MICROSCOPA

CARACTERSTICAS GENERALES DE LA MICROSCOPIA

Sobre la base de las consideraciones anteriores se ha definido la

microscopa como la tcnica que permite observar objetos con un
microscopio (simple o compuesto) y obtener una imagen aumentada
del mismo y para ello es necesario tener en cuenta estos tres
elementos:
El objeto a estudiar (preparado histolgico por ejemplo).
Una fuente de iluminacin.
Un sistema ptico.
Cuando se plantea el estudio de alguna clula, tejido u rgano,
previamente se debe definir cuales aspectos (morfolgicos,
bioqumicos, fisiolgicos, genticos, entre otros) se desean analizar, o
si se desea observar clulas vivas o clulas fijadas. En base a esto
ltimo se definir y planificar la metodologa a seguir. Se
seleccionar la tcnica de visualizacin y el tipo de instrumento
ptico para obtener las imgenes. Las tcnicas de laboratorio para
preparar la muestra y obtener el preparado histolgico que ser
observado, dependern en gran medida del tipo de microscopio
requerido para visualizarlo, segn los aspectos que han sido definidos
previamente.
De la misma manera que se ha razonado en relacin al preparado
histolgico (objeto), se debe analizar el papel que juega la luz o
sistema de iluminacin empleado. Se desea evidenciar y distinguir a
mayor aumento los detalles del objeto que se estudia. Generalmente
se habla de la iluminacin, trmino ampliamente utilizado, que en
microscopa no siempre denota el empleo de un rayo luminoso
conformado por fotones, los cuales si pueden ser captados por la
retina del ojo.
Adems de la luz solar y la luz producida por bombillas
incandescentes, tambin se pueden emplear otros tipos de
radiaciones electromagnticas, tales como la luz ultravioleta, los
rayos lser o un haz de electrones.
Para iluminar el objeto se pueden emplear dos mecanismos, ya sea
que el rayo de luz lo atraviese o que simplemente incida en cierto
ngulo sobre el objeto. En el primer caso se habla de trans-
iluminacin y en el segundo caso de epi-iluminacin.

La Trans-iluminacin
La trans-iluminacin ha sido indudablemente el primer mtodo de
iluminacin en la larga historia de la microscopa. El rayo
electromagntico (luz visible por ejemplo) debe atravesar el objeto,
en ste caso un corte histolgico. Como condiciones fundamentales
para ser observados al microscopio compuesto, los preparados
biolgicos deben ser muy delgados y transparentes. Deben ser
rebanados con instrumentos especializados (micrtomos) que
permiten obtener cortes cuyo espesor debe estar en el orden de las
micras. Rutinariamente el espesor del corte puede oscilar en un rango
que va de 1 a 5m, pero su grosor depender del tipo de clulas y
tejidos. Para el estudio de las neuronas se realizan cortes ms
gruesos (alrededor de 30 m), mientras que para el estudio de clulas
del rin, en ciertos casos son ideales los cortes de 4 m. Para la
microscopa electrnica se emplean cortes cuyo espesor est en el
orden de los nanmetros (cortes ultra finos) debido al bajo poder de
penetracin de los electrones.
La transparencia es otra cualidad que debe tener el objeto (preparado
histolgico). Las clulas son incoloras por naturaleza, pero algunas
poseen color propio (pigmentos). Para mejorar la transparencia se
emplean ciertas sustancias qumicas (agente aclarador) como el xilol,
entre otros. Ser transparente facilita en gran medida el paso del rayo
de luz. La estructura de las clulas y tejidos es muy heterognea y
crea diferentes densidades en los compartimientos intra y
extracelulares. Para mejorar la visualizacin de tales variaciones en la
concentracin de los constituyentes celulares, se pueden emplear
colorantes u otros reactivos qumicos que incrementen el contraste
entre ellas y permitan su identificacin. Esto no siempre es necesario,
puesto es factible sin ningn tipo de colorantes observar clulas con
algunos microscopios especiales, cuyo sistema de iluminacin crea
contrastes muy evidentes, que de ordinario no se observan con el
microscopio compuesto clsico.
La trans-iluminacin permite obtener un campo de visin con una
cantidad de luz importante, resaltando la estructura observada sobre
un fondo muy iluminado. El microscopio compuesto clsico emplea
este tipo de iluminacin y por ello tambin se denomina de campo
claro. La microscopa electrnica de transmisin y la mayora de
microscopios especiales tambin se fundamentan en este principio.
La Epi-iluminacin
Con esta tcnica de iluminacin el rayo de luz incide de manera
oblicua sobre la muestra. La iluminacin puede abarcar
simultneamente todo el campo de visin o por el contrario,
focalizarse en un punto determinado del objeto. Las muestras pueden
observarse sin necesidad de realizar cortes finos y en muchos casos
tampoco se emplean colorantes. La transparencia del objeto no es
imprescindible. Como efecto de la epi-iluminacin es posible obtener
imgenes tridimensionales, complementando de esta manera lo
observado con la microscopa por trans-iluminacin. Varios tipos de
microscopios emplean este mtodo y como ejemplo podemos citar
microscopios binoculares estereoscpicos para microdisecciones, y
los microscopios de epi-fluorescencia, el confocal y el electrnico de
barrido. [ CITATION Nar17 \l 10250 ]

