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Espectrometria de Massas

Profa. Dra. Dbora de Almeida Azevedo

MSc e DSc em Qumica Orgnica DQO/IQ/UFRJ


Ps-doutorado em Qumica Ambiental CSIC/Barcelona-Espanha
Professora Adjunta do DQO/IQ/UFRJ desde Fev/1996

LABEM Laboratrio de Espectrometria de Massas


Departamento de Qumica Orgnica
Instituto de Qumica
Universidade Federal do Rio de Janeiro

Fevereiro/2004
INTERESSES
Tcnica analtica poderosa utilizada para identificar compostos desconhecidos,
quantificar materiais conhecidos e elucidar as propriedades qumicas e estruturais de
molculas; pode ser realizada com quantidades bem pequenas (ao nvel do picograma) e a
concentraes bem baixas em misturas quimicamente complexas (ppt); gera informaes
valiosas a um grande nmero de profissionais fsicos, engenheiros de controle de processos,
qumicos, astronautas, bilogos etc.

USOS
identificar estruturas de biomolculas (carboidratos, cidos nucleicos, esterides);
seqenciar biopolmeros como protenas e oligossacardeos;
determinar como as drogas so utilizadas pelo organismo;
realizar anlises como a confirmao e quantificao de abuso de drogas;
anlise de poluentes ambientais;
determinar a idade e origens de espcies em geoqumica e arqueologia;
identificar e quantificar componentes de misturas orgnicas complexas.

INSTRUMENTAO
Grande variedade, diferentes princpios fsicos, separao de ons pela razo massa/carga:

I. disperso em um setor magntico ou em um campo eltrico radial;


II. movimento em um campo eltrico com radiofrequncia;
III. tempo de vo, aps acelerao atravs de um potencial fixo;
IV. freqncia ciclotron em um campo magntico.

A primeira etapa na maioria dos experimentos aps a ionizao a acelerao dos ons para
fora da fonte em direo ao analisador de massas.

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Os Componentes
de um
Espectrmetro de Massas
Separao dos ons

Fonte Analisador Detector

Introduo Manipulao
da dos
Amostra dados

Espectro
de
Massas

Figura 1: Esquema dos principais componentes de um espectrmetro de massas.

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Amostra - slida, lquida ou vapor
ons - fase gasosa
Condies de alto vcuo
Detector - ons geram um sinal eltrico que proporcional ao nmero de ons.

FONTE INICA
Gerao de ons (mais comum): bombardeamento de molculas gasosas com um feixe de
eltrons.
Impacto de eltrons (70 eV): mistura de ons positivos e negativos e espcies neutras.
ons positivos: direcionados para o analisador pela aplicao de voltagem positiva no
repeller. Focalizao pela voltagem aplicada nas lentes.
ons negativos e eltrons: atrados para um catodo positivo.
Molculas e fragmentos neutros no ionizados: bombeados para fora do sistema.
No processo de ionizao por impacto de eltrons (IE), a energia dos eltrons geralmente
muito maior do que a energia das ligaes qumicas das molculas;
Quando eltrons de alta energia interagem com molculas, ocorre a ionizao; ligaes so
rompidas e fragmentos formados. Esta a razo porque no s ons da molcula intacta
aparecem nos espectros de massas;
Embora ons positivos e negativos sejam gerados na fonte ao mesmo tempo, uma
polaridade escolhida, e o espectro de massas consiste de ons positivos ou ons negativos.
Partculas neutras no so detectadas;
Espectro de massas de ons positivos so normalmente os mais utilizados.

Esquema:

-
+ + +

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Figura 2: Esquema de uma fonte de ons com ionizao por impacto de electrons.

PRODUO DE ONS
de fundamental importncia a gerao de um feixe intenso, contando ons caractersticos
das molculas no dissociadas e dos processos de fragmentao relacionado estrutura:
Impacto de eltrons (IE)
Ionizao qumica (IQ)
Ionizao por dessoro qumica (DCI)
Ionizao por campo/dessoro por campo (FI/FD)
Espectrometria de massas de ons secundrios (SIMS)
Bombardeamento por tomos rpidos (FAB)
Dessoro por plasma (PD)
Dessoro por laser (LD)
Termospray (TSI)
Electronspray (ESI)
Ionizao presso atmosfrica (API)
Espectrometria de massas por neutralizao - reionizao (NRMS)

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SETOR MAGNTICO
elemento de foco direcional pois ons monoenergticos, que deixam a fonte em um feixe
divergente, so atrados ao foco do coletor,
um on acelerado em um campo magntico de fora B segue trajetria circular de raio r ;
mv/z = rB
razo massa/carga: m/z = B2r2 /2v ;
os parmetros B e v so variveis para modificar a massa do on que segue uma
determinada trajetria;
dispersa os ons de acordo com a razo momento/carga;
ons de massas diferentes mas com a mesma energia cintica emanados do mesmo ponto,
seguem trajetrias diferentes atravs do raio central do setor magntico

Fonte
Inica

Para o vcuo

Magneto

Feixe de ions
separados

Coletor de
ions
Tubo
do Sada
analizador dos
ions

Figura 3: Esquema de um espectrmetro de massas com analisador de massas utilizando


campo magntico.

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SETOR ELTRICO
setor eltrico cilndrico;
dispersa os ons com a razo energia cintica/carga;
elemento de foco direcional;
on positivo em um campo eltrico est sujeito a uma fora na direo do campo e o
percurso do on no campo curvo;
o raio da curvatura (rc), da trajetria do on depende da energia do on e da fora do campo
eltrico;
analisador de energias - serve para limitar a faixa de energias do feixe inico;
faixa de energias - fator de limitao da resoluo dos analisadores de deflexo magntica.
Somente ons de energia Ve segue a trajetria de raio r; ons com energias maiores ou
menores seguem trajetrias de raios maiores ou menores. r = 2V/E

INSTRUMENTOS DE SETORES
combinao dos setores eletrostticos e magnticos;
configurao usual a geometria Nier-Johnson;
ons de massas grandes apresentam trajetrias de raios maiores do que ons de massas
pequenas;
ons de diferentes razes massa/carga so focalizados para o detector variando a fora do
campo magntico;
a combinao da focalizao por energia e por momento, acoplando dos analisadores
eletrostticos e magnticos (focalizao dupla) gera alta resoluo, obtendo-se massa
precisa;
pode-se obter uma resoluo to alta que a massa de uma partcula medida com trs ou
quatro casas decimais;
resolve-se ons de mesma massa nominal mas com frmulas qumicas diferentes como N2
e CO a m/z 28.

