C.E.S.E.

INFORME FINAL DE LAS 4

SESIONES DE LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA
2*B

Integrantes:
Seccin 3 A
Miriam Genaydy Gonzlez
Liliana Ceballos Arroyo
Nelly Paola Ramrez Jimnez
Seccin 3 B
Dulce Guadalupe Daz Lozano
Bruno Emmanuel Tenorio Saavedra
Yulissa Mirn

1 SESIN 5 TMB
 El da 21 de febrero del 2017

PRACTICA 1. ESTERILIZACIN EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGA

Realizado por equipo 3 seccin A

BIOSEGURIDAD

La bioseguridad es un conjunto de normas, medidas y protocolos que son aplicados en

mltiples procedimientos realizados en investigaciones cientficas y trabajos docentes con el
objetivo de contribuir a la prevencin de riesgos o infecciones derivadas de la exposicin a
agentes potencialmente infecciosos o con cargas significativas de riesgo biolgico, qumico
y/ fsicos, como por ejemplo el manejo de residuos especiales, almacenamiento de reactivos
y uso de barreras protectoras entre otros. Las tcnicas microbiolgicas apropiadas y el uso
correcto del equipo de bioseguridad por personal bien adiestrado siguen siendo los pilares
fundamentales de la bioseguridad en el laboratorio.4

BIOSEGURIDAD REQUERIDA EN LABORATORIO

Para poder ingresar a laboratorio debamos tener el cabello totalmente recogido de

preferencia sin haberle aplicado algn elemento fijador ya que con este se corra el riesgo de
que al estar expuestos al mechero la flama al contacto con los qumicos aplicados en el fijador
podran comenzar a incendiarse ocurriendo un accidente.

As mismo debamos de contar con gorro que cubriera perfectamente nuestra cabeza

Cubre bocas cubriendo perfectamente desde la parte baja del mentn hasta la parte media de
la nariz.

Guantes correctamente colocados y no deban quedar grandes ya que disminuyen la facilidad

de manipulacin del material, adems previamente tendras que haber hecho un lavado
perfectamente con agua y jabn seguido de la aplicacin de alcohol.

Bata totalmente cerrada,

Sin aretes en caso de mujeres.

Lentes de proteccin.

Una vez que cumplieras con dichos requerimientos tenas derecho a acceder a laboratorio.

2 SESIN 5 TMB
INSTRUMENTAL UTILIZADO EN EL LABORATORIO.

Palitos de madera delgados (Aprox.20 piezas)

2 pliegos de papel de estraza o manila
1 paquete de abate lenguas
1 encendedor
Alcohol 96(1 litro por equipo)
Bolsa de algodn de 250gr
Benzal
Mechero
Sanitas
Alcohol al 96 %
Cinta testigo
TCNICAS DE ASEPSIA APLICADAS

Limpieza del rea de trabajo utilizando

o Sales de benzalconio: es un desinfectante, tensioactivo, bactericida e
inhibidor de la actividad viral. Su frmula condensada es n-alquil metil bencil
cloruro de amonio.
o Es utilizado como sanitizante y desinfectante sin considerar su
propiedad fungicida, especficamente sobre los
gneros Trichophyton, Epidermophyton" y "Candida, al igual que otros
compuestos de amonio cuaternario, como cloruro de
alquildimetilbencilamonio y cloruro dedidecildimetilamonio.
o Alcohol al 96 % : Su principal forma de accin antimicrobiana, es mediante
la desnaturalizacin de las protenas, permitiendo la ruptura de membranas.
La accin microbicida del alcohol a diversas concentraciones ha sido
examinada a una amplia variedad de especies, con periodos de exposicin de
10 segundos a una hora. A concentraciones de 60%-80%, tanto el etanol como
el isopropanol, son potentes agentes virucidas, inactivando casi todas las
especies de virus lipoflicos y muchos de los virus hidroflicos. Tiene una
potente actividad antifngica, incluyendo levaduras. Los alcoholes no son
recomendados para la esterilizacin de material mdico o quirrgico, debido
principalmente a que es incapaz de daar a microorganismos esporulados y
no puede penetrar materiales ricos en protenas. 3
o Flameado: es un procedimiento simple y eficaz, consiste en la exposicin de
un objeto a efecto de la llama hasta la incandescencia. Se esteriliza de esta
forma.1