Figura.-Comparacin de los mecanismos de iluminacin ms

empleados en microscopa. La flecha amarilla representa el haz de luz
incidente sobre la muestra, que en la trans-iluminacin atraviesa la
misma; mientras que en la epi-iluminacin el rayo incide de manera
oblicua y en este caso son los rayos reflejados los que se capturan
para formar la imagen.

DIFRACCIN
El trmino difraccin viene del latn diffractus que significa quebrado.
La difraccin es el fenmeno que se observa cuando la luz, al pasar
por el extremo de una superficie se "dobla" desvindose del trayecto
y no sigue su propagacin en
lnea recta
Cuando la luz pasa por una
rendija, no sigue su trayecto
en lnea recta, se dobla, en
otras palabras, se difracta

REFRACCIN
Las propiedades de las lentes se deben gracias a los fenmenos de
refraccin que experimentan los rayos luminosos que las atraviesan.
Cuando una radiacin electromagntica en la forma de rayo luminoso,
denominado incidente, viaja de un medio o una
superficie y atraviesa otro medio, las ondas
luminosas sufren el fenmeno conocido como
refraccin, el cual se manifiesta mediante una desviacin en la
direccin de la luz. [ CITATION WIK \l 10250 ]

La pajita parece partida, por la refraccin de la luz al paso desde el

lquido al aire.

REFLEXION
Cuando la luz (u otro tipo de radiacin electromagntica) incide sobre
la superficie de un medio (gas, lquido o slido) algunos rayos no son
absorbidos, por el contrario son rebotados y se dispersan lejos de la
superficie del medio en cuestin. El rayo que llega es denominado
incidente y el que se desva es denominado reflejado. La direccin en
que sale reflejada la luz ser determinada por el tipo de superficie. Si
es una superficie brillante o
pulida (espejo) se produce la
reflexin regular en la que
toda la luz sale en una nica
direccin denominndose
reflexin regular o especular.
Si la superficie es mate la luz
sale esparcida en todas direcciones y se llama reflexin difusa. Sin
embargo tambin puede ser reflexin mixta, en la que predomina una
direccin sobre las dems (papel brillante, superficies metlicas sin
pulir).

EL MICROSCOPIO
MICROSCOPIO SIMPLE
 Microscopio simple de Leeuwenhoek.
La muestra se colocaba en la punta
del tornillo, en frente de la nica
lente, de la que destaca la pequeez
de su dimetro.

Un microscopio simple es aquel que

utiliza una sola lente para ampliar las
imgenes de los objetos observados.
Es el microscopio ms bsico. El
ejemplo ms clsico es la lupa.
El microscopio que se observa en la foto fue construido hacia 1668 y
mide 10 cm de longitud; esos microscopios simples de una sola lente
producan una ampliacin de hasta 275 veces (275x) y tenan un
poder de resolucin de 1,4 m.; no padecan las aberraciones que
limitaban la ecacia de los primeros microscopios compuestos, como
los empleados por Robert Hooke. Con ellos Leeuwenhoek fue capaz
incluso de describir por primera vez protistas microscpicos de vida
libre y parastica, clulas espermticas, clulas sanguneas,
nematodos microscpicos, rotferos y hasta bacterias.
Tom cerca de 150 aos de desarrollo, antes de que la ptica del
microscopio compuesto fuera capaz de proporcionar la misma calidad
de imagen de los microscopios simples de Van Leeuwenhoek, debido
a dicultades en las mltiples lentes que utiliza. [ CITATION Wik \l
10250 ]

