USA).

La molcula de ADN tiene carga negativa y al colocarse en un campo elctrico (gel en

cmara de electroforesis) tiende a moverse en direccin al polo positivo del campo, las
molculas ms pequeas se mueven ms rpido que las ms grandes y esto permite
separar fragmentos de diferente tamao y peso.

El bromuro de etidio con que se tien los geles (0.5g/ml) se intercala entre las bases de
los cidos nucleicos y produce fluorescencia, que al ser iluminada con luz ultravioleta (UV)
fluoresce y seala los sitios del gel donde hay fragmentos de ADN visualizandose en
bandas (Sambrok y Rousell 2001). Se utiliz cmara horizontal de electroforesis marca
(SCIENTIFIC CO) con portageles de 8.5 cm ancho x 18.5 cm largo; y peines de la misma
marca de 1 mm de ancho con 16 posiciones.

10.4 Cuantificacin de ADN

Para conocer la concentracin de ADN cada una de las muestras analizadas, se cuantific
por espectrofotometra de UV/Luz visible, (D.O. 260/280) (Helios Alpha UV-Vis
spectrophotometer, Unicam), el clculo del contenido de ADN se basa en el concepto de
que una unidad absorvida a 260 nm (Una DO de 1) equivale a a 50 g/ml de una doble
cadena de ADN (Sambrok y Rousell 2001). Las longitudes de onda utilizadas por el
espectrofotmetro son 260 nm y 280 nm (Densidad ptica: OD260:OD280) y una tasa
(cociente) entre 1.5 y 2.0 lo que corresponde a un rango de peso molecular entre 20 y
100 kb (Sambrook y Rousell, 2001).

10.5 Tcnica de espectrofotometra

Se tom como referencia el resultado de la longitud de onda a 260 nm y el resultado se

multiplic x 200 (dilucin), x 50 (densidad ptica 50g/ml) y x 10 (conversin de mg a
ng). Este resultado indic la cantidad de ADN que se tuvo por muestra y qu cantidad se
debi tomar para correr la PCR. El ADN se calent a temperatura de 30 C durante 30

44
min y posteriormente se realiz una dilucin 1:200, se coloc en un tubo eppendorff de 2
ml, 5 l de ADN + 995 l de agua desionizada. Como blanco se utiliz agua desionizada.
Las lecturas se hicieron por triplicado. Los resultados de cada muestra se ajustaron a una
reaccin final de 100ng/ l por cada alcuota a amplificar por PCR (Marson et al., 2005).

10.6 Protocolo para PCR

1. Para la amplificacin por PCR del locus de FSHR, las concentraciones de todas las
muestras se ajustaron a 100 ng/L. Basados en el estudio de Marson et al. (2005), se
seleccionaron los siguientes marcadores:

F5-AGTTCTTGGCTAAATGTCTTAGGGGG-3

R5-CTGCCTCCCTCAAGGTGCCCCT-3,

Los cuales corresponden a un segmento del gen de 306 pb, de Bos taurus (Gen Bank
L22319), utilizando la temperatura y ciclos de tiempo reportados por Campagnari (2002),
para FSHR (Tabla 2).

Tabla 2. Protocolo de amplificacin de FSHR

Locus Tipo Cromosoma1 Exn Secuencia (5-3) Ta Referencia

4
RFLP (C)
FSHR5 AluI 11 10 F2: CTGCCTCCCTCAAGGTGCCCCTC 58 Houde et
3
R :AGTTCTTGGCTAAATGTCTTAGGGGG al., 1994

1
Cromosoma; 2(F) (hacia delante) direccin (5-3) 3R (reversa) direccin (3-5) 4
RFLP:
5
Restriction fragment length polymorphism. FSHR: Receptor de la hormona folculo
estimulante.

En la Figura 15 se muestra el fragmento de 306 pb a visualizar por PCR en gel de

agarosa al 1.8%. Los cuadros en rojo marcan el inicio y final de un segmento del FSHR
bovino de 306pb correspondiente a las membranas seis y siete del exn 10. Los
oligonucleotidos fueron tomados del estudio de Marson et al. (2005).

45
 Figura15. Fragmento de 306 pb correspondiente a las transmembranas ubicadas en el
exn 10 del gen de FSHR.

El criterio de seleccin fue que los iniciadores elegidos deban contener una proporcin
alta de guanina (G)/citosina (C) con una temperatura de anclamiento alta (58 C) (Innis
y Gelfand, 1990). Para esto, la secuencia de primers fue revisada en los programas de
computacin Primer Express 2 de Applaied BioSystems y Blast para su anlisis de
viabilidad y homologa. Los oligonucletidos fueron elaborados por el Instituto de
Biotecnologa de la UNAM, Cuernavaca Morelos.

Cada reaccin de PCR se realiz con 100 ng de ADN, en un volumen de reaccin final de
25L, conteniendo 10X PCR buffer (Biognicas, Mxico), (20 mM Tris-HCl, pH 8.4, 50
mM KCl), 2.0 mM de MgCl2 (PROMEGA, USA), 0.5 mM de cada dNTP (PROMEGA, USA),
iniciador F 0.4 mM, iniciador R 0.4 mM y 1 unidad de Taq polimerasa (PROMEGA, USA),
de acuerdo al protocolo de Campagnari (2002), modificado por Marson et al. (2005).

El programa de amplificacin se realiz en un termociclador (MJ MINI, BIORAD) y

consisti en un ciclo a 95 C por 5 min, seguido por 30 ciclos a 95 C por 1 min, 58 C
por 30 seg y 72 C por 2 min, con una extensin final a 72 C por 10 min. Por el tipo de
secuencia en las bases contenidas en el marcador se realiz un gradiente de temperatura
para ver con cual amplificaba mejor. Las temperaturas a probar fueron 55, 57 y 58 C

46
(Rychlik, 1995). El peso a esperar fue analizado en el programa FileBuilder (Applied
Biosistem) para la evaluacin de la secuencia y realizacin de conteo de nucletidos a
partir del corte de la enzima de restriccin.

La comprobacin de amplificacin del FSHR se hizo visualizando el producto de PCR por

electroforesis en gel de agarosa al 1.8 % (PROMEGA, USA), teido con bromuro de
etidio 1l (0.5 g/ml) en Buffer TBE 1% (Trisborato-EDTA) y marcador de peso molecular
de 100 pb marca (PROMEGA, USA), utilizando una temperatura de 76 voltios con una
duracin de 40 min, a fin de localizar el segmento correspondiente al gen de FSHR. Las
muestras se consideraron positivas cuando al realizar la tcnica de PCR se amplific un
segmento de 306 pares de bases (pb), similar al reportado por Marson et al. (2005) y que
corresponde al segmento de FSHR. Cuando el segmento no se observ o tuvo peso
diferente el PCR se consider equvoco. La identificacin de los fragmentos se realiz en
un transiluminador de luz ultravioleta.

10.7 Digestin de FSHR

La tcnica de digestin se fundamenta en el corte que realizan las endonucleasas de

restriccin para identificar alelos del gen que regula a FSHR, dando como resultados
fragmentos con longitudes en pares de bases desiguales. En la Tabla 3 se presentan las
caractersticas de la enzima utilizada (Roberts et al., 2003).

Tabla 3. Nomenclatura de enzima de restriccin

AluI
GNERO Arthrobacter
ESPECIE Luteus
CEPA Rf
ENDONUCLEASA Primera
AISLADA DE LA CEPA

Los productos de la PCR fueron digeridos con enzimas de restriccin AluI (Bio Labs New
England). Arthrobacter luteus (AluI) reconoce la secuencia 5'...AG/CT...3' y 3'...TC/GA5'
(Figura 16).