o Mechero: Los mecheros son instrumentos de laboratorio diseados para

obtener una llama calorfica a partir de la combustin del alcohol o del gas.
3 SESIN 5 TMB
 El mechero tiene una funcin utilitaria muy diversa: se emplea a diario para
esterilizar los instrumentos de siembra de nicrn o platino, mediante su
exposicin directa a la llama, que los calentarn al rojo vivo en pocos
segundos. Para flamear la boca de los tubos de ensayo y otras cristaleras
estriles. Por su parte externa con el objetivo de eliminar los microorganismos
contaminantes, como paso previo a la realizacin de siembras, resiembras,
distribucin de medios de cultivo en placas y otros procederes. El mechero
tambin es utilizado para fijar frotis en lminas portaobjetos y calentar medios
de cultivo durante su preparacin.2
PROCEDIMIENTO

Tras haber llegado tarde a la prctica.

Para comenzar con la prctica debamos esterilizar

nuestra rea de trabajo a travs de:

1.- Rociar sobre la superficie de trabajo benzal y

limpiarlo con sanitas.

2.- Rociar alcohol alcohol al 80% y procedemos a

encenderlo.

3.-Finalmente se prende el alcohol con el encendedor pero previamente

se debi de avisar a la gente de alrededor que se hara dicho paso.

Cuando ya se encontraba limpia el ares de trabajo continuamos con la

colocacin del mechero del cual su manguera la tenamos que mojar
levemente para que de mejor manera pudiera ingresar a la tubera del
gas la cual agarrbamos firmemente para evitar el movimiento. Al
tenerlo ya colocado tuvimos que prenderlo una vez hecho esto nadie
poda pasar corriendo para evitar que la llama se descontrolara.

Era importante saber que debamos de trabajar en un dimetro de 15 cm para

mantener nuestro trabajo sin infectarse. Teniendo en cuenta esto
comenzamos a trabajar.

4 SESIN 5 TMB
 Realizacin de hisopos

1.- Cortamos los palitos de una tamao considerable y aqu nuestro error
fue que al cortarlo no los tomamos con suficiente fuerza y se nos cay
uno al piso por lo tanto ese palito ya no lo podamos ocupar.

2.- Se nos haca difcil el trabajar sin que nuestra bata rosara el rea de
trabajo

3.-Una vez cortados los palitos lo siguiente fue tomar un poco de

algodn y con un poco de agua mojarlo.

4.-Al ya estar mojado el algodn, con bastante presin y girando tenamos que ir
compactando el algodn en el palito de manera que se formara la cabeza del hisopo. En
algunos isips fracasbamos ya que no obtenamos la forma deseada o nos salamos de
nuestra rea estril.

5.- Cuando ya contbamos con los hisopos necesarios procedimos a hacer la

bolsita en la que los guardaramos, dicha bolsita fue hecha con el papel estraza,
sellada con cinta masquin y se le coloco una pequea tira de cinta testigo para
verificar que al estar en el autoclave se hubiera esterilizado.

Cuando terminamos esto tuvimos que hacer el mismo proceso del comienzo
limpiar nuestra rea de trabajo a travs de:

1.- Rociar sobre la superficie de trabajo benzal y limpiarlo con sanitas.

2.- Rociar alcohol alcohol al 80% y procedemos a encenderlo

3.-Finalmente se prende el alcohol con el encendedor pero previamente se debi de avisar a

la gente de alrededor que se hara dicho paso.

Una vez realizado esto colocamos los guantes, cubre bocas y gorro en el bote. Y por nuestra
impuntualidad no terminamos toda la prctica nos falt realizar 2 paquetes de hisopos y 3
paquetes de abate lenguas.

REFERENCIAS

1.-Puigdomenech, G.Microbiologa: Esterilizacin y desinfeccin como control de

enfermedades.Abril 27,2017, de Monografias Sitio web:
http://www.monografias.com/trabajos15/esterilizacion-desinfeccion/esterilizacion-
desinfeccion.shtml.