MICROSCOPIO COMPUESTO
 Un microscopio ptico compuesto, o
simplemente microscopio compuesto,
es un microscopio que cumple su
misin producir una imagen
ampliada de una muestra de algo
por medio de dos sistemas pticos
(hecho cada uno de una o ms
lentes) que actan sucesivamente.
Se distingue de un microscopio
simple (por ejemplo una lupa de
mano o una lupa de relojero) que
ampla el objeto mediante un solo
sistema de lentes (generalmente una
sola lente)
Los microscopios compuestos sirven
para ampliar mucho (tpicamente un
microscopio moderno est preparado
para elegir ampliaciones de entre 40
y 1500 veces) un objeto
transparente, el cual es iluminado
desde el otro lado, al trasluz. Se emplean para examinar cosas que no
se distinguen a simple vista, como las clulas de una muestra de
sangre o un tejido. Hay una clase especial de microscopios
compuestos, los que se llaman lupas binoculares, que se usan para
ampliar modestamente (de 4 a 40 veces en general) y para manipular
objetos pequeos y opacos iluminados desde el lado del observador,
tales como insectos, ores, joyas o el molde inicial de una moneda.

Los dos sistemas pticos por los que llamamos compuesto a un

microscopio son el objetivo, que proyecta una primera imagen, y el
ocular, que ampla la imagen anterior. La mayora de los microscopios
compuestos estn dotados de varios objetivos colocados en un
dispositivo rotatorio, el revlver, que permite alternar entre ellos.; y la
mayora de los microscopios de trabajo y profesionales estn dotados
adems de dos oculares, que amplan la misma imagen, para que la
observacin prolongada sea ms saludable; pero los microscopios no
se llaman compuestos por tener ms de un objetivo o ms de un
ocular, sino porque la imagen que ve el observador se ha forma o en
dos fases, no en una sola, como en un microscopio simple.
Un microscopio compuesto tpico tiene elementos pticos, que son los
fundamentales, y mecnicos. Los elementos pticos sirven para
formar la imagen y para iluminar la muestra. Los elementos
mecnicos controlan la distancia del objetivo a la muestra (enfoque) y
el desplazamiento de la muestra ante el objetivo, para la eleccin del
rea a examinar. Tambin hay elementos mecnicos implicados en
ajustar la iluminacin de la muestra. [ CITATION Wik1 \l 10250 ]
[ CITATION Nar171 \l 10250 ]

PARTES DEL MICROSCOPIO PTICO Y SUS FUNCIONES

* Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Capta y ampla
la imagen formada en los objetivos.
* Objetivo: lente situada en el revlver. Ampla la imagen, es un
elemento vital que permite ver a travs de los oculares.
* Condensador: lente que concentra los rayos luminosos sobre la
preparacin.
* Diafragma: regula la cantidad de luz que llega al condensador.
* Foco: dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
* Tubo: es la cmara oscura que porta el ocular y los objetivos. Puede
estar unida al brazo mediante una cremallera para permitir el
enfoque.
* Revlver: Es el sistema que porta los objetivos de diferentes
aumentos, y que rota para poder utilizar uno u otro, alinendolos con
el ocular.
* Tornillos macro y micromtrico: Son tornillos de enfoque,
mueven la platina o el tubo hacia arriba y hacia abajo. El
macromtrico permite desplazamientos amplios para un enfoque
inicial y el micromtrico desplazamientos muy cortos, para el enfoque
ms preciso. Pueden llevar incorporado un mando de bloqueo que ja
la platina o el tubo a una determinada altura.
Platina: Es una plataforma horizontal con un oricio central, sobre el
que se coloca la preparacin, que permite el paso de los rayos
procedentes de la fuente de iluminacin situada por debajo. Dos
pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un
sistema de cremallera que permite mover la preparacin. Puede estar
ja o unida al brazo por una cremallera para permitir el enfoque.
*Brazo: Es la estructura que sujeta el tubo, la platina y los tornillos de
enfoque asociados al tubo o a la platina. La unin con la base puede
ser articulada o ja.
* Base o pie: Es la parte inferior del microscopio que permite que
ste se mantenga de pie.