47
 Figura 16. Sitio corte de la enzima AluI dentro del segmento amplificado del gen FSHR.

La digestin con las enzimas de restriccin especficas se hizo con 10 L de cada uno de
los productos amplificados, en un volumen final de 20 L; a cada muestra se aadi 5 U
de AluI, 9.5 L de 10X NEBuffer 2 (Bio Labs New England). Se incubaron las mezclas de
reaccin a 37 C durante toda la noche (Medrano y Aguilar, 1990).

Para comprobar la digestin se utiliz gel de agarosa al 2.5% teido con bromuro de
etidio 1 L [0.5 mg/mL], solucin amortiguadora de corrida TBE 1X, 4 L Marcador 100
pb (PROMEGA, USA) y 10 L de producto de digestin. Se realiz la electroforesis a
76V/30 min. La visualizacin de los fragmentos se realiz en un trasluminador UV
ULTRA-LUM, la imagen se analiz mediante un sistema de documentacin automtica de
geles Gene-Snap, Spectronic.

11. INDUCCIN DE OVULACIN MLTIPLE

11.1 Sincronizacin del estro

A las vacas que se encontraban ciclando a la palpacin rectal y con un cuerpo lteo
funcional, se les aplic 25 mg de Dinoprost trometamina (Lutalyse, Pfizer Mxico) va
i.m. observndose la manifestacin de celos durante los tres siguientes das. El protocolo
de induccin de OM inici en el da 10 del nuevo ciclo posterior a la sincronizacin, con la
aplicacin i.m. de dosis descendentes (AM y PM) de Folltropin-V (cada 20 mL contienen

48
FSH equivalente a 400 mg de NIH-FSH-P1, Veterpharm, Cnada, dosis estndar) para
todas las vacas de la siguiente manera: da 10 y 11 del ciclo, 40 mg; da 12, 20 mg; da
13, 20 mg ms 25 mg de Dinoprost trometamina detectndose los celos durante los tres
siguientes das. La palpacin rectal se realiz 7 das posteriores al celo detectado. Para los
animales en anestro (sin cuerpo lteo funcional), el protocolo consisti en la aplicacin de
un dispositivo intravaginal que contiene 1.9 mg de P4 natural (CIDR, Pfizer, Mxico).
Se coloc por primera vez un dispositivo mediante un aplicador el cual fue previamente
lavado con agua simple y posteriormente desinfectado en agua con cloro. El da de
aplicacin del CIDR se inyect ECP (Cipionato de estradiol, Pfizer, Mxico).

El dispositivo fue retirado 7 das despus. Una segunda aplicacin del mismo dispositivo
fue colocado 15 das despus del retiro del primero duranter un perodo de 7 das,
observndose los celos durante los tres das siguientes e inicindose el tratamiento de OM
en el da 10 despus de iniciado el ciclo estrual con el mismo protocolo del primer grupo.
Las vacas fueron colocadas en la manga de trabajo y por palpacin rectal se evacuaron
las heces del recto. El nmero de CL se estim en este momento por palpacin rectal y
ultrasonografa.

12. ANLISIS ESTADSTICO

12.1 Variabilidad gentica (Ley del equilibrio de Hardy Weinberg)

La frecuencia gnica puede ser determinada a partir de la frecuencia genotpica en

cualquier poblacin, siempre y cuando sean conocidos los genotipos (Surez et al., 2001).
La Ley del equilibrio de Hardy-Weinberg (HW) menciona que una poblacin permanece en
equilibrio cuando las frecuencias allicas (p y q) y genotpicas (p2, 2pq y q2) permanecen
constantes de una generacin a otra debido a la asociacin de gametos (Ho, equilibrio de
Hardy Weinberg; valores significativos P<0.05, rechaza Ho). Se analizaron las
caractersticas de cada raza con las siguientes frmulas (Surez et al., 2001).

Presencia de dos alelos:

(p+q) = p + 2pq + q
Presencia de tres alelos:
(p + q+ r)= p + q + r + 2pq + 2pr + 2qr

49
Para lo anterior, se plante una hiptesis nula en donde los valores observados y los
valores esperados tienen una distribucin similar, de tal forma que el rechazo de la
hiptesis significa que no se distribuyen de forma similar y por lo tanto la poblacin no se
encuentra en equilibrio. Para comprobar el equilibrio gentico de la poblacin, se utiliz la
prueba de bondad y ajuste mediante el clculo de , que permiti comparar las
frecuencias observadas de cada genotipo en la poblacin con las frecuencias esperadas y
determinar si la poblacin se encuentra en equilibrio para este locus.

Se gener una tabla de frecuencias observadas de los alelos encontrados por genotipos
con el propsito de determinar las frecuencias genotpicas en el total del hato estudiado y
por cada raza. A partir de estas, se desarroll una tabla de frecuencias gnicas (A, B, C)
con el fin de determinar la proporcin de alelos en la poblacin (prueba de con un nivel
de significancia =0.05; Freund, 1994).

12.2 induccin de ovulacin mltiple

Como los supuestos paramtricos no se cumplen en este caso para la homogeneidad de

la muestra, se realiz un Anlisis Unilateral de Varianza de rangos de Kruskal-Wallis, con
base en observaciones ordenadas en donde el estadstico de contraste (H) tiene una
distribucin de probabilidades que puede ser aproximada por la distribucin X2 (Freund,
1994). El efecto del tratamiento se evalu mediante el contraste de medianas entre las
variables explicativas nominales raza y alelos y la variable de respuesta cuantitativa
nmero de cuerpos lteos (CL).

Se utiliz el estadstico de prueba H ajustado de Kruskal-Wallis, que sigue una

2
distribucin X , con un nivel de significancia de la prueba de =0.05. Para lo anterior, se
plantearon las siguientes Hiptesis : las distribuciones de las poblaciones son iguales y al
menos una de las poblaciones es diferente en su distribucin, de tal forma que el valor
crtico de rechazo de la Ho, estar dado por el valor de X2 para un rea bajo la curva de
(1-) y (k-1) grados de libertad. Si el valor de H es menor que el valor crtico, significa
que hay diferencia en la respuesta al tratamiento (Domnguez et al., 2007).

Valor crtico de rechazo:

2 (1-, K-1).

50
 Estadstico de prueba H sin ajuste por empate de rangos:

12 k R 2j
H = 3 (n + 1 )
n (n + 1 ) j = 1 n j

Donde:
k = Nmero de grupos
nj = Nmero de observaciones del j-simo grupo
n = Nmero total de observaciones de los grupos
Rj = Suma de los rangos en el j-simo grupo

Estadstico de prueba H ajustada por empate de rangos:

H
H'= k

T
j =1
1
n3 n
Donde:
H= Estadstico de prueba Kruskal-Wallis sin ajuste.
T = t3 -t
t = Nmero de observaciones iguales en un grupo de valores empatados. Puede haber
varias T en el mismo grupo.

Regla de decisin: Se rechaza la Ho si el estadstico de prueba H X2 (1-, K-1).

13. RESULTADOS

13.1 Extraccin de ADN Genmico

La pureza del ADN fue similar para todas las muestras en ambos hatos, con cociente
que oscila entre 1.5 y 2.0. Al cuantificar la cantidad de ADN genmico, se encontr
que las muestras obtenidas del hato hbrido tuvieron en promedio 9355.33 ng/100L,

51
en tanto que las concentraciones de los hatos Ceb y Suizo europeo tienen en
promedio 11769 ng/100 L.