2.-Belkins.A. Captulo 6. Esterilizacin y desinfeccin. Abril 27,2017, de Libros de Autores

cubanos Sitio web: http://gsdl.bvs.sld.cu/cgi-bin/library?e=d-00000-00---off-0preclini--00-

5 SESIN 5 TMB
0----0-10-0---0---0direct-10---4-------0-0l--11-mi-50---20-about---00-0-1-00-0-0-11-1-
0gbk-00&a=d&cl=CL2.11&d=HASH01ebc63ab80c0bbb5a182dab.9.12

3.-Rodriguez, V.. (2014). Para qu sirve el alcohol?. Abril 21,2017, de Para que sirve.. Sitio
web: http://paraquesirven.com/para-que-sirve-el-alcohol/

4.-Pagella, H.. (Octubre 31,2014). MANUAL DE BIOSEGURIDAD PARA

ESTABLECIMIENTOS DE SALUD. Abril 27,2017, de Ministerio de salud, desarollo social
y deportes Sitio web: http://salud.mendoza.gov.ar/manual-de-bioseguridad-para-
establecimientos-de-salud-capitulo-18-bioseguridad-en-laboratorios-de-microbiologia/

6 SESIN 5 TMB
 El da 28 de febrero

PRACTICA 2. PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

Realizado por equipo 3 seccin B

OBJETIVOS: Conocer la metodologa de preparacin y requerimientos de los diferentes

medios de cultivo, aplicando los conceptos de nutricin bacteriana. Elaborar un medio de
cultivo casero con microorganismos tales como Streptococcus ssp.

Inicio de la prctica

Esta prctica dio inicio a las 3:00 pm, el equipo ha sido puntual con la hora,
Hemos dado inicio a la prctica, con indicaciones del Dr. Nos hemos colocado las barreras
de proteccin antes de entrar a laboratorio.

Barreras de proteccin

Cubre bocas
lentes de proteccin
cofia
bata desechable
gorro

A pesar de que llegamos a la hora que se haba acordado en estarnos vistiendo con las barreras
de proteccin perdimos demasiado tiempo.

Pues ya eran mas de las 3:10 pm y aun no estarabamos a laboratorio

Al ingresar al laboratorio dejamos las cosas (mochilas) lejos de las reas de trabajo. Para no
llevar contaminantes a la mesa, ni de la mesa nuestras mochilas.

Despus tomamos nuestro material de trabajo para la practica y lo dejamos en recipientes de

color ya que los rojos eran para los deshechos.
De esta manera continuamos con lo que habamos ledo en la prctica y lavamos nuestras
manos y despus colocamos los guantes.

7 SESIN 5 TMB
 Materiales que se
ocuparan en la
practica

Limpiamos la mesa con benzal por primera vez, pero de pronto el Dr. Le dijo a mi compaera
que haber tocado la mesa por accidente se tenis que volver a limpiar y por segunda vez se
limpia toda la zona de trabajo.

Por segunda vez

limpiando la zona
de trabajo

8 SESIN 5 TMB
 Limpieza con benzal

Posteriormente le volvimos a rociar alchool a la mesa y se prendio fuego pero la observamos

y nos dimos cuenta de que no estaba seca en su totalidad

Nuestro primer paso a resultado ser exitoso ya que Dulce logro rociar y limpiar el benzal
correctamente. Ahora tenamos que rociar de alcohol y despus encenderlo, llevando las
medidas de proteccin adecuada lo encendimos y de igual forma fue exitoso.

Limpieza con alcohol

para la desinfeccin
total de la zona a
trabajar

Observaciones:

- No se debe rociar demasiado alcohol en una sola zona

-llevarse las manos a la cara es contaminacin para nosotros y para la zona asptica

- No tocar las mochilas.

Estbamos muy acalorados por nervios de la prctica o por la tensin que se viva entre los
compaeros, todos estbamos esperando a que el Dr. Dijera que ya se tena dar inicio a la
prctica de los medios de cultivos caseros.
9 SESIN 5 TMB
A principio todo pareca ir bien, todos estbamos muy contentos porque era a una de nuestras
primeras prcticas de laboratorio para muchos pero despus los nervios y la falta de lectura
al manual nos traicionaron, ahora todo haba cambiado cuando nos empezaron a preguntar
sobre la prctica y lo que bamos a hacer, de cualquier forma y despus de la llamada de
atencin y de las indicaciones detalladas del Dr. Alberto

Despus tenamos que preparas los materiales de trabajo con las conversiones bien hechas
para tener las medidas que se iban a ocupar por cada material

Los materiales a utilizar:

1. dos cubos de caldo de pollo

2. una papa molida
3. algodn
4. alcohol 96%
5. grenetina 250g
6. penicilina
7. azcar refinada 10g
8. azcar morena 10g
9. 8 sobres de azcar esplenda.