AUMENTO Y RESOLUCIN
Los trminos aumento y resolucin deben ser bien conocidos por todo
usuario del microscopio. El mecanismo mediante el cual se produce
este fenmeno ha sido estudiado por siglos y se explica mediante
leyes de la fsica. Considerar nicamente el aumento no es suficiente
para sacar el mejor partido del microscopio, pues otro factor, la
resolucin, determina lo que se ver.
AUMENTO
El poder de aumento de una lente est determinado por el grado de
curvatura de su superficie y la distancia focal. En las lentes convexas
mientras mayor ser la curvatura, menor ser la distancia focal y
mayor ser el aumento. Se ha enunciado anteriormente que el
microscopio compuesto aumenta en dos etapas y puesto que una sola
lente no es suficiente se deben colocar varias lentes una detrs de la
otra, potenciando de esta manera el poder de aumento. El primer
juego de lentes, cercano al objeto en estudio, se denomina objetivo y
el segundo juego, cercano al ojo del observador se denomina ocular.
Cada sistema de lentes es capaz de producir una imagen aumentada
cuyo valor se enuncia con la letra x, as que 10x significa que la
imagen est aumentada 10 veces.
Para conocer en el microscopio compuesto el aumento definitivo de
una imagen se aplica la siguiente frmula:
AUMENTO TOTAL= Aumento del objetivo x
Aumento del ocular

RESOLUCIN O PODER DE RESOLUCIN

Puede definirse como la capacidad que tiene un sistema ptico para
que dos puntos muy prximos se vean separados, La riqueza de
detalles que puede ser observada al microscopio depende de la
habilidad de este para hacer que los puntos del objeto que estn muy
cercanos aparezcan en la imagen como puntos separados. Mientras
ms corta sea la distancia entre esos puntos del objeto, ms finos
sern los detalles. La distancia entre esos dos puntos se conoce como
Lmite de Resolucin, el cual es tambin referido como el Poder de
Resolucin y puede ser utilizada como un indicador del rendimiento
del microscopio. Esto se puede comparar vagamente con algunos
aspectos de la informtica, el tamao del pixel por ejemplo; mientras
ms pequeo sea el tamao, mayor ser la cantidad de detalles de la
imagen digital. [ CITATION WIK1 \l 10250 ]
Lmites de Resolucin aproximados de algunos sistemas pticos:
Ojo humano: 0,2 mm.
Microscopio Fotnico: 0,2 m.
Microscopio electrnico: 0,2 nm.

DISTANCIA FOCAL
La distancia focal o longitud focal de una lente es la distancia entre el
centro ptico de la lente y el foco (o punto focal). La inversa de la
distancia focal de una lente es la potencia, y se mide en dioptras.
Para una lente positiva (convergente), la distancia focal es positiva.
Se define como la distancia desde el eje central de la lente hasta
donde un haz de luz de rayos paralelos colimado que atraviesa la
lente se enfoca en un nico punto. Para una lente negativa
(divergente), la distancia focal es negativa. Se define como la
distancia que hay desde el eje central de la lente a un punto
imaginario del cual parece emerger el haz de luz colimado que pasa a
travs de la lente. [ CITATION WIK3 \l 10250 ]
 IMAGEN REAL E IMAGEN VIRTUAL