13.2 Amplificacin del gen FSHR por PCR

En las 45 muestras analizadas fue posible observar la amplificacin del gen de FSHR en
un fragmento de 306 pb como se observa en la Figura 17.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

306pb

PCR Gen FSHR

Figura 17. Fragmentos amplificados de 306 pb de gen FSHR. Electroforesis en gel de

agarosa al 1.8%. Carril (M) marcador de peso molecular 100 pb; carriles (1-14) producto
de amplificacin de 14 vacas.

13.3 Determinacin del polimorfismo de FSHR (RFLP)

Con el propsito de realizar el anlisis de los resultados en los diferentes polimorfismos,

les fueron asignados las literales AA, BB y CC a los diferentes cortes realizados por la
enzima AluI, de los cuales se obtuvieron 3 segmentos para el polimorfismo FSHRAB que
fueron de 306, 243 y 63 pb; el polimorfismo para FSHRA corresponde a los fragmentos
243 y 63 pb; y el polimorfismo para el FSHRC corresponde al fragmento de 243 y 150
pb. La digestin de un segmento de 306 pb con enzima de restriccin AluI, revel la
presencia de los genotipos AA, AB y CC en los hatos estudiados, siendo los polimorfismos
AA y AB para las vacas de raza Ceb e hbridos de Ceb, y el polimorfismo CC
nicamente se encontr para las vacas Suizo europeo. El tamao de los fragmentos en
los genotipos B, A y C se muestra en las Figuras 18, 19 y 20, respectivamente.

52
 Marcador PM
Marcador PM
100pb

500
300 306 pb
243 pb
63 pb

Figura 18. La digestin con enzima AluI en gel de agarosa al 2.5% muestra los pesos
encontrados para el alelo B (pb), Carril (M) marcador 100 pb, carril (C) vacas Ceb y
carril (H) vacas hbridas de Ceb.

Marcador
MarcadorPMPM
100pb
100 pb
M C H S
Marcador PM
Marcador de PM
500 pb100pb
500 100 pb
400 pb
400
300 243 pb
300 pb 245pb
63 pb
65 pb

Figura 19. La digestin con enzima AluI en gel de agarosa al 2.5% muestra los pesos
encontrados para el alelo A (PB), Carril (M) marcador 100 pb, carril (C) vacas Ceb, carril
(H) vacas hbridas y carril (S) vacas Suizas europeas.

Marcador PM
100pb
M S S S

500
400
300
200 243 pb
150 pb

Figura 20. La digestin con enzima AluI en gel de agarosa al 2.5% muestra los pesos
encontrados para el alelo C (pb): Carril (M) marcador 100pb, carril (S) vacas Suizas
europeas.

53
13.4 Prueba de equilibrio de Hardy Weinberg

13.4.1 Frecuencias gentipicas para el total de la muestra

La Grfica 1, muestra las frecuencias de los genotipos FSHRAA, FSHRAB y FSHRCC para
el total del hato, de los 45 animales estudiados el 51% fueron homocigotos para el
genotipo AA, el 22% fueron heterocigotos para el genotipo AB y el 27% fueron
homocigotos para el genotipo CC.

Grfica 1. Frecuencias genotpicas dentro de la poblacin estudiada. El nmero de vacas

para los genotipos AA, AB y CC fueron 23, 10 y 12, respectivamente.

A partir de las frecuencias genotpicas se obtuvieron las frecuencias gnicas de la

muestra, las cuales fueron 0.62; 0.11; y 0.27 para el alelo A, B y C, respectivamente
(Grfica 2).

Grfica 2. Frecuencias gnicas dentro de la muestra estudiada.

54
Los valores polimrficos esperados de los genotipos AA, AB y CC para el total del hato
fueron 17.4, 6.2 y 3.2, respectivamente, siendo mayor la frecuencia para el polimorfismo
AA. No se encontr equilibrio gnico en el total del grupo estudiado (p< 0.05).

13.4.2 Polimorfismo gnico por raza

El alelo C (243 y150 pb) slo se localiz en el ganado Suizo europeo, este fragmento no
se ha reportado en la literatura, y no se observ en los otros grupos raciales analizados.
Mientras que, los alelos A y B se observaron en los tres genotipos estudiados, con el
mayor porcentaje del alelo A (51%) en la raza Ceb e Hbridas (Grfica 3).

Grfica 3. Alelos observados en cada raza

Las frecuencias genotpicas de cada raza para los polimorfismos AA, AB y CC fueron de
0.69; 0.28 y 0.00 para la raza Ceb; 0.75; 0.23 y 0.00 para las hbridas de Ceb y 0.03,
1 y 0.60 para los valores observados de las vacas Suizas europeas, respectivamente
(Grfica 4).

Grfica 4. Frecuencias genotpicas por raza.

55
13.5 Evaluacin de las frecuencias gnicas mediante la prueba del equilibrio de
Hardy Weinberg para cada raza

La raza Ceb nicamente present los alelos A y B, siendo sus frecuencias gnicas 0.83 y
0.17, respectivamente, y se concluy que hubo equilibrio gnico en la raza (P>0.05).

Para las hbridas de Ceb, las frecuencias gnicas fueron 0.87 y 0.13 para los alelos A y
B, respectivamente, as que se concluy que hubo equilibrio gnico en el grupo (P>0.05).

En cuanto a las frecuencias gnicas para el grupo de vacas Suizo europeo, los valores
fueron 0.17, 0.03 y 0.80 para los alelos A, B y C, respectivamente, por lo que se concluy
que no hubo equilibrio gnico para este grupo (P<0.05).

13.6 Evaluacin de la respuesta a la induccin de ovulacin mltiple

Del grupo inicial de 45 vacas, slo 31 estuvieron disponibles para la induccin de

ovulacin mltiple. Los resultados mostraron que 25 vacas (81%) tuvieron cuerpos lteos
a la palpacin transrectal y 6 (19%) no respondieron al tratamiento (Tabla 4).

Tabla 4. Valores promedio EE del nmero de cuerpos lteos de los animales que
tuvieron respuesta a la ovulacin mltiple.

Respuesta a la
n Promedio EE
OM

Con respuesta 25 11.3 1.1

Sin respuesta 6 0.8 0.4

Total 31 9.2 1.1

En cuanto al nmero de cuerpos lteos para cada una de las razas estudiadas, los
resultados se muestran en la Tabla 5.

56
 Tabla 5. Valores promedio del nmero de cuerpos lteos por raza.

Raza n Promedio EE

Ceb 14 7.5 1.9

Suizo europeo 11 12.5 1.2

Hbridas 6 7.3 2.8

La variabilidad en la respuesta se observa con el nmero de cuerpos lteos por animal

para cada una de las razas, 0 a 25, 7 a 20 y 2 a 20 para las Ceb, Suizas e hbridas,
respectivamente, como lo muestra la grfica de mximos y mnimos (Grfica 5).

Grfica 5: Valores mximos y mnimos de CL por animal, como respuesta a la induccin

de ovulacin mltiple (OM) por raza que reflejan la variabilidad en la respuesta.

Los resultados de la prueba no paramtrica de Kruskal-Wallis para el anlisis de la

variable explicativa nominal raza (Ceb, Hbridos y Suizo europeo) con la variable de
respuesta cuantitativa nmero de cuerpos lteos a la palpacin rectal, mostraron que la

57
prueba no es significativa respecto a los tres grupos de raza (p>0.05), por lo tanto la
raza no est asociada con la respuesta (Tabla 6).

Tabla 6. Resultados de la raza con la respuesta a OM (CL)

H(2, n=31) = 5.762; p = 0.0561

Variable dependiente: Total de Cuerpos Lteos

Raza n Suma Rangos Rango Medio

Ceb 14 185.5 13.1

Suizo 11 234 21.2

Hbrido 6 78.5 13.0

En cuanto al nmero de cuerpos lteos para cada uno de los genotipos, los resultados se
muestran en la Tabla 7.