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Figura 4: Esquema de um espectrmetro de massas de duplo foco, com analisador de ons por
campo eltrico e magntico.

QUADRUPOLO
analisador de massas;
usa quatro polos eltricos (um quadrupolo) e nenhum campo magntico.
ons so introduzidos no analisador com velocidades constante em uma direo
paralela aos polos (direo z) e ento, passam a oscilar nas direes x e y.
isto obtido pela aplicao simultnea de uma voltagem de corrente contnua e de
uma voltagem de radiofreqncia aos polos;
ocorre uma variao estvel que permite ao on passar de um extremo ao outro do
quadrupolo sem chocar-se com os polos;
esta oscilao depende da razo massa/carga do on;
apenas ons com uma determinada razo m/z conseguiro atravessar o analisador;
demais ons tero oscilaes instveis e chocar-se-o com os polos.
varredura de massas feita variando-se a radiofreqncia e a voltagem da corrente
contnua, mantendo-se sua razo constante.
polos adjacentes tem polaridades opostas. Idealmente, os polos do quadrupolo tem
forma hiperblica.
somente as massas dos ons e a carga so importantes na descrio das trajetrias.

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instrumentos com setores operam tipicamente com voltagens de acelerao na faixa de
KeV, enquanto quadrupolos operam com energias cinticas na faixa de 0-10 eV;
filtro de massas tipo quadrupolo o que utiliza um analisador de massas verdadeiro,
enquanto o setor magntico mede momento e o eltrico a energia;
gera baixa resoluo (unitria), mas mais facilmente interfaceada aos vrios sistemas
de introduo de amostra.

Figura 5: Esquema de analisadores de massas do tipo quadrupolo e por trapa inica.

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Figura 6: Esquema representativo da interface analisador tipo quadrupolo e
eletromultiplicador utilizando blindagem para raios-X.

ION TRAP TRAPA INICA

Paul, 1956: aparelho que mantm ons gasosos em um volume pequeno utilizando somente
campos eltricos;
so trs eletrodos: dois eletrodos de tampas terminais (end-cap eletrodes) e um eletrodo
central em anel, cada um com uma seo de corte hiperblica, forma uma cmara dentro da
qual ons podem ser confinados;
aplicao de uma voltagem de radiofreqncia (rf) ao eletrodo em anel estabelece um
campo eltrico quadrupolar;
ons de razo massa/carga apropriada tem trajetrias estveis dentro da cmara e so
confinados por vrios segundos.
1984: primeiro ion trap quadrupolar comercial.
pode ser classificado na mesma categoria de filtro de massas como o quadrupolo;
um quadrupolo tri-dimensional, e equao semelhante do on aplicada.
mtodo novo de ejetar seletivamente da cmara ons de razo m/z cada vez maiores;
para se obter o espectro de massas, a amplitude da voltagem rf aumentada, fazendo com
que ons de razo m/z cada vez maiores se tornem instveis;
so ejetados em seqncia de massas, do aparelho atravs do orifcio no end-cap.
a seqncia de operao no ITMS comea com a injeo de um pulso de eltrons para
dentro da cmara para ionizar a amostra gasosa. O eletrodo de anel mantido a baixa
amplitude de rf para manter confinados todos os ons formados durante o pulso de

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ionizao. A amplitude rf aumentada, e ons de massas cada vez maiores so
seqencialmente ejetados da cmara e detectados por um multiplicador de eltrons.
parmetro importante na operao do ion trap a presso do gs de fundo. Hlio
adicionado como um banho de gs - colises dos ons com o gs inibe a trajetria dos ons
em direo ao centro do ion trap (controle da trajetria), gerando melhor resoluo e
sensibilidade.

CARACTERSTICAS NICAS DO ON TRAP


alta sensibilidade;
faixa de massa grande, excede a 70KDa;
resoluo ultra alta (106);
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limite de deteco atomol : 10 mol;
n
espectrometria de massas de estgios mltiplos, (EM) n < 13; podendo utilizar mtodos
diferentes de decomposio de ons (coliso com gs, irradiao com fton, interao com
superfcie);
determinao inequvoca do caminho de fragmentao real;
gerao de ons na cmara por ionizao por impacto de eltrons, ionizao qumica,
injeo efetiva dos ons gerados de outras fontes por APCI, ESI, MALDI;
manipulao fcil;
efetivo para reaes on-molcula;
avaliao da polaridade de ons gasosos.

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Corte esquemtico do ITMS

Voltagem rf fundamental
end-cap
end-cap

Filamento
Detector
Anel eletrodo

Voltagem rf
suplementar

TEMPO DE VO
tipo mais simples de anlise de partculas carregadas;
nico campo envolvido a acelerao;
utiliza uma voltagem de acelerao constante; todos os ons de massas diferentes
apresentam uma velocidade diferente;
cada on atravessa uma distncia fixa em diferentes tempos;
tempo de vo de um on por uma distncia L dado por:
t = L/v ; mv2/2 = zv ; t = Lm1/2 /(2zv)1/2
ideal para anlise de ons gerados por dessoro por plasma ou laser (pulsada), pois o
processo de ionizao espacialmente e temporalmente confinado;
mtodo capaz de gerar uma anlise de massas completa para cada evento de ionizao
discreto (alta velocidade de varredura).
baseado na medida de uma diferena de tempo entre um sinal de partida e outro de
chegada;
o registro de um espectro de massas necessita de um sinal de partida proveniente de
uma sonda primria e de um sinal de trmino correspondente a chegada de um on
secundrio;

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os ons dessorvidos so acelerados por uma diferena de potencial aplicada entre o
suporte e a grade extrativa. Os ons acelerados percorrem um espao livre at o
detector. Sendo a energia de acelerao a mesma, os ons de massas diferentes se
separam no espao livre e chegam em tempos diferentes ao detector.
a fonte de 252Cf colocada pouco atrs do suporte. O processo de fisso nuclear
libera simultaneamente dois fragmentos a 180o um do outro, enquanto um produz a
ionizao da amostra, o outro detectado e gera uma marcao de tempo eletrnico.
os produtos de fisso atravessa o substrato e provoca a dessoro do depsito sobre o
suporte.
um modo de melhorar a resoluo dos instrumentos com tempo de vo o espelho
eletrosttico ou reflectron (Reflecting electrical field- campo eltrico refletor).
todo espalhamento de velocidade, e conseqentemente alargamento do tempo de vo,
no feixe de ons compensado refletindo o feixe em um campo eletrosttico pois os
ons mais rpidos penetram mais e ento tem um caminho de vo total maior.