Ahora bien una vez hecho lo bsico segua pedirles a los doctores encargados nuestro
material de trabajo que ellos tenan que entregarnos:

1. una bscula,
2. olla para esterilizar,
3. matraz Erlenmeyer,
4. parrilla de calentamiento,
5. 10 cajas de ptril estriles,
6. benzal,
7. mechero.

Por falta de audacia nadie lo pidi esperando a que ellos no los entregaran, despus de que
estos nos fueron entregados el Dr. nos dijo que si sabamos ocupar la bscula, algunos de mis
compaeros dijeron que si saban ocuparla correctamente, sin embargo despus de esto
empezamos con todo el procedimiento

Nosotros tenamos ya una tabla con cantidades exactas que debamos utilizar, cada
ingrediente deba ser pesado de forma adecuada y colocado en cada una de las cajas de la
misma manera, as que de esta manera dimos inicio con pesar nuestros ingredientes, por falta
de organizacin perdimos mucho tiempo a la hora de pesar.

10 SESIN 5 TMB
Tardamos demasiado en pesar los ingredientes pues hubo gran confusin con respecto a la
cantidad, aparte de esto el rea donde se hizo esto quedo con restos de ingredientes regados
por todos lados, por obvias razones recibimos otra llamada de atencin

Observaciones:

La bscula debe estar en 0 y la debemos de tarar antes de pasar las cosas

-No debemos de dejar la bscula con ingredientes por dondequiera debe de quedar limpia esa
zona.

Mientras hacamos esto en la parrilla ya se estaba calentando la olla con agua

Para que furamos por el agua nos dijeron que el vaso precipitado se debe tomar con
proteccin es decir guantes especiales que resistan al calor y as evitemos una quemadura.

Primero debamos verter los ingredientes

21gr. De cubo de pollo

25 gr. De esplenda

30 gr. De grenetina

11 SESIN 5 TMB
 Mientras que otro integrante se encargaba de llenar el un frasco con cierta cantidad de agua,
al final tenamos que verter todo juntos (agua e ingredientes) revolver hasta que no quedaran
grumos y en caso de haberlos debamos colarlo para eliminarlos, una vez echo todo esto se
agregaba la penicilina segn fuera el caso.

Pero el Dr. Nos dijo que La penicilina se la agregramos despus de la esterilizacin puesto
que ya estaba estril.

La mezcla que se hizo fue rpido y no quedaron grumos por lo que no era necesario que se
colara.

Los doctores al finalizar nos hicieron ver todos nuestros errores y claro nos regaaron por
haber hecho todos los procedimientos a medias y de forma inadecuada.

Y bueno por haber perdido mucho tiempo en pesar vestirnos, lavarnos etc. Nos dijeron que
ya nos retirramos que ellos haran la esterilizacin de las mesas y donde trabajamos.

Referencias:

1. http://laboratorioclinico-ldc.blogspot.mx/2008/11/tutorial-sobre-las-ptc.html
2. http://documents.mx/documents/agar-mitis-salivarius.html
3. http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm

12 SESIN 5 TMB
 El da 7 de Marzo del 2017

PRACTICA 3. TCNICAS DE MUESTRAS DE LA CAVIDAD ORAL E

INCUBACIN MTODOS DE DISOLUCIONES Y SISTEMA EN PLACA.

Realizado por equipo 3 seccin A

OBJETIVO.- Conocer el desarrollo de la toma de muestra microbiolgica de la cavidad oral, para

poder realizar el sembrado en una placa utilizando una dilucin para tener un cultivo aislado que
nos ayuda a verificar el tipo de flora.