Tabla 7. Valores promedio del nmero de cuerpos lteos por Genotipo.

Genotipo n Promedio EE

AA 16 9.1 1.9

AB 5 3.8 1.3

CC 10 12.3 1.3

Al relacionar los genotipos AA, BB y CC con la variable de respuesta a OM (CL), se

encontr que para AA 12 vacas respondieron a OM (12/16=75%), para AB 3 vacas
respondieron a OM (3/5=60%), y para CC 10 vacas respondieron a OM (10/10=100%).

La variabilidad con respecto al nmero de cuerpos lteos desarrollados para cada uno de
los genotipos fue de 0 a 25, 7 a 20 y 0 a 8 para AA, CC y AB respectivamente, como lo
muestra la grfica de mximos y mnimos (Grfica 6).

58
Grfica 6. Valores mximos y mnimos de CL como respuesta a la induccin de ovulacin
mltiple (OM) por alelo encontrado. Diferente literal indica diferencia estadstica (P<0.05)

Los resultados de la prueba de Kruskal-Wallis para el anlisis de los genotipos AA, AB y

CC con la variable de respuesta nmero de cuerpos lteos a la palpacin rectal muestran
que el genotipo AB es diferente con respecto a los genotipos AA y CC (p<0.05) y entre AA
y CC no hay diferencia (Tabla 8).

Tabla 8. Resultados del factor alelo con la respuesta a induccin de OM (CL).

H(2, n=31) = 7.004; p = 0.0301

Variable dependiente: Total de Cuerpos Lteos

Genotipo n Suma Rangos Rango Medio

a
AA 16 246 15.3

b
AB 5 40 8.0

a
CC 10 210 21.0
Diferente literal indica diferencia estadstica (P<0.05)

59
14. DISCUSIN

14.1 Variabilidad gentica

El anlisis por PCR-RFLP revel la variabilidad gentica existente entre los grupos
estudiados al identificarse tres genotipos (AA, AB y CC). El anlisis de restriccin AluI
permiti identificar tres alelos denominados A (243pb, 63pb), B (306p) y C (243pb,
150pb). Estos resultados difieren de los hallazgos de Campagnari (2002) y Loss et al.
(2008), quienes reportaron dos alelos estudiando el FSHR/AluI en poblaciones de
animales hbridos de Bos taurus y Bos indicus. De la misma manera, Marzn et al.
(2005a) encontraron dos alelos en ganado hbrido de Ceb a los que llamaron CC (243 y
63 pb) CG (243/193 y 63/50 pb) y GG (193 y 63/59).

De acuerdo con Buxade (1995), en cada locus de una poblacin puede haber dos o ms
alelos a los que se les conoce como alelos mltiples o serie allica dependiendo de la
ocurrencia de varias mutaciones en un mismo locus, en lugar de una mutacin nica que
originara un par de alelos en ese locus. Al respecto, se sabe que los alelos surgen por
mutaciones y el mismo gen de distintos individuos puede sufrir diferentes mutaciones,
cada una de las cuales produce un nuevo alelo (Audesirk et al., 2003) como es el ejemplo
en humanos de la presencia de tres alelos del gen ApoE (apolipoprotena E4) causante de
la enfermedad de Alzheimer, algunos presentes en poblacin europea occidental y otros
en la poblacin mediterrnea (Glvez et al., 2003).

El locus polimrfico result homocigoto para el alelo A en los tres grupos estudiados,
mientras que el homocigoto C solo se observ en el grupo Suizo europeo. El heterocigoto
B se observ tanto en Ceb como en hbridos. Con relacin a esto, Buxade (1995)
menciona que cada locus de un gen tiene dos alelos, uno por cada cromosoma,
heredados respectivamente de la madre y del padre, considerndose homocigoto el
individuo que tiene dos alelos idnticos y slo transmite a su descendencia una clase de
alelo, y heterocigoto a los distintos alelos para un mismo caracter, debido a los procesos
de adaptacin a las condiciones locales, asi como a factores aleatorios de cambios en las
frecuencias gnicas (Espasandn y Ducamp, 2004). Al respecto, Garnero et al. (2008)
mencionan que entre las causas bsicas de la homocigosis en una explotacin se
encuentra la intencin por parte de los criadores de obtener animales que transmitan las

60
caractersticas raciales a sus hijos con gran intensidad, y que en poblaciones pequeas y
cerradas, la consanguinidad entre los animales produce homocigosis.

El fragmento encontrado de FSHR para el alelo A (243/63 pb) fue reportado previamente
en ganado hbrido brasileo (Ceb/europeo) por Marson (2005a), lo que sugiere que este
peso podra ser caracterstico de las razas cebunas desarrolladas en el continente
americano. El ganado Ceb de Mxico se origin en Brasil, en los estados de Minas Gerais
y Baha donde se llev a cabo su formacin a partir del cruzamiento de diversas razas
provenientes de India y Espaa.

Este ganado fue trado por primera vez a Mxico en 1923 y en 1945 se recibe una
segunda remesa, introducida por el puerto de Veracruz para su distribucin por toda la
Costa del Golfo de Mxico (Sanders, 1980; Saucedo, 1984) Actualmente, el ganado Ceb
y sus cruzas se encuentran ampliamente extendidos en el trpico mexicano y aunque se
han introducido genes de otros pases, es evidente la prevalencia de rasgos de sus
ancestros brasileos (Loftus et al., 1994; Bradley et al., 1996). De acuerdo con Cervantes
(2005), una caracterstica de la ganadera de la regin es la existencia de varios
genotipos en un mismo rebao, aspecto importante al evaluar el comportamiento de cada
grupo racial y de sus mezclas ms comunes, que generalmente incluyen una raza pura.

Al respecto, Marson et al. (2005) informaron que la ventaja de la caracterizacin de las

razas es la informacin esencial para desarrollar estrategias en programas de
cruzamiento, conservacin gentica y la comprensin de conceptos genticos
cuantitativos, que permiten intensificar los mtodos tradicionales de seleccin. Sin
embargo, a pesar de la importancia evolutiva de estas razas de ganado, la literatura
disponible sobre su caracterizacin en Amrica es escasa.

Los hallazgos de la gentica molecular sugieren que las especies europeas (Bos taurus) y
Ceb (Bos indicus) provienen de diferentes subespecies de Aurochs o Bos primigenius
(Loftus et al., 1994; Bradley et al., 1996) y se sabe que tanto el grupo taurus como el
indicus poseen diferencias morfolgicas y fisiolgicas que reflejan que estos animales se
han adaptado a los diferentes climas y ambientes donde son desarrollados a travs de
diversos mtodos de seleccin gentica aplicados a lo largo del tiempo y que ambas razas
han sido seleccionadas histricamente para la produccin de leche y/o carne,
sometindolos a un proceso de adaptacin para estas cualidades, pero tambin por sus

61
caractersticas de pelaje, color, resistencia a enfermedades, fertilidad y docilidad, lo que
influye en su constitucin gentica (Loss et al., 2008). En el trpico es comn encontrar
cruzamientos de ganado Bos taurus con Bos indicus debido a el mejoramiento gentico
que proporciona la raza europea al ganado Ceb, de ah la la importancia de conocer las
frecuencias allicas presentes en los diferentes genes para identificar y utilizar sus
variacines en la mejora del ganado (Metta et al., 2005), resultado de la adaptacin al
medio ambiente y los cruzamientos realizados.

El conocimiento de estas variaciones o polimorfismos, permitir realizar mapas genticos

que pueden convertirse en una herramienta til para identificar genes responsables de
caracteres deseables de transmitir a la descendencia y localizar regiones del genoma
donde es ms probable que se encuentre el gen responsable de un carcter a estudiar
(Montaldo y Meza, 1998).