Instrumento com Tempo de Vo

Juno Separador Fenmeno de desoro

Sinal Sinal
Partida Final
Fonte Grade Detector

Figura 7: Esquema de um espectrmetro de massas utilizando analisador de ons do tipo


tempo de vo.

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DETECTORES
corrente de ons extremamente pequena, mas pode variar rapidamente em uma faixa bem
grande;
-14 -11
a este baixos nveis, tipicamente na faixa de 10 a 10 A, rudo de fontes estranhas um
fator muito significativo;
o sinal tem que ser ampliado significativamente antes que o processamento usual dos sinais e a
manipulao das informaes possam ser aplicados;
amplificao usualmente realizada com um eltron-multiplicador. Multiplicadores geram um
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ganho de sinal na faixa de 10 a 10 . A corrente que sai de um multiplicador ainda bem
pequena e usualmente novamente ampliada;
uma performance bem alta de sinal/rudo alcanada com um certo nmero de
multiplicadores: box-and-grid, venetian blind , multiplicadores de diodo contnuo
box-and-grid : feixe de ons acelerado na direo de uma rede fina (grid) que mantido
a um potencial negativo bem alto. A maioria dos ons atravessa a rede para colidir com uma
superfcie de Cu-Be, a qual bem emissiva e ir projetar 3 a 4 eltrons para cada on que
colide. A coliso dos eltrons em uma segunda superfcie de Cu/Be leva a mais emisses de
eltrons, e o processo repetido 12 a 16 vezes.
venetian blind : semelhante ao box-and-grid.

Figura 8: Esquema de um multiplicador de eltrons to tipo veneziana (venetian blind).

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Multiplicadores com diodo contnuo: uma alta voltagem negativa, tipicamente 1800v
aplicada atravs de uma trombeta de vidro cujo interior coberto com xido de titnio. A
cobertura serve como uma superfcie de emisso.
um gradiente de potencial desenvolvido dentro do envelope. Um on colide com a
superfcie levando a emisso de vrios eltrons ;
estes iro descer a superfcie levando a mais emisses de eltrons;
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um ganho de 10 a 10 atingido com 1800 a 2000v;
para prevenir a perda de eltrons pela entrada da trombeta e parra definir o potencial de
entrada, uma rede fina fixada no topo do multiplicador;
extremamente suscetvel a contaminao da superfcie. No sensvel a contaminao por ar,
vapor dgua e a maioria dos gases reagentes da ionizao qumica;
ons positivos so atrados fortemente para o multiplicador devido a alta voltagem negativa
em sua entrada. Os ons devem ser atrados para uma rea definida sem se chocarem com as
placas protetoras.
para ons pesados, o gradiente mnimo de potencial necessrio para contornar esta inrcia dos
ons e atra-los maior do que para os ons de massa baixa. Isto fixa o limite mnimo
dependente da massa para a voltagem do multiplicador.
tipicamente, o multiplicador deve ser operado acima de 1700v para um instrumento de 800u.
a amplificao do sinal do on torna possvel a deteco de um simples on que chega ao
coletor. Embora a eficincia de ionizao e transmisso no espectrmetro de massas atinge
somente um on no coletor para aproximadamente 105 molculas da amostra introduzidas,
espectros de massas teis podem ser obtidos ao nvel do subnanograma.
Raios-X: quando ons colidem com os polos de um sistema quadrupolo, raios-x brandos
podem ser gerados. Raios-x colidindo com multiplicadores pode levar a emisso de eltrons
da superfcie pela ao fotoeltrica. A corrente devido ao raios-x pode mascarar
completamente o sinal de fluxo de ons, levando a um aumento no sinal e rudo
a coliso on-polo gera tambm um nmero significativo de molculas neutras excitadas.
Tambm leva a um aumento no sinal de sada
contornar : multiplicador deve ser montado atrs de uma placa protetora contra raios-x.

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DETECTORES
Post acceleration
Microchannel plate
Photo diode array
Eletron multiplier
com plano focal

Microchannel plate: placa fina constituda de milhes de microcanais. Uma cobertura


metlica de Ni-Cr depositada nas duas faces da placa assegura contato e emisso. Os ons
incidentes colidem com as paredes internas do canal devido a sua inclinao e provocam a
emisso de eltrons secundrios. Estes so acelerados por um campo eltrico entre as duas
faces das placas. Por choque contra a parede, os eltrons provocam uma avalanche de
eltrons, sendo recolhidos por um anodo.

sistema de deteco com plano focal: coletam todos os ons por uma faixa de massa ao
mesmo tempo. Foi aplicado por vrios anos utilizando foto-placas. Detectores com plano
focal tm se tornado disponvel comercialmente. Aumenta a sensibilidade por um fator de
100.

M ic ro c h a n n e l P la te

PCM 2 PCM 1

o n s

e- e-
1 Kv
300v

Figura 9: Esquema de um detector do tipo Microchannel Plate.

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Figura 10: Figuras de bombas de vcuo: difusora e mecnica.

INTERPRETAO DE ESPECTROS DE MASSAS


um espectro de massas apresenta a massa da molcula e as massas de pedaos da molcula;
na forma barra-grfico, a abscissa indica a massa (m/z, razo massa para nmero de cargas nos
ons) e a ordenada indica a intensidade relativa;
apresentam picos adicionais devido ao rudo de fundo do instrumento. So devidos a
compostos que so dessorvidos das paredes do instrumento. Devem ser subtrados dos
espectros de massas dos compostos;
interpretao baseada na qumica de ons gasosos;
a massa e a abundncia relativa do on molecular indica o tamanho e a estabilidade da
molcula;
o nmero de ons abundantes e sua distribuio na escala de massas so indicativos do tipo de
molcula e dos grupos funcionais presentes;
uma molcula composta de subestruturas estveis conectadas por ligaes fracas gera um
espectro com poucos fragmentos proeminentes, como o espectro de massas da nicotina.