Agar.- Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. En el agar
bacteriolgico el componente dominante es un polisacrido que se obtiene de ciertas algas
marinas y que presenta la indudable ventaja de que a excepcin de algunos microorganismos
marinos, no es utilizado como nutriente. Un gel de agar al 1-2% se licua alrededor de los
100C y se gelifica alrededor de los 40C, dependiendo de su grado de pureza. (1)

Agar Macconkey.- Por la presencia de las sales biliares y el cristal violeta se inhibe
el crecimiento de las bacterias Gram-positivas. Por la presencia de la lactosa, las
bacterias capaces de fermentarla acidifican el medio, cambiando el color del rojo
neutro y formando colonias rojas o rosadas, pudiendo presentar un halo turbio
correspondiente al precipitado biliar. Las bacterias lactosa-negativas dan colonias
incoloras. (2)
Agar Mitis salivarius.- es usado con la SolucinTellurite el 1 % en el
aislamiento Streptococcus mitis, S. salivarius yenterococci, en particular de
especmenes extremamente contaminados (3)
Agar antibitico.- selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se
aaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias,
permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancia aadidas, se vara
el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina) (4)

Siembra de cultivo.- es un mtodo para la multiplicacin de microorganismos, tales como lo

son bacterias en el que se prepara un medio ptimo para favorecer el proceso deseado. Un
cultivo es empleado como un mtodo fundamental para el estudio de las bacterias y otros
microorganismos que causan enfermedades en medicina humana y veterinaria.

Ingresamos a laboratorio, tomando las debidas medidas de bioseguridad, es decir: con el

cabello recogido, cofa o gorro, los lentes protectores, cubrebocas y bata blanca cerrada. Dos
compaeras se desinfectaron las manos con ajuga y jabon, posteriormente alcohol del 96%,

13 SESIN 5 TMB
ya que las manos estaban desinfectadas se colocaron los guantes, mientras tanto otra
compaera entreg una lista donde se pidieron los siguientes materiales:

Isopos Mechero
Abatelenguas Palillos
Algodn Solucin salina 10 mL.
Placa de Petri 2 tubos de ensayo
Benzal Asa microbiolgica
Caja de porta objeto

Para la limpieza del rea de trabajo, se aplic sales de benzalconio (benzal) imagen 1, fue
aqu donde cometimos el primer error porque debamos tener todo a la mano y se nos olvid
tomar las sanitas, ya que nos las dieron e hizo su accin el benzal se retir con ayuda de estas
y posteriormente se aplic alcohol al 96%, una vez que seco, pudimos comenzar a trabajar,
se coloc el mechero en el rea de trabajo y fue conectado al gas despus se encendi, el
profesor mientras tanto daba algunas indicaciones.

Imagen 1. Aplicacin de benzal Imagen 2. Limpiando con sanitas

En el tubo de ensayo se deban aplicar 2 ml. de solucin salina, pero se aplicaron 10 ml.
Imagen 3

Imagen3. Aplicacin de Solucion salina a tubo de ensayo

14 SESIN 5 TMB
Por medio de una jeringa se aplicaron primero 5ml y despus otros 5 ml. Aqu se cometi el
segundo error debido a que se pasaron de 5 ml en la jeringa, la solucin fue trasladada al tubo
de ensayo, este fue ingresado dentro de un frasco de cristal.

Al paciente se le hicieron se le hicieron una serie de preguntas:

Cmo te llamas? Liliana Ceballos Arroyo

Cuntos aos tienes? 19

Qu problemas tienes? Tengo sangrado de encas.

Posteriormente a estas preguntas se inici la toma de muestra pidiendo al paciente se sentara,

estuviera tranquilo y abriera la boca para que as con ayuda de un hisopo y un abate lenguas
se realiz un raspado de la zona afectada en este caso el tejido periodontal (enca) imagen 4
y 5.

Imagen 4. Toma de muestra Imagen 5. Toma de muestra

Ya que se obtuvo tal muestra, esta fue ingresada al tubo de ensayo con solucin salina
(imagen 6) mientras tanto el abate lenguas fue incinerado y tirado al RPBI (Residuos
Peligrosos Bilgicos Infecciosos), posteriormente el tubo de ensayo se sac del frasco y fue
agitado 15 segundos, y lo regresamos a su lugar, el hispo tambin se incinero y se tiro.

15 SESIN 5 TMB
 Imagen 6. Muestra en tubo de ensayo Imagen 7. Tubo agitado por 15 seg.

Al comenzar con el sembrado de cultivo cometimos el tercer error, puesto que no nos
percatamos que el asa no fue entregada, pero si se solicit dentro de la lista de materiales,
nos las entregaron y cuando esta iba poner al fuego rojo vivo se cometi el cuarto error ya
que pona el asa muy abajo y estaba deba estar ms arriba de la flama del mechero, ya que
se al rojo vivo, se enfri un poco colocndola en algodn y sucesivamente se ingres toda el
asa a la solucin aqu se cometi el quinto error, ya que solo era la punta del asa, se volvi
poner el asa al fuego, se dej enfriar y ya slo se meti la punta del asa.