Los resultados muestran que no se encontr equilibrio de Hardy Weimberg en los tres
genotipos estudiados. Sin embargo, el anlisis por razas demostr que los hatos cebunos
s se encuentran en equilibrio, lo que seala que en este grupo racial el apareamiento ha
sido aleatorio y con ausencia de factores sistemticos que afecten su comportamiento
gentico, por lo que se mantiene estable en relacin con las frecuencias gnicas y
genotpicas. El resultado permite considerar a este grupo como un recurso cuya
diversidad gentica se ha mantenido por la presin de la seleccin natural y con fuerte
predominancia cebuna en el hato hbrido (Sanchez et al., 2007).

El anlisis por razas no mostr equilibrio de Hardy-Weinberg para la raza Suizo europeo,
debido a la alta proporcin de homocigosis presentada por el alelo C. El desequilibrio en
esta poblacin, se explica si partimos de la premisa que este hato se form originalmente
de ganado Bos indicus y por introgresin se eliminaron las caractersticas cebunas para
alcanzar la conformacin gentica europea hasta hacer la raza pura.

La sustitucin de la raza Ceb mediante cruzamientos absorbentes e introgresin para la

introduccin de genes de Suizo europeo en la poblacin cebuna, afect el
comportamiento gentico, probablemente debido al movimiento de genes de una especie
dentro del fondo de genes de otra, por cruzamientos e hibridismo interespecfico. Esto
concuerda con Vozzi et al. (2007), quienes indican que los programas de mejoramiento
generalmente llevan a la prdida de variabilidad gentica, principalmente debido al

62
incremento de la disminucin de alelos de los progenitores, a travs de procesos de
seleccin gentica y deriva, los que disminuyen la contribucin gentica de razas valiosas.

La intervencin en la formacin de un hato de factores sistemticos como migracin

(incorporacin o salida de material gentico a la poblacin) y una fuerte seleccin afectan
la presencia de equilibrio (Gardner et al., 2002; Wunsch et al., 2007). El desequilibrio
confirma el efecto de la seleccin ejercida sobre algn alelo por estar relacionado con
algn caracter productivo seleccionado o que se desee eliminar, debido a la posibilidad
del incremento en la presencia de ciertos alelos, que estn afectando las condiciones del
equilibrio (Oliva, 2002b).

La falta de equilibrio (HW) en las tres razas, confirma el efecto de factores sistemticos
que intervinieron en su formacin y concuerda con lo informado por Tambasco et al.
(2000) y Vasconcellos et al. (2003), quienes mencionan que ciertos eventos tales como
acumulacin de algunos genotipos, subdivisin de la poblacin, mutacin, seleccin y
migracin pueden resultar en un estado de desequilibrio, resultados que tambin
coinciden con lo encontrado por Steigleder et al. (2004), quienes analizaron una
poblacin de ganado Criollo, en la que no encontraron equilibrio poblacional lo que
atribuyeron al alto grado de manejo de cruzamientos y seleccin de los animales.

La dinmica de las poblaciones en la naturaleza induce cambios de tamao y estructura

como parte de su evolucin y sus ciclos biolgicos, lo que hace difcil que las condiciones
de equilibrio se den en todos los loci en una poblacin (Oliva. 2002b). En un grupo racial,
los individuos de cualquier genotipo tienen iguales tasas de supervivencia e igual xito
reproductivo. Si esto no se cumple, las frecuencias allicas cambian de una poblacin a la
siguiente (Marson et al., 2005), debido a la seleccin natural y al aislamiento
reproductivo, mecanismos que conducen a divergencia y finalmente a la separacin de
poblaciones en especies distintas (Surez et al., 2001). Adems, los cambios en una
especie como respuesta al ambiente ocurren porque los distintos genotipos tienen distinta
capacidad para sobrevivir, es decir dos individuos con igual genotipo pueden tener
distinta tasa de supervivencia como consecuencia de procesos fortuitos (Oliva. 2002a),
por lo tanto, la seleccin es una fuerza importante en el cambio de las frecuencias allicas
y producir una desviacin del equilibrio de Hardy-Weimberg donde todos los genotipos
tienen igual viabilidad y fecundidad (Suarez et al., 2001; Thompson et al., 2004).

63
El hallazgo de variantes allicas en este estudio concuerda con lo informado por otros
autores (Campagnari, 2002; Rahal et al., 2002; Marzn et al., 2005, Marzn et al., 2008)
quienes reportan la existencia de diversidad gentica y variables polimrficas presentes
en FSHR de ganado bovino y cuyos resultados sugieren que las caractersticas del gen de
FSHR tienen un papel significativo en la estimulacin ovrica, y su conocimiento
fisiolgico puede ser utilizado para predecir diferencias en la funcin de FSHR y la
respuesta ovrica a FSH, resultados que concuerdan con lo reportado por Simoni et al.
(1997), quienes informan que polimorfismos en humanos son causantes de diversos
desordenes en la maduracin folicular (Allen et al., 2003; Wunsch et al., 2005; Simoni et
al., 2008).

La variacin en la respuesta se observa tambin en programas de reproduccin asistida

en pacientes femeninas, donde la respuesta ovulatoria a la administracin exgena de
FSH es muy variable, aunque se sabe que la respuesta a una estimulacin gonadotrpica
intensa es difcil de predecir debido a las caractersticas de la paciente as como al
protocolo de estimulacin gonadotrpica, factores que parecen determinar la respuesta
individual (Perez et al., 2000, Kerkela et al., 2007; Achrekar et al., 2009). El hallazgo de
variantes allicas en el gen de FSHR en humanos, tiene impacto en la reproduccin del
individuo (Simoni et al., 1997; Wunsch et al., 2007), debido a que FSH, no acta o acta
de manera ineficiente al unirse a su receptor especfico. El gen de FSHR desempea un
papel significativo en el xito de la estimulacin ovrica (Themen y Hutanemi, 2000;
Sudo et al., 2002, Simoni et al., 1997; Simoni et al., 2008).

Estos datos reflejan la variabilidad que puede ser encontrada en la respuesta ovrica
(Gromoll et al, (1996) y sugieren que la fisiologa interna ovrica puede verse afectada
por los mutaciones presentes en el gen de FSHR las que podran afectar severamente la
gametognesis resultando en infertilidad. Al respecto, Metta et al. (2004), confirmaron en
bovinos el hallazgo de polimorfismos en las razas Ongole y Deoni de Bos indicus puros
desarrollados en India y demuestran que existe diferencia gentica en las dos razas a
pesar de pertenecer a la misma especie. Esto indica que sus procesos de adaptacin
provocaron variabilidad gentica.

Recientemente, se inform del efecto de estas variables allicas de FSHR en bovinos

sobre la precocidad sexual sin que se encontraran resultados significativos (Marson et
al., 2007) y de polimorfismos en el exn 10 del gen de FSHR en ganado Bos indicus

64
(Nelore), el cual mostr cambios en la cadena de aminocidos que tienen un efecto
directo sobre la pubertad temprana (Milazzotto et al., 2008).

Con la caracterizacin, determinacin de los polimorfismos y posterior estimacin de las

frecuencias allicas y genotpicas en las tres razas estudiadas, se contribuye al estudio
relacionado del gen FSHR desarrollado en trpico, sugiriendo que el ganado Ceb
desarrollado en Amrica presenta pesos similares para FSHR, que existen diferencias
polimrficas entre las tres razas estudiadas en la zona del trpico hmedo del Golfo de
Mxico, como resultado de su proceso de adaptacin y que el desequilibrio encontrado
muestra la fuerte seleccin a que fue sometida la raza Suizo europeo.