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O on Molecular
M+. - informao mais valiosa de um espectro de massa; sua massa e composio elementar
mostram os limites nos quais os fragmentos se situam.
para determinados tipos de molculas, o on molecular no suficientemente estvel para ser
encontrado em quantidades apreciveis no espectro por impacto de eltrons;
deve ser o on de maior massa no espectro;
dever ser um on com nmero mpar de eltrons (OE+. : odd-electron ion);
deve ser capaz de gerar ons importantes na regio de massa alta do espectro pela perda lgica
de espcies neutras
no espectro por IE, a amostra se ioniza pela perda de um eltron, deixando um eltron
desemparelhado, e o on molecular se torna uma espcie radicalar. Tal on, molecular ou
fragmento, com um eltron desemparelhado denominado OE e representado pelo smbolo
+.
EE (even-electron): ons nos quais os eltrons da camada externa se encontram
compartilhados. O smbolo + utilizado (EE+);
facilidade de ionizao destes eltrons se encontra na ordem n > > ;
ons contendo somente eltrons emparelhados (EE+) so geralmente mais estveis e
conseqentemente so fragmentos mais abundantes nos espectros de IE;
Abundncia do on molecular X estrutura:
[M+.] - depende da sua estabilidade ;
[M+.] - um indcio da estrutura molecular;
[M+.] - usualmente aumenta com o aumento de insaturaes e nmero de anis;
[M+.] - usualmente diminui com o aumento do tamanho da cadeia de uma estrutura;
[M+.] - diminui com as ramificaes
Em geral, a estabilidade da molcula se assemelha a estabilidade do on M+., e refletido na
abundncia do M+. .

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Figura 11: Espectros de Massas de alcanos lineares e isoprenide, salientando suas principais
posies de clivagem.

Ionizao
abrangem duas classes : enrgica e branda;
ionizao enrgica, com eltrons de 70eV, produz uma grande proporo de molculas
ionizadas com energias internas to altas que elas se fragmentam antes de sarem da fonte
inica;
as massas desses fragmentos so as informaes bsicas das subestruturas utilizadas na
interpretao;
ionizao branda minimiza tais fragmentaes.
ionizao por eltrons: o feixe de eltrons de alta energia so gerados de um filamento
incandescente e atravessam a cmara de ionizao em direo ao anodo do outro lado. O fluxo

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-3 -5
de molculas da amostra vaporizada a uma presso de ~10 Pa (10 Torr) entra na fonte e
interage com o feixe de eltrons formando uma grande variedade de produtos, incluindo ons
positivos;
so empurrados para fora da fonte por um pequeno potencial (repeller) e so acelerados para
o analisador de massas;
maior parte das molculas so removidas por bombas de vcuo na fonte inica.
a energia de 70 eV se encontra ~10eV acima da energia necessria para ionizar as molculas.
A presso da amostra na cmara de ionizao mantida bem baixa garantindo que colises
secundrias dos ons com molculas ou eltrons sejam negligenciveis;
o resultado inicial da interao do eltron com a molcula a formao do on molecular pela
ejeo de outro eltron (OE+. );
parte ou todos os ons moleculares decompe-se posteriormente, levando aos fragmentos.
somente reaes unimoleculares so importantes na fragmentao por IE; a presso da amostra
baixa o suficiente para evitar reaes entre ons e molculas.
ionizao branda: aumentando a presso da cmara de ionizao para ~100 Pa (0,75 Torr), se
garante que a molcula da amostra sofrer centenas de colises antes de sair.
bombardeamento por eltrons no metano ou outros gases a tais presses em uma fonte inica
+
fechada (sada para o vcuo pequena) produz os ons reagentes em abundncia como o CH5
.
eles reagiro com a amostra atravs de reaes on-molcula; algumas sero bandas gerando
ons produtos estveis representando molculas no dissociadas.
+
ionizao branda leva ao on molecular MH , mais estvel, menor grau de fragmentao;
para os mtodos tradicionais de ionizao (IE e IQ) a amostra deve ser vaporizada;
introduo direta na fonte de ons preferida para compostos de baixa volatilidade. A amostra
introduzida via sonda na fonte de ons, onde vaporizada por aquecimento.

INFORMAES SOBRE A ESTRUTURA MOLECULAR


So obtidas eficientemente na seguinte ordem:
massa molecular, composio elementar, ligaes duplas, anis
subestruturas;
conectividades das subestruturas;

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possveis molculas, comparando-se cada estrutura contra todas as informaes
disponveis
Importncia relativa dos picos
maior intensidade
maior massa no espectro
maior massa no grupo de picos
Caractersticas da estrutura mais plausvel
listar todas as estruturas possveis;
predizer seus espectros a partir do mecanismo de dissociao apropriado e compare-o
com o obtido
espectros de referncia so importantes; deve-se obt-los nas mesmas condies
instrumentais utilizadas para o composto em estudo. Valores de abundncia pode variar
entre os instrumentos

PROPONDO A ESTRUTURA MOLECULAR


Regra do Nitrognio: se um composto contm tomos de nitrognio (ou um nmero par), seu
on molecular ser um nmero mpar;
H2O : m/z 18 ; NH3 : m/z 17;
Perdas neutras lgicas: h somente um certo nmero de fragmentos neutros de pequena massa
que so comumente perdidos na decomposio dos ons moleculares;
a presena de um on importante separado do on de maior massa por uma massa anmala
indicativo que o ltimo no o on molecular;
perda de fragmentos neutros a partir do on molecular so aqueles comumente conectados por
ligaes simples;
+ + +
ons importantes de massas (M - 1) , (M - 15) , (M - 18)+ e (M - 20) normalmente
representam a perda de H, Me, H2O e HF respectivamente a partir do on molecular;
tais picos de perdas de neutros pequenos so de grande significncia na deduo da estrutura
molecular.
ons caractersticos
informao estrutural difcil: h grande nmero de possibilidades. Entretanto para vrios
valores especficos h somente alguns grupos estruturais caractersticos;
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tais ons caractersticos so teis na sugesto de fragmentos possveis da molcula.
m/z 30 - aminas;
m/z 77 - fenil;
m/z 105 - metilbenzil ou benzoil;
m/z 149 - ftalato, embora muitos outros compostos possam tambm ger-los;
m/z 191 - terpanos
m/z 217 - esteranos
m/z 74 - steres metlicos
m/z 58 - metil cetonas lineares

ESPECTROS DE MASSAS DE CLASSES DE COMPOSTOS COMUNS


Marcao isotpica e outras tcnicas especiais tm sido utilizadas para se elucidar os
mecanismos de fragmentao.