Se tenan tres agares Macconkey Imagen10, Mitis salivarius Imagen9, antibitico Imagen8.

Imagen 8. Agar antibitico Imagen 9. Mitis Salivarius Imagen 10. Macconkey

El primero fue el de antibitico C+amoxicilina, era de color amarillo, el asa de puso al

mechero, se ingres al solucin salina y posterior mente se hizo el sembrado, haciendo estras
dentro del agar para realizar el frotis con la tcnica de estra cruzada imagen 11.

Imagen 11. Estra cruzada

El agar Macconkey, (MAC) era de color rojo, se dividi en cuatro partes

iguales,enumerandolas alfabeticamente de A a D, entonces la dividimos y en la parte A, se
tomo el asa y volvimos hacer el mismo procedimiento de la placa de amoxicilina, pusimos el

16 SESIN 5 TMB
asa en el mechero, la dejamos enfriar y tomanos una gota e hicimos el frotis en la parte A
del centro hacia afuera,la parte B ya no pasamos la asa por el mechero,sino que solo tomamos
la gota de muestra y la frotamos en la parte B ,igual del centro hacia afuera, en la seccion C
y D,solo frotamos lo que quedaba de muestra en la asa y la cerramos.

El agar mitis salivarius (MS) era de color azul, en esa placa, hicimos otro procedimiento, la
asa ya no la pasamos por el mechero, esta placa la dividimos en dos, en la primera parte
tomamos una gota de muestra y la frotamos en la mitad, en la otra mitad, tomamos muestra
directa de boca del paciente y la frotamos sobre la otra mitad restante, se tap.

Depues de haber acabado con las tres placas,con un plumn les pusimos el nombre de los
integrantes y las sustancias que contenan,quemamos los hisopos utilizados y los depositamos
en el cesto de basura,el asa la volvimos a poner en el compartimiento rojo,la solucion la
tiramos y pusimos los recipientes en el compartimento, tiramos el algodn y quitamos el
mechero, alejamos al mechero y al compatimiento par poder limpiar nuestra rea, pedimos
el benzal y alcohol del 96%, posteriormente empezamos a limpiar la zona de trabajo,
habiamos terminado la practica,ya solo entregamos el mechero y las placas al instructor y
nos dijo que fueramos por nuestras cosas y que ya nos podiamos quitar los guantes, lavamos
nuevamente las manos con agua, jabn y si queras alcohol del 96%.

Imagen 12 benzal y sanitas Imagen13. Alcohol

El doctor nos dio las indicaciones y nos dijo que ya nos podiamos retirar ,asi es como termina
la sesion tres. :

1.-http://www.ugr.es/~cjl/medios%20de%20cultivo.pdf

2.-http://laboratorioclinico-ldc.blogspot.mx/2008/11/tutorial-sobre-las-ptc.html

3.-http://documents.mx/documents/agar-mitis-salivarius.html

4.-http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm

17 SESIN 5 TMB
 El da 14 de marzo del 2017

PRACTICA 4. OBSERVACION MICROBIOLOGICA MEDIANTE TECNICAS DE

TINCION

Realizado por equipo 3 seccin B

OBJETIVO.- Conocer y desarrollar algunos de los mtodos ms comunes de tincin

utilizados para observar MOs. Y hacer la descripcin bsica de los MOs que se puedan
encontrar en las diferentes partes de la cavidad bucal.

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el
microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio
que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes.
Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la
presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas,
paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso
llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin
puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la
fijacin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el
protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un
portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el
proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las clulas; la
tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que es realmente, de
manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con
mucha precisin.

La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica
por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas
cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes
celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos.
Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.
Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los
constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos
colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son
sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos
de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de
grasa (1).

Preparacin de un frotis: Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota
del material que se va a teir (si es lquido) o se hace rodar el hisopo con que se tom la
muestra. Una vez que el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no est estril,
18 SESIN 5 TMB
ya no puede ser empleado para inocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja estril
para transferir una pequea cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos.
Este material es suspendido en una gota de agua o solucin salina previamente colocada sobre
el portaobjetos. Cuando se trata de colonias muy pequeas que pueden perderse en una gota
de lquido se emplea una varilla delgada de madera estril con la cual se toca la colonia
obtenindose as una fraccin apreciable del desarrollo. El material se frota directamente
sobre el portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el
portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de
un mechero de Bunsen hasta que el vidrio est tan caliente que moleste al tacto pero no queme
(1).