14.2 Respuesta a la ovulacin mltiple

14.2.1 Cuerpos lteos como respuesta a la ovulacin mltiple

El porcentaje de animales que respondieron a la induccin de ovulacin mltiple (80.6%),

concuerda con el estudio de Ak et al. (1995), quienes al estudiar la respuesta ovulatoria
al tratamiento de induccin de ovulacin mltiple con FSH en 30 bovinos Bos indicus y
Bos taurus, tuvieron respuesta similar (80.64 vs 83.3%), datos que coinciden con Bo y
Mapletof (1999), quienes consideran que entre un 20 y 30% de las vacas tratadas no
produce respuesta a los tratamientos de OM e indican que esta respuesta puede estar
influenciada por factores relacionados con el tipo de tratamiento de induccin de
ovulacin mltiple o en mayor medida por factores individuales asociados a las
caractersticas de la dinmica folicular ovrica.

Los resultados muestran que el promedio de CL en las vacas que s respondieron al

tratamiento de induccin de OM (11.32 1.1) fue similar al encontrado por Daz et al.
(1999), Ak et al. (1995) y Barati et al. (2006), 9.31 5.55, 12.0 6.3 y 12.2 0.87,
respectivamente. Sin embargo, analizando los resultados por raza, se observa que el
promedio de CL fue mayor para el ganado Suizo europeo (12.5 1.2) que para el ganado
Ceb e hbridos de Ceb (7.5 1.9 y 7.3 2.8, respectivamente).

Al respecto, los resultados encontrados en ganado europeo muestran diferencias.

Mapletoff et al. (2002) informaron valores para dos grupos estudiados de 24.3 y 18.1 CL
promedio para cada uno de los grupos, respectivamente. Gmez. (1998), encontr en las

65
razas Holstein y Pardo Suizo un promedio de 11.74. En contraste Ak et al. (1995) y
Assumpo et al. (1999), reportaron valores promedio para ganado Bos indicus de 14.33
y 15.1 CL, respectivamente. Peixoto et al. (2006), reportaron valores promedio de 10.6
CL por animal. Esta variabilidad individual fue observada en este trabajo y se refleja en
los valores mximos y mnimos de CL por vaca encontrados, (0 a 25 CL por vaca), lo que
concuerda con Santiago et al. (2002), quienes encuentran un rango de 12 a 20 CL por
vaca, resultados que reflejan una alta variabilidad.

La diferencia en la respuesta al tratamiento podra deberse a factores que producen

alteraciones en los mecanismos endcrinos hormonales que podran interferir con un
adecuado desarrollo folicular y que produciran varios folculos en crecimiento, pero pocos
folculos capaces de ovular o luteinizarse tornndose atrsicos. Esta falla en el mecanismo
de crecimiento folicular ha sido estudiada en humanos y animales de laboratorio,
atribuyndosele a diversas mutaciones en el gen del receptor de la FSH como responsable
de la falta de respuesta hormonal (Jameson et al., 1994; Simoni et al., 1997).

Los diferentes tratamientos hormonales utilizados en la induccin de ovulacin, asi como

diferentes preparaciones gonadotrpicas, pueden afectar la respuesta debido a la
capacidad del receptor para captar una seal hormonal especfica. La duracin y tiempo
de los tratamientos son otro factor importante ya que existen estudios que demuestran
que la presencia de cambios polimorficos de FSHR puede afectar la sealizacin y requerir
diferentes tiempos y diferentes dosis hormonales. Otras causas importantes de
variabilidad en la respuesta son las inherentes al animal y su medio ambiente, como son
el efecto del estrs calrico y nutricional (Bo 2002; Cobanov y Schnitkey 2003).

Diversos estudios han demostrado que el estrs calrico y nutricional inhibe el desarrollo
del folculo dominante durante el periodo preovulatorio en vacas. Como consecuencia, se
reducen tambin las concentraciones de estradiol sricas y se retrasa la declinacin de la
fase luteal tarda lo que incrementa la presencia de tres ondas de crecimiento folicular
(Wilson et al., 1998).

Existe una situacin ms grave durante la poca de sequa, en la cual disminuye

considerablemente la oferta y calidad de forrajes debido a que estos dependen
principalmente de la distribucin de las lluvias y el manejo y caractersticas de los suelos,
llegando a ser crtico el aporte de nutrientes para cubrir los requerimientos del animal.

66
Estas deficiencias nutricionales afectan negativamente la funcin hormonal (Mapletoff et
al., 2002; Gutirrez et al., 2006). Sumada a la variabilidad de especie, la variabilidad
individual es un factor presente y no controlable en los tratamientos para inducir OM y
est fuertemente influenciada por factores como la raza, la edad y las caractersticas
genticas de cada animal (Montao y Ruiz, 2005). Se sabe tambin que el momento de
presentacin de la oleada folicular podra afectarse por alteraciones fsiolgicas de los
mecanismos dentro del ovario, lo que provocara disrupcin de los mecanismos
endcrinos normales que podran interferir con un adecuado desarrollo folicular y
ovulacin (Santiago et al., 2002).

De acuerdo con Ireland et al. (2000), en bovinos existen diversos procedimientos para
manipular artificialmente la duracin del ciclo estrual, el momento de ovulacin o nmero
de folculos que crecen y ovulan, con la finalidad de disminuir la variacin existente, sin
que hasta el momento existan resultados consistentes en el nmero de folculos, CL o en
la calidad del ovocito despus de programas de induccin de ovulacin. Sin embargo, a
pesar de los avances genticos y moleculares que han permitido progresos como la
clonacin, conocer e incluso seleccionar el sexo del producto por nacer y modificar el ADN
de la clula germinal para controlar enfermedades genticas, los mecanismos precisos
que participan en la regulacin no son an del todo entendidos (Prieto y Velzquez,
2002).

Se sabe que la dinmica folicular es uno de los procesos mas importantes en la fisiologa
ovrica, y ha sido ampliamente estudiada en la especie europea (Bos taurus) (Ginther et
al., 1989; Knopf et al., 1989; Badinga et al., 1994). Sin embargo, el nmero de reportes
en Bos indicus y sus cruzas son limitados (Perea et al., 1998; Chase et al., 1998). La
fisiologa reproductiva del Bos indicus presenta diferencias con respecto al Bos taurus, el
dimetro folicular al momento de la ovulacin es menor en Bos indicus, tiene una gran
sensibilidad a las gonadotropinas, una menor duracin del estro (Medrano et al., 1996) y
comnmente expresa estro durante la noche (Baruselli et al., 2006). Adems, presenta
diferencias en las caractersticas del rea del tejido luteal (Pathiraja et al., 1986), en el
dimetro del folculo dominante (Barros et al., 1995), y el momento de la ovulacin
(Pinheiro et al., 1998; Roa et al., 2006).

El conocimiento de esas diferencias es muy importante para el establecimiento de

parmetros adecuados de evaluacin, manejo de los procedimientos de ambos tipos

67
raciales, as como tambin para el desarrollo de nuevas tecnologas que incrementen la
eficiencia reproductiva del hato.

Bo y Mapletoff (1999) informan que el tratamiento de induccin de ovulacin debe

iniciarse al comienzo de una onda de desarrollo folicular, antes de la seleccin del folculo
dominante, en la fase luteal media, cuando se produce la segunda onda folicular
(Mapletoff et al., 2002), lo que involucra el desarrollo sincrnico de un grupo de folculos,
que inician su crecimiento al ocurrir una pequea elevacin en las concentraciones de FSH
y que los tratamientos de induccin de ovulacin provocan un desarrollo uniforme de los
folculos reclutados a travs de la administracin exgena de FSH (Vzquez et al., 2004).