La imagen real se forma por rayos convergentes que pueden ser

recogidos sobre una pantalla o una placa fotogrfica.
El trmino virtual, segn el diccionario de la Real Academia Espaola
significa: adj. Fs. Que tiene existencia aparente y no real. La imagen
virtual se forma por rayos divergentes. Son imgenes meramente
subjetivas que no podrn ser recogidas o proyectadas sobre una
pantalla o pelcula fotogrfica. Son percibidas gracias a la posibilidad
que tiene el globo ocular de seguir por detrs del objeto observado,
la proyeccin de esos rayos divergentes y los hace confluir para
constituir la imagen virtual Estas imgenes juegan un rol crucial en
los instrumentos pticos. Es el caso de la imagen formada por un
espejo plano o los espejismos sobre una superficie caliente como el
desierto o una carretera asfaltada. La lupa simple consiste en una
lente convergente que se coloca entre el objeto y el ojo. Variando su
posicin y situando el objeto sobre el foco se puede conseguir que se
forme una imagen virtual. [ CITATION WIK2 \l 10250 ]
La virtualidad de la imagen virtual consiste en que no est all
donde se percibe, se forma tan slo sobre la retina y no por fuera del
ojo en el sitio donde se ve. La percepcin visual de ambos, del objeto
real y de la imagen virtual, es idntica. La imagen retiniana no entra
en el proceso de clasificacin de realidad o virtualidad de la imagen.
El ojo est diseado para recoger haces divergentes de luz y hacerlos
converger sobre la retina. [ CITATION Nar \l 10250 ]
 Formacin de la
imagen virtual al
observar un objeto
en un espejo
plano. La imagen
virtual del objeto
se representa por
detrs del espejo,
pero realmente no
est all. Cuando
se percibe la
imagen virtual los
rayos luminosos
proceden del
espejo. Es el ojo el
que permite que
el cerebro la imagine, a partir de la figura que se forma en la retina.

FORMACION DE IMGENES EN EL OJO

Para ver un objeto claramente es necesario que la luz proveniente de
l sea centrada en la retina, en la parte posterior del ojo. Este
enfoque es logrado por dos de sus componentes, la crnea y el
cristalino. La crnea es la superficie transparente anterior del ojo y es
la que hace la mayor parte del enfoque de la luz que entra. El
cristalino, la lente que yace detrs de la crnea, logra el enfoque fino
de objetos localizados a diversas distancias. El cristalino es una
estructura transparente unida a los msculos ciliares que la rodean.

Para que el cristalino mantenga en foco a los objetos situados en

diversas distancias, debe sufrir cambios y es necesario que la lente
pueda cambiar su espesor, es decir, se acomode; de all que se
emplee el trmino acomodacin. Se han postulado por lo menos
cuatro teoras en cuanto a este fenmeno, pero todas coinciden en
que el nivel de acomodacin del cristalino es controlado por la
constriccin y la dilatacin del cuerpo ciliar que rodea la lente, gracias
a la accin de los msculos ciliares controlados por el sistema
nervioso simptico y parasimptico. La accin de los msculos ciliares
cambia el grosor y la curvatura del cristalino y por lo tanto su poder
ptico.
El nivel de acomodacin se expresa en dioptras (D). Unidad que
muestra con valores positivos o negativos el poder de refraccin de
una lente, y que equivale al valor recproco o inverso de su longitud
focal, expresada en metros, en los cuales se enfoca la lente. Por
ejemplo, si el ojo se enfoca en el infinito, el nivel de acomodacin
ser 0 D. Si el ojo se enfoca en 2 m, el nivel de acomodacin ser 0.5
D. Los objetos pueden, sin embargo, aparecer ntidos aunque el nivel
de acomodacin no sea el correcto para ese objeto. Esto es porque el
ojo tiene cierta profundidad de foco, que es un grado de acomodacin
dentro del cual los objetos aparecern aceptablemente enfocados.
La crnea se comporta como una lente tipo menisco y el cristalino
como una lente biconvexa. [ CITATION Nar1 \l 10250 ]

Formacin de las imgenes en el ojo

Acomodacin del cristalino. Para la visin lejana o cercana, su espesor

se modifica por accin de los msculos ciliares.

Bibliografa
x
 1. Narvez Armas DJ. La Microscopia - La Imagen. Sistemas pticos. [Online]. [cited 2017
Mayo 2. Available from:
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo3.htm.

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https://es.wikipedia.org/wiki/Resoluci%C3%B3n_%C3%B3ptica.

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https://es.wikipedia.org/wiki/Distancia_focal.

8. WIKIPEDIA. WIKIPEDIA - Imagen (ptica). [Online]. Available from:

https://es.wikipedia.org/wiki/Imagen_(%C3%B3ptica).

9. Narvez Armas DJ. La Microscopa - Imagen Real e Imagen Virtual. [Online]. Available from:
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo2_4.htm.

10. Narvez Armas J. La Microscopa - Nociones Bsicas de ptica - Formacin de Imgenes.

[Online]. Available from:
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo2_5.htm.