Hidrocarbonetos
sofrem rearranjos randmicos, o qual reduzido com ramificaes e insaturaes.

Hidrocarbonetos alifticos saturados


apresentam on molecular pequeno;
sries tpicas de (CnH2n+1)+ ;

ramificaes levam a decrscimo na intensidade do M+. e a um aumento na abundncia


de (CnH2n+1)+ e (CnH2n )+ . devido a quebra e reteno de carga no carbono
ramificado;

Hidrocarbonetos alifticos insaturados


aumenta [M+.] somente para compostos de baixo peso molecular;
clivagem allica;
isomerizam com a migrao da ligao dupla;
ramificaes interna induzem dissociaes pelo rearranjo de hidrognio (R > H);

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mtodo para localizao de ligaes duplas: introduo de grupos funcionais nas
ligaes duplas induzindo fragmentaes com clivagens especficas de ligaes, ex.
ozonlize.

Hidrocarbonetos cclicos saturados


ons moleculares mais abundantes;
decomposies do esqueleto do anel deve envolver clivagem de no mnimo duas
ligaes;
correlao espectral cuidadosa pode dar informaes estruturais valiosas;
Exemplo: 5--pregnano
(M - CH3)+ advm da perda do grupo metila angular, principalmente C19 ;
on m/z 149 composto principalmente dos anis A e B via mecanismo complexo;
estereoqumica dos anis A/B tem efeito caracterstico neste processo: ismero 5--(cis)
a razo [m/z 149]/[m/z 151] menor do que no ismero 5-.

Hidrocarbonetos cclicos insaturados


on significante m/z 54 vem de reao tipo Retro Diels-Alder, reao gera um fragmento
dieno e monoeno e pode ser bem especfica da ligao dupla, mesmo em molculas como
os terpenos e alcalides.

Hidrocarbonetos aromticos
pico do on molecular normalmente bem intenso;
processos de clivagem do anel aromtico necessita de alta energia;
posio no anel de substituintes alquilas tem pouca influncia no espectro;
sries de ons homlogos dos fenilalcanos ocorrem a massas correspondendo a
C6H5(CH2)n+ (m/z 77, 91, 105, 119,...) ;
on mais caracterstico desta srie corresponde a ruptura da ligao benzlica com perda
do maior grupo alquila;
on benzlico estabilizado por ressonncia.

lcoois alifticos saturados


on molecular diminui;
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+.
dehidrogenao e dehidratao cataltica ou trmica podem gerar ons como (M - 2) ;
+. +.
(M - 18) e (M - 20) , embora tambm possam advir da fragmentao por impacto de
eltrons.

lcoois alifticos cclicos


clivagem a favorvel na ligao do anel mais substituda;
+.
reaes posteriores pela eliminao de CnH2n leva aos ons caractersticos OE a m/z 44,
58, 72, 86,...
+.
perda de gua um caminho principal de decomposio do M .

Fenis
+. +
o pico (M - CO) , usualmente acompanhado pelo (M - CHO) , especialmente til no
reconhecimento dessa funcionalidade;
+.
ons (M - 18 ) - efeito orto
+
pico (M - 1) - advm da perda de hidrognio benzlico

Cetonas e aldedos alifticos


on molecular das cetonas usualmente observado; de aldedos alifticos de cadeia
longa normalmente pequeno, mas pode ser identificado pelos fragmentos caractersticos
+. +.
(M - H2O) e (M - C2H4) .
+
pico CHO (m/z 29) proeminente para aldedos pequenos;
+ +
clivagem a gerando (M - H) aprecivel somente quando RCO for bem estabilizado;
clivagem mais proeminente em cetonas alifticas;
on aclio mais abundante usualmente formado pela perda do maior grupo alquila,
enquanto o on alquila mais abundante o mais estvel
apresentam as sries caractersticas a m/z 15, 29, 43, 57, 71, 85, 99, 113, 127, devido a
+
CnH2n+1CO e CnH2n+1 .
rearranjo de hidrognio seguido de clivagem gera o on enol (m/z 72, 100, 58) e seu
on alqueno complementar.

23
steres
on molecular observado;
sofrem clivagem ;
sofrem clivagem com rearranjo de H;
ramificaes leva a mudanas caractersticas na srie do on CH3OCO(CH2)n+ , m/z 59,
(73), 87, 101, ... com maior abundncia nos carbonos tercirios.

MECANISMOS DE FRAGMENTAO

Na espectrometria de massas convencional as reaes so unimoleculares.

Fatores que influenciam a abundncia de um on:


estabilidade do on produto (estabilizao do on por compartilhamento de eltrons; por
ressonncia);
ons radicais distnicos: ismeros com stios de carga e radical separados :

CH3NH2+. e . CH2N+H3 podem ser mais estveis que seus correspondentes clssicos.

Regra de Stevenson
+.
ruptura de uma ligao simples em um on OE pode levar a dois grupos de produtos: on e
radical . on fragmento usualmente o mais estvel, o mais abundante;
perda do maior grupo alquila
estabilidade do produto neutro: H2 , CH4, H2O, C2H4, CO, NO, CH3OH, H2S, HCl,
CH2=C=O, CO2 ;
efeitos estricos/entropia.

Alcanos lineares
espectro resultante tem vrios picos com abundncia variando regularmente
aumento regular na abundncia com o decrscimo de tamanho dos ons alquila
+ +
estruturas de tamanhos menores, como C3H7 e C4H9 , so estruturas de ons carbnio
ramificados mais estveis
distribuio dos ons maximizada na regio C3 e C4 dos alcanos maiores;

24
alcanos substitudos com grupos eletronegativos que no diminuem significantemente a
energia de ionizao (ex. Cl, Br, NO2, CN) apresentam efeitos semelhantes nas abundncias
dos ons CnH2n+1+ .
sries de ons de massa baixa
vrios grupos de picos separados por 14 u (srie separadas por grupos CH2); outros tem
separaes menores, 12 ou 13u (srie de ons separadas por CH e C);
geram informaes sobre as subestruturas (heterotomos, anis, ligaes duplas);
indicador da presena de uma cadeia alquila.

INICIALIZAO DE REAO EM STIOS RADICALARES OU DE CARGA

predizer o caminho de decomposio preferida assume-se que as reaes so iniciadas em


stios favorveis para os eltrons desemparelhados e para a carga positiva no on em
decomposio.
a dissociao resultante da inicializao por stios radicalares e de carga so, respectivamente,
clivagens homolticas e heterolticas.
facilidade de ionizao: n > > .
o smbolo +. no final da molcula significa um on com nmero mpar de eltrons sem definir o
stio do radical. Uso de . ou + na molcula , CH3+.CH3 , implica na localizao do radical ou
carga.

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27
MEDIDA DE MASSA EXATA (ALTA RESOLUO)
medida da massa de um on com acurcia suficiente gera uma identificao inequvoca de sua
composio elementar (e isotpica).
tcnica conhecida como espectrometria de massas de alta resoluo;
instrumentos de duplo foco ou FT/ICR so usualmente utilizados;
elementos podem ser identificados desse modo pois os pesos atmicos monoisotpicos no so
nmeros inteiros exatos;
12 1 14 16
sendo C = 12,00000000, ento H = 1,007825035, N= 14,00307400, O= 15,99491463.
cada istopo tem um nico e caracterstico defeito de massa, e a massa do on, o qual mostra
o defeito de massa total, identifica sua composio isotpica e elementar.
exemplo: on com massa 43,0184 pode ser C2H3O+ e no pode ser C3H7+ (m = 43,0547) ou
C2H5N+ (m = 43,0421).

Mecanismos de Fragmentaes de Classes de Compostos Orgnicos

28
Figura: Espectro de massas do 4-fenilcicloexeno e mecanismo de fragmentao do tipo retro-
Diels-Alder gerando seus principais fragmentos.

29
Figura: Espectro de massas do cicloexeno e do 3-metil-3-hexanol e mecanismos de fragmentao
de seus principais fragmentos.

30
Figura: Espectro de massas da 2-dodecanona e mecanismos de fragmentao, via Mecanismo de
McLafferty, de seus principais fragmentos.

31
Figura: Espectro de massas da 5-fenil-2-pentanona e mecanismos de fragmentao, via
Mecanismo de McLafferty, de seus principais fragmentos.

32
Figura: Espectro de massas do 3-metil-3-heptanol e mecanismos de fragmentao de seus
principais fragmentos.

33
Figura: Mecanismos de fragmentao tipo Mecanismo de McLafferty e mecanismo de perda de
molcula de gua de lcoois lineares.

34
Figura: Espectro de massas da 2-metil-cicloexanol e mecanismos de fragmentao de seus
principais fragmentos.

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IONIZAES BRANDAS

IONIZAO QUMICA
Baseia-se na transferncia de espcies carregadas entre um on reagente e a molcula
alvo, produzindo um on que pode ser analisado.Espcies formadas no modo positivo so

normalmente adutos entre a molcula alvo e ons pequenos como H+, H3O+ e NH4+ e, no modo
negativo, resulta da perda de prtons, captura de eltrons, dentre outros.
espectros normalmente simples, com pouca ou nenhuma fragmentao;
tcnica bem sensvel, pois a corrente de ons concentrada em poucas espcies.
realizada a altas presses - relativa a utilizada no analisador de massas - e extremamente
eficiente em se produzir ons.
Gs Afinidade por Prton, kcal/mol
Helio 42
Metano 127
Vapor de gua 167
Isobutano 195
Amnia 207

se molcula for ionizada com pouco acrscimo de energia, fragmentao ser reduzida e o
on molecular ser mais abundante.
impacto de eltrons de baixa energia aumenta o on molecular mas h perda de sensibilidade.
IQ - basicamente a molcula est rodeada pelos ons reagentes e a carga passa para a
molcula por uma interao qumica sem muita transferncia de energia.
prtons ou mesmo entidades grandes carregadas podem ser adicionadas a molcula sem
muita transferncia de energia.

gs reagente introduzido na fonte inica (~0,5 - 1,0 Torr) a uma concentrao de 104 :1 para
a amostra e ionizada pelo bombardeamento de eltrons (~500V).
maioria dos ons, o gs reagente ionizado por IE.

o on R+. inicialmente formado pode reagir com outra molcula de R para formar espcies
inicas reativas que depois ataca a molcula M da amostra.

R + e- R+. + 2e-
42
R+. + R RH+ + (R-H). ou RH. + (R-H)+

RH+ + M R + MH+ (protonao)

(R-H)++ M (R-2H) + MH+ (protonao)

(R-H)++ M R + (M-H)+ (abstrao de hidreto)

R+. + M R + M+. (troca de carga)

mais comum: protonao que favorecida para molculas com afinidade por prton maior
do que o reagente.
abstrao de hidreto: comum para molculas com baixos valores da afinidade por prton
(alcanos).
troca de carga: favorecido para reagentes de alta energia de ionizao como hlio.
energia interna da molcula ionizada resultante depende do reagente escolhido, temperatura
da fonte e presso.
Exemplo: acetado de lavanduila (PA = ~8.7 eV); CH4 (PA= 5.7eV); (i-C4H8 = 8.5eV);
(NH3 = 9.0eV)

com metano: posterior fragmentao quase completa para a espcie CH5+ altamente
exotrmica.
com amnia: pouca reao (fragmentao unimolecular)

metano pelo bombardeamento por eltrons gera: CH4+, CH3+ , CH2+, CH+, C+ , H2+ ,

H+ , algumas mais abundantes do que outras.

ons mais proeminentes, 95% do total: CH5+ , C2H5 + , C3H5 + .


CH4+ + CH4 C2H5+ + CH3
C2H5+ + CH4 C3H5+ + H2
So extremamente reativos, podem atacar a molcula, passando a carga para elas.

pode-se gerar (M + 1)+ , (M + 29)+, (M + 41)+, normalmente apresentam maior estabilidade


do que o on molecular por IE.
Fonte inica: aberturas so pequenas limitando o escapamento do gs para o vcuo. Alta
presso na fonte tambm limita a passagem dos eltrons. usual aumentar a voltagem de
energia dos eltrons.

43
Metano: baixo valor de afinidade por prton e mais provvel de se observar o on
molecular de um composto desconhecido do que utilizando-se isobutano ou amnia. a
primeira escolha para uma ionizao qumica de aspecto geral, especialmente para amostras
desconhecidas.
desvantagem : alto grau de fragmentaes.
Amnia: alto valor de afinidade por prton. Previne fragmentaes. Gs de difcil
manipulao, pois corrosivo.
Isobutano: tambm tem aplicao geral. Tem maior afinidade por prton do que metano,
menor grau de fragmentao (se ocorrer a ionizao).
Ionizao Seletiva: tcnica poderosa para compostos desconhecidos. Com a escolha
adequada do gs reagente possvel ionizar seletivamente um composto em uma mistura
complexa. Leva a um aumento significativo no limite de deteco.
pode contornar problemas associados com a deteco e identificao de estereoismeros.
Diferena em ismeros responsvel por pouca diferena de energia.
IQ: sensibilidade e especificidade podem ser aumentadas para muitos compostos. Massa
molecular pode ser identificado. Menor fragmentao, gerando espectros mais simples e
mais fceis de serem entendidos. Ismeros qumicos e estereoismeros podem ser
distinguidos. Compostos podem ser seletivamente ionizados em misturas complexas.
Informao obtida complementar a IE.
em adio aos gases, vapores como metanol podem promover a IQ.
CL/EM: a fase lquida entra na fonte de ons, vaporizada e se torna o reagente da IQ.

Alcanos: abundante [M - H]+


Alcenos: duas sries de ons

[CnH2n+1]+ , consistindo do on [M+ H]+ e dos ons derivados deles;

[CnH2n]+ , consistindo do on [M -H ]+ e fragmentos de menor massa derivados dele.

observa-se tambm o M+. .

44
Figura: Espectro de massas por impacto de eltrons e por ionizao qumica.

45
Figura: Espectros de massas do acetato de lavanduila por ionizao qumica utilizando metano
isobutano e amnia, respectivamente, como gs reagente.

46
Figura: Espectros de massas da 1-deidrotestosterona por ionizao qumica utilizando metano
como gs reagente e por impacto de eltrons do TriMetilSilil-derivado.

47
Figura: Espectro de massas da Reserpina por impacto de eltrons e ionizao qumica utilizando
metano como gs reagente.

ELECTROSPRAY
nova e poderosa tcnica de ionizao, produzindo gotas altamente carregadas a partir de
solues.
mtodo de se gerar gotas altamente carregadas das quais ons so ejetados pelo processo de
evaporao.
Evaporao do on: um processo no qual ons so emitidos de gotas carregadas diretamente
para a fase gasosa.
pulveriza-se um lquido contendo ons pr-formados na forma de gotas carregadas e emisso
subsequente dos ons das gotas para a fase gasosa.
Electrospray e Ionspray: um campo eltrico gerado na extremidade do pulverizador
aplicando-se uma alta voltagem diretamente no pulverizador (4kV), com o contra-eletrodo
(1kV) localizado a milmetros. ons de uma determinada polaridade so preferencialmente
48
atrados para as gotas pelo campo eltrico enquanto so separadas do lquido. A separao
incompleta e cada gota contm ons de ambos os sinais. Somente o excesso de ons de um
sinal se encontra disponvel para evaporao e somente uma frao deles que realmente
evaporam.
gera somente gotas de uma polaridade determinada pela polaridade do campo eltrico.
operado a presso atmosfrica e temperatura ambiente.
limitada a baixo fluxo: 1-10 ml /min.

gera ons altamente carregados de compostos que possuam vrios stios de carga (peptdeos,
oligonucleotdeos). Situao vantajosa para a observao de espcies de alto peso molecular
onde cargas mltiplas produzem ons com valores de razo m/z na faixa de massas de um
instrumento tipo quadrupolo, permitindo a determinao rotineira de pesos moleculares de
compostos na faixa de kilodalton.
uma protena de peso molecular de 15.000 adicionada de 15 prtons, por exemplo, tem uma
razo massa/carga de 1000, sendo facilmente detectada por um quadrupolo.
Eleva a capacidade de se detectar e medir acuradamente o peso molecular de compostos que se
encontram bem alm da faixa de massa normal de um quadrupolo.
gotas altamente carregadas so dispersas em aerosol de um capilar em um forte campo eltrico
a presso atmosfrica. Gs quente e/ou seco aplicado nas gotas para auxiliar na evaporao
do solvente. ons multicarregados expelidos das gotas durante o processo de evaporao so
ento direcionados para um orifcio de entrada para a regio de vcuo do espectrmetro.

49
um espectro de massas por ESI de uma protena caracterizado por uma srie de picos de ons
carregando nmeros diferentes de cargas (diferentes valores de massa/carga).
Software disponvel para converter a multiplicidade dos picos dos ons oriundo de cada
espcie em um nico pico correspondendo ao peso molecular da molcula neutra.
solventes tpicos so gua/Metanol 50/50 ou gua/ Acetonitrila contendo 1-5% de cido
actico ou frmico ;
concentrao de protena de 1-10pmol/ml.
ESI tem demonstrado futuro promissor na verificao de estruturas simples caracterizao de
substncias desconhecidas. Pode-se obter informaes em detalhes estruturais de ordens
maiores, isto , mudanas na conformao induzida por solventes, na desnaturao refletida no
grau de protonao, mudana hidrognio/deutrio e estabilidade CID.
Processo de emisso: mecanismo pelo qual ons podem ser emitidos de um lquido para a fase
gasosa.
proposto inicialmente por Irebane e colaboradores em 1976. Quando uma gota carregada
evapora no ar, um ponto crtico pode ser atingido no qual cineticamente e energeticamente
possvel para os ons na superfcie do lquido evapora para o ar.
Gerao da gota: gotas podem ser formadas de vrios modos, todos envolvendo o rompimento
da superfcie do volume de lquido com uma fonte de energia suficiente para sobrepor a
energia da superfcie. Em um nebulizador pneumtico, uma velocidade alta do jato de ar forma
gotas a partir do fluxo de lquido. Aplicao de um campo eltrico na extremidade do
nebulizador auxilia na disperso das gotas e gera uma carga lquida em cada gota.
ESI, um alto campo eltrico na superfcie do lquido cria um stress eltrico, que gera gotas
sem a necessidade de qualquer jato de gs.

50
Figura: Esquema de uma interface fonte inica presso atmosfrica-analisador de massas,
utilizando uma cortina de gs, para minimizar a formao de adutos.

Figura: Espectro de massas da anidrase carbnica bovina, massa molecular de aproximadamente


29000 Daltons, a uma concentrao de 12,5 pmol. Fonte inica tipo eletronspray.

51
Figura: Espectros de massas utilizando Eletronspray como fonte inica, da apomioglobina de
cavalo (superior; com o espectro de massas deconvolucionado) e do dmero da albumina bovina
(inferior).

IONSPRAY
Fonte de ons electronspray pneumaticamente assistido.
Caractersticas
alta sensibilidade para compostos biolgicos;
ons moleculares sem degradao trmica;
baixo consumo de amostra;
compatvel com uma variedade de mtodos de separao (CL, CZE);
52
determinao de peso molecular na faixa de massa do kilodalton.
Descrio
nova tcnica idealmente til para a introduo de compostos polares e termolbeis em um
espectrmetro de massas;
uma fonte de ons a presso atmosfrica, na qual ons pr-formados em soluo so emitidos
para a fase gasosa sem a aplicao de qualquer aquecimento.
ons quase-moleculares podem ser gerados de compostos lbeis e de alto peso moleculares
sem degradao trmica;
o lquido contido na amostra bombeado atravs de um pulverizador, o qual mantido a uma
alta voltagem de modo que uma neblina de gotas altamente carregadas so formadas;
com a evaporao das gotas, ons so ejetados para a fase gasosa por um processo de baixa
energia, o qual no induz fragmentao;
compostos com um ou mais stios de carga so observados com ons mono ou multicarregados
como existiam na soluo original
pode ser conectado a sistemas de CL, gerando um sistema CL/EM e permite que
microvolumes de amostras sejam introduzidas a baixas velocidades de fluxo.
a baixa velocidade de fluxo e alta sensibilidade o torna til para novos mtodos de separao
eletrofortica como CZE, o qual vem se tornando altamente importante como tcnica rotineira
de separao bioqumica. Anlises completas podem ser realizadas com picomole, ou menores
quantidades de material, o que til quando somente se dispe de pequena quantidade de
amostra.
Gerao de ons (mais comum): bombardeamento de molculas gasosas com um feixe de
eltrons.
Impacto de eltrons (70 eV) mistura de ons positivos e negativos e espcies neutras.
ons positivos so direcionados para o analisador pela aplicao de voltagem positiva no
repeller. Focalizao pela voltagem aplicada nas lentes.
ons negativos e eltrons atrados para um catodo positivo.
Molculas e fragmentos neutros no ionizados bombeados para fora do sistema.

53
O processo de emisso
+
+
+ -+
-+-+-+ ++- -++- +
++--++ -+
+- +
+ - + - + -+ -+ +-+
+-+ +- +
+-+
+
Gota original Com a evaporao A um campo Resduo
contm do solvente, o campo eltrico involtil
ons de ambas as eltrico aumenta crtico, ons so permanece
polaridades sendo e os ons se movem emitidos da gota como uma
uma predominante para a superfcie partcula seca
Figura: Esquema do processo de emisso que ocorre em uma fonte de ons tipo eletronspray.

Figura: Esquema representatio de uma interface CLAE/EM a presso atmosfrica do tipo


Ionzpray (Eletronspray).

TERMOSPRAY
outro processo que cria gotas carregadas.
Operado a baixa presso e temperatura elevada, a qual necessria para o processo de
pulverizao e gerao de carga, entretanto, leva a decomposio trmica de algumas espcies
sensveis.
Gera ons de ambas as polaridades.
No h aplicao de um campo eltrico externo, devido principalmente a presso reduzida.

54
O lquido introduzido na fonte atravs de um tudo capilar, cuja extremidade aquecida.
Controlando a temperatura consegue-se ejetar pequenas gotas da extremidade do nebulizador.

Figura: Esquema de uma espectrmetro de massas com fonte inica do tipo Termospray.

Termospray - Electrospray Ionspray: como fontes de um espectrmetro de massas capaz de


gerar ons pseudo-moleculares de compostos inicos e polares, as trs tcnicas diferem em
suas caractersticas. As diferenas se encontram principalmente em como as gotas so criadas
e carregadas e como os ons so amostrados, do que como os ons so realmente gerados.

Electrospray e Ionspray: operados a presso atmosfrica e temperatura ambiente. Geram


somente gotas de uma polaridade determinada pela polaridade do campo eltrico. Podem gerar
ons altamente carregados de compostos que possuem vrios stios de carga.

MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption Ionization


baseada na dessoro por laser de ons orgnicos, uma tcnica inicialmente concebida no
incio dos anos 70.
tcnica de dessoro por laser assistida por matriz introduzida por Hillenkamp e Karas
(1988)
limitao de massa da dessoro por laser pode ser contornada colocando as amostras em
uma matriz slida ou lquida que contenha substncia que absorva na regio ultravioleta.

55
molculas so dessorvidas e ionizadas com um pulso curto de ftons. ons so gerados em
um ponto, em termos de espao e tempo, o que torna MALDI altamente compatvel com um
espectrmetro de massa com tempo de vo.
precedendo a anlise, a amostra misturada em um excesso molar de aproximadamente 1000
vezes com uma matriz apropriada de baixo peso molecular. Pequena quantidade secada na
sonda.
importante que o comprimento de onda do laser coincida com o mximo de absoro do
composto da matriz. Este comprimento de onda no absorvido pela molcula de interesse.
matriz serve para absorver a energia do laser e prevenir a decomposio das espcies de
interesse; isolar as biomolculas uma das outras para evitar agregao que deve interferir na
anlise; aumentar a produo de ons.
Matrizes: cido nicotnico, cido sinapnico (cido trans-3,5-dimetoxi-4-hidroxi-cinmico),
cido ferrlico (cido trans-3-metoxi-4-hidroxicinmico), cido cinmico, cido
dihidroxibenzico, dentre outros que possuem absoro intensa a 320-350nm.
Laser: Nd-YAG (nedio-trio-alumnio-granada); nitrognio; IR.
a absoro da luz do laser leva a dessoro dos ons relacionados a matriz e a molcula
intacta.
ons produzidos so predominantemente de cargas z =+1 e z =+2
Aplicaes: a espectrometria de massas com ionizao/dessoro a laser assistida por uma
matriz tem emergido como um mtodo de determinao do peso molecular de peptdeos e
protenas.
oligonucleotdeos, oligossacardeos, glicoconjugados, ligninas e polmeros sintticos.
caracterstica fascinante: faixa de massa prtica extensa.
til na anlise de protenas simples como as conjugadas. Protenas consistindo de
subunidades ligadas no covalentemente podem ser