El rango de variacin encontrado en este trabajo concuerda con los datos de obtenidos
por Seidel y Moore (2001) y Kanitz et al. (2002), quienes informaron que existe un alto
grado de variacin en la respuesta en programas de transferencia embrionaria, a pesar
de que existen protocolos modernos basados en un profundo conocimiento del control
endcrino del ciclo estrual bovino (Binelli et al., 2006), y que los procesos reproductivos
por los cuales se asegura la continuidad de la especie bovina han sido ampliamente
estudiados (Wiltbank et al., 2002; Martnez et al., 2004; Moore y Thatcher, 2006).

Sin embargo, Greve y Callesen (2005), informaron que la variabilidad en la respuesta

podra deberse a mecanismos internos dentro de la estructura y funcin del folculo y del
ovocito que afectan su fisiologa y que pueden estar asociados a la evidencia que
demuestra las caractersticas genticas de grupos poblacionales (Tambasco et al., 2000;
Campagnari, 2002; Marson et al., 2005), los cuales deben ser estudiados profundamente.

14.2.2 Efecto de las variables allicas sobre la respuesta a la ovulacin mltiple

Actualmente en ganado bovino han sido caracterizados los polimorfismos entre las
especies Bos taurus y Bos indicus, mismas que han sido relacionadas con caractersticas
productivas (Marson et al., 2008). Sin embargo, existe evidencia indirecta de estudios
realizados en pacientes humanos, que demuestran ampliamente que las mutaciones y
polimorfismos afectan los genes de gonadotropinas (Themen y Hutanemi, 2000; Sudo et
al., 2002, Simoni et al., 1997; Simoni et al., 2008) y causan patognesis o infertilidad en
la respuesta ovrica a FSH (Aittomaki et al., 1995).

68
El hallazgo de mutaciones y polimorfismos en el gen del receptor de FSH estn reportados
como causas de infertilidad, respuesta variable (Perez et al., 2000), y formas atpicas de
desrdenes gonadales primarios en humanos. Latronico y Arnhold (2006), informaron que
mutaciones homocigotas y heterocigotas de FSHR fueron asociadas con falla ovrica
prematura en mujeres, lo que corrobora y extiende el conocimiento de las consecuencias
clnicas de la resistencia a la accin de las gonadotropinas y la importancia de la
caracterizacin de las bases moleculares de la resistencia gonadal (Aittomaki et al.,
1995; Simoni et al., 2005; De Leerner et al., 2006).

El conocimiento que en el ovario prepuberal el desarrollo folicular se encuentra detenido

hasta el inicio de la estimulacin gonadotrpica e inicia en la pubertad (Aittomaki et al.,
1995, Dierich et al., 1998) y que la pubertad normal y la fertilidad dependen de la
interrelacin entre el hipotlamo, hipfisis y factores gonadales, ha revelado que la
presencia de alteraciones genticas en este eje pueden causar fallas ovricas (Simoni et
al., 1997, Misrahi et al., 1998).

La descripcin de mutaciones del receptor de FSH provee informacin de su funcin en la

maduracin folicular. Estas mutaciones pueden producir ovarios que contengan folculos
primordiales o primarios pero sin ningn desarrollo folicular o sin ninguna respuesta
(Aitomakki et al., 1996), con el resultado de ovarios resistentes debido a mutaciones de
diferentes tipos o que afectan a diferentes partes del receptor. Adems, la mutacin
puede afectar el transporte de la protena del receptor a la superficie celular o inhibir su
degradacin, en lugar de afectar la unin hormonal e inducir fallas en la respuesta
(Aitomakki et al., 1995), que impiden que la FSH se una a su receptor adecuadamente y
por lo tanto que FSHR presente anormalidades con consecuencias clnicas en el desarrollo
de la pubertad (Beau et al., 1998; Touraine et al., 1999; Doherty et al., 2002).

Al respecto, Simoni et al. (1997) informaron que de la accin de FSH depende la

maduracin de los folculos al inducir la proliferacin de las clulas de la granulosa y la
sntesis de andrgenos mediante la activacin de la enzima de conversin aromatasa,
adems de tener un papel fundamental en la seleccin del folculo dominante, accin
mediada por su receptor (FSHR), a travs de la transduccin de la seal va el camino del
AMPc (Allen et al., 2003). En este sentido, la inactivacin parcial o total del FSHR debida
a mutaciones o polimorfismos puede ser causa de la demora del crecimiento folicular en
la etapa antral o en etapas posteriores, lo que indica que los distintos grados de actividad

69
FSH-FSHR son necesarias para promover la maduracin del folculo, si esta falla, el
crecimiento folicular puede ser detenido en varios niveles dependiendo de cuan
severamente se vea afectada la interaccin FSH/FSHR (Touraine et al., 1999).

Sin embargo, el nmero de estas mutaciones de origen natural reportadas en humanos

es pequea, consistente con un modo recesivo de transmisin y un efecto perjudicial. El
conocimiento de que esta diferencia en la respuesta a la estimulacin ovrica puede ser
debida al genotipo de FSHR proporciona informacin importante sobre la regulacin
hormonal del receptor (Perez et al., 2000). Los resultados encontrados en este trabajo
muestran que existe diferencia en el comportamiento de los alelos encontrados ya que el
alelo B (AB) heterocigoto, correspondiente al grupo Ceb e hbridos, respondi de manera
menos eficiente que los alelos A(AA) y C(CC) homocigotos encontrados. Al respecto,
Perez et al. (2000) demuestran que los genotipos encontrados de FSHR en pacientes
humanos, juegan un papel fundamental en la determinacin de la respuesta fisiolgica de
la gnada a la estimulacin de FSH, hallazgos que confirman diferentes respuestas
ovricas que proporcionan importante informacin, y sugieren que las diferencias
genticas de FSHR resultan en diferentes niveles hormonales y dependen de si las
pacientes fueron homocigotas o heterocigotas, lo que indica una fina regulacin
dependiendo del genotipo.

Con relacin a esto, Achrekar et al. (2009) sugieren que las alteraciones en el genotipo
de FSH y su receptor pueden ser uno de los factores que contribuyen a la variabilidad
observada en pacientes humanos, debido a que algunos polimorfismos o mutaciones en
el gen de FSHR, muestran patrones alterados de expresin del receptor en la superficie
de la clula y diferente afinidad hacia la FSH, bien, alteracin de la actividad en
trminos de produccin de segundos mensajeros. Esta observacin de que las variantes
allicas del receptor son determinantes de la sensibilidad a FSH sugieren la hiptesis que
los cambios genticos pueden afinar la regulacin hormonal de la fisiologa ovrica, y
pueden ser marcadores valiosos con aplicaciones clnicas que incluyan la optimizacin de
dosis exgenas de FSH en programas de reproduccin asistida (Perez et al., 2000;
Simoni et al., 2000).

Los hallazgos de Achrekar et al. (2009), concluyen que aumentos en las dosis a FSH
permiten la maduracin folicular y consideran que adems de la edad, la historia
reproductiva, el ndice de masa corporal, las diferencias en el genotipo de FSHR son una

70
razn posible para la alta variabilidad de la dosis de FSH exgena requerida para obtener
una respuesta similar en todas las pacientes, reflejando que pacientes con respuesta
polimrfica homocigota tienen un umbral ms amplio a la respuesta a FSH, en asociacin
con un largo intervalo de la lutelisis a la prxima ovulacin y una duracin ms larga de
los ciclos menstruales, observacin que sugiere que las pacientes homocigotas pueden
ser ms resistentes a la accin de FSH y por lo tanto necesitan dosis mayores para
obtener respuesta.

Al respecto, Greb et al. (2005,) mencionaron que estos hallazgos tienen importantes
implicaciones clnicas para la optimizacin de la hiperestimulacin ovrica controlada en
reproduccin asistida. El conocimiento de que los diferentes umbrales de FSH dependen
del comportamiento gentico de FSHR, implica que dosis diferentes y posiblemente
diferentes tiempos de administracin exgena a FSH deben ser instrumentados para
lograr la respuesta ovrica deseada evitando los efectos colaterales (Hohmann et al.,
2001). Diversos estudios clnicos apoyan la validacin de este enfoque farmacogentico, e
indican que el ajuste de la dosis inicial depende del genotipo del receptor del paciente
(Sudo et al., 2002; De Castro et al., 2003; Prez et al., 2005; Behre et al., 2005). Simoni
et al. (2008), informaron que es claro que el FSHR es polimrfico, pero entender cules
de estas variantes allicas tienen impacto fisiolgico sobre la reproduccin debe ser ms
estudiado.

En ese sentido, Perez et al. (2000) y Achrekar et al. (2009), determinaron las variantes
allicas presentes de los polimorfismos estudiados, mediante la secuenciacin de los
productos de PCR, dato que sirvi para determinar la posicin de la variante polimrfica
en la cadena de ADN del gen y el aminocido afectado, estudios que deberan ser
realizados en bovinos para un mejor entendimiento del efecto de cada tipo de
polimorfismo en la respuesta ovrica inducida.

Al respecto, Pea et al. (2007), informaron que el ganado Bos indicus presenta una
mayor sensibilidad que el ganado Bos taurus a las dosis actuales de hormonas utilizadas
en los programas de OM, datos que concuerdan con Baruselli et al. (2006), quienes
mencionan que el Bos indicus necesita dosis ms bajas de FSH que el Bos taurus para
obtener respuesta a la OM, por lo que sera importante secuenciar los cambios
polimrficos presentes en cada especie y determinar la manera que afectan la respuesta,
as como los umbrales de accin al estmulo hormonal, como lo realizaron Kerkela et al.

71
(2007) y Achrekar et al. (2009) y sugieren que en pacientes humanos, los protocolos de
OM pudieran ser modificados de acuerdo al genotipo del receptor y a la posicin del
aminocido afectado, ajustando no solo la dosis administrada sino tambin el tiempo de
estimulacin, lo que tendra posibles beneficios en el ajuste de acuerdo a la respuesta que
se espera obtener, y significara mejoras no solo en lo econmico sino tambin en
trminos de aceptacin del tratamiento.

El conocimiento de la variabilidad gentica y la estructura de las diferencias genticas

entre las poblaciones facilitan el desarrollo de estrategias de seleccin para programas
reproductivos. De acuerdo con Van Eenennaam (2009), la informacin de los marcadores
puede ser utilizada para incrementar la frecuencia del gen que est asociado
positivamente con la caracterstica de inters, mediante la seleccin de animales
portadores de copias del mismo. Sin embargo, es importante considerar que los
resultados de asociacin de dichos marcadores deben ser validados en poblaciones
locales, ya que las asociaciones de marcadores de caractersticas de inters econmico
pueden ser errneas o malinterpretadas si fueron desarrolladas en ganado Bos taurus y
son empleadas en ganado Bos indicus (Casas et al., 2005) por lo que es necesario ms
estudios sobre el efecto de estas variables en la Fisiologa reproductiva bovina.

15. CONCLUSIONES

Las frecuencias gnicas y genotpicas (Ley de Hardy Weinberg) del gen FSHR, varan
entre vacas Bos taurus, Bos ndicus e hbridas afectando la ovulacin mltiple. Los
efectos interactivos e individuales de los polimorfismos en bovinos no han sido estudiados
sobre respuestas especficas reproductivas como la ovulacin mltiple, desconocindose
si dosis mayores o tiempos ms largos de estimulacin ovrica pudieran tener efectos
sobre la respuesta (CL) dependiendo del genotipo presentado, por lo que estos hallazgos
debern ser complementados y ampliados en estudios posteriores en bovinos.

La diferencia en las variables polimrficas del gen del receptor de FSH (FSHR), modifica la
respuesta a la ovulacin mltiple, lo que se observ en animales con genotipo AB, los que
respondieron de manera menos eficiente a la accin de FSH, resultados que sugieren que
la respuesta ovrica a la estimulacin, depende en gran medida del genotipo del
receptor, por lo que es necesario extender la informacin acerca del entendimiento del
genotipo de FSHR y la respuesta a la estimulacin ovrica.

72
Los resultados aqu obtenidos sugieren que el conocimiento de los genotipos del receptor
de FSH podran ser utilizados como marcadores para predecir respuestas individuales a
FSH y podran ayudar a entender los mecanismos endcrinos hormonales ovricos para
desarrollar protocolos de OM, en animales valiosos con pobre respuesta a la induccin de
OM.

Los efectos interactivos e individuales de los polimorfismos en bovinos no han sido

estudiados sobre respuestas especficas a OM, se desconoce si diferentes dosis o tiempos
de estimulacin ovrica asociados al genotipo, tienen efectos sobre la respuesta (CL)
dependiendo del alelo presentado, por lo que estos hallazgos debern ser
complementados y ampliados en estudios posteriores.

17. PERSPECTIVAS

En la Fisiologa ovrica bovina se producen una serie de mecanismos que conllevan al

proceso de crecimiento y maduracin folicular hasta alcanzar la ovulacin, respuestas
que dependen de que se efectue con xito el acoplamiento entre las diferentes hormonas
producidas por el eje hipotlamo-hipfisis y sus receptores gonadales. La hormona FSH,
sin embargo, es el factor determinante en este proceso ya que de la unin a su receptor,
se deriva toda la sealizacin en cascada que ocurre en el interior de la clula y que
desencadena una serie de procesos y cambios ovricos importantes que van desde la
maduracin folicular hasta el proceso de ovulacin. Est demostrado en humanos y
animales de laboratorio que fallas en la unin FSH-FSHR afectan la respuesta celular, ya
sea de manera fisiolgica o utilizando tratamientos de induccin de ovulacin mltiple.

De lo anterior deriv en pacientes humanos la importancia estudiar los diferentes

genotipos y variantes allicas que puede presentar el gen que regula al receptor en los
diferentes individuos, ya que que el cambio de una sola base nucletida altera o suprime
la sealizacin en cascada y los eventos posteriores al acoplamiento en las clulas de la
granulosa.

En este trabajo se detectaron variantes allicas en las tres razas estudiadas, sin que se
hayan determinado ni la base nucletida ni la posicin en el gen donde se produj la
mutacin. Sin embargo, en humanos, la secuenciacin de estas variantes ha permitido
conocer exactamente la posicin de la base nucletida en el gen que presenta alteracin,

73
determinar el tipo de mutacin existente y el comportamiento de la misma, conocimiento
que deriv en el diseo de tratamientos especficos de acuerdo a cada genotipo
encontrado y el ajuste de la dosis y tiempo del tratamiento de induccin de OM
logrndose mejores respuestas.

Por lo anterior, se propone continuar esta investigacin hasta la etapa de secuenciacin y

determinacin de la mutacin existente, para poder mejorar las dosis de respuesta
dependiendo del genotipo encontrado y de esta manera disminuir la variabilidad posterior
al tratamiento.

Se propone tambin realizar la caracterizacin del genotipo de FSHR en otros hatos de

ganado Suizo Europeo de la regin para comparar los resultados aqu encontrados.

74
18. BIBLIOGRAFA

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