Ingresamos a laboratorio, con las medidas de bioseguridad correspondientes (cabello

recogido, cofia o gorro, los lentes, cubre bocas y bata blanca cerrada). Nos desinfectamos las
manos con agua y jabn, posteriormente alcohol, ya que las manos estaban desinfectadas nos
colocamos los guantes, se nos hicieron algunas preguntas sobre la informacin previa
estudiada, de cual solo se respondi un 60% de las preguntas.

El material utilizado fue el siguiente:

*Muestra problema (se tomara en el *Soporte para los portaobjetos a teir

laboratorio)
*Estufa microbiolgica
*Hisopos estriles (1 sobre por equipo)
*Caja de portaobjetos
*6 gasas estriles por equipo
*Mechero
*Alcohol 96 (1 litro por equipo)
*Microscopio ptico
*Bolsa de algodn de 250 gr (por equipo)
*Asa microbiolgica
*Kit de colorantes

Para la limpieza del rea de trabajo, siendo solo desinfeccin se aplic benzal y removiendo
con sanitas como se nos indic en la sesin 2 (imagen 1) y posteriormente alcohol al 96%.

Nos entregaron un mechero para realizar el frotis, junto con 2 muestras, una de heces fecales
(imagen 2) y otra de saliva (imagen 3) que hicieron en la sesin pasada. En la de heces fecales
no hubo crecimiento, en la de saliva si lo hubo

Posterior a esto el Doctor nos explic cmo es que se tena que realizar el frotis (imagen 4)
paso a paso siendo muy preciso y rpido.

19 SESIN 5 TMB
Imagen 1. Desinfeccin del rea de trabajo Imagen 2. Muestra de heces fecales

Imagen 3. Muestra de saliva Imagen 4. Explicacin de cmo hacer el frotis

Despus de haber visto cmo se realizaba el frotis comenzamos con el nuestro, nos
encendieron el mechero, pues se tena que trabajar cerca de este, un error que se cometi es
que echamos a perder la muestra pues con el asa se rasg (imagen 5).

Imagen 5. Muestra rasgada con el asa

20 SESIN 5 TMB
Despus de este error, el compaero destinado a realizar el frotis comenz a hacer el
mismo. Primero se toma una muestra con el asa bacteriolgica extendindolo sobre el
cubreobjetos (imagen 6).

Imagen 6. Extendiendo muestra sobre cubreobjetos

Se pas cuidadosamente el portaobjetos con la muestra de forma horizontal sobre el

mechero, haciendo a intervalos de 2 s y enfriando constantemente hasta que la muestra se
vea seca (imagen 7). Otro error que se cometi, fue que al pasar el portaobjetos se calent
demasiado y quemo la mano de muestro compaero haciendo que las bacterias se
incineraran. Esto nos dio pie para comenzar de nuevo.

Enseguida de haber terminado el frotis, comenzamos a hacer la tincin de Gram. Iniciamos

cubriendo con cristal violeta la muestra (2 a 3 gotas) durante un minuto (imagen 7).

Imagen 7. Muestra cubierta de cristal violeta

21 SESIN 5 TMB
Despus se lav suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante, se
adiciono lugol y se dej reposar por un minuto (2 a 3 gotas). Se lav con agua el exceso de
lugol, se goteo alcohol-acetona de forma continua hasta que la preparacin dejo de perder
color y enseguida se lav con abundante agua, se cubri la preparacin con safranina,
durante un minuto (imagen 8).

Imagen 8. Lavado de muestra con agua destilada.

Finalmente se lav con agua y se dej secar al aire, para despus observarse en el
microscopio (imagen 9, 10,11).

Imagen 9. Muestra despues de Tincion de Gram Imagen 10. Compaero observando la muestra

22 SESIN 5 TMB
 Imagen 11. Muestra vista desde el Microscopio

Esta vez la prctica fue un xito, pues se cumpli con el objetivo, a pesar de los detalles que
existieron.

Referencias:

1.- http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm

23 SESIN 5 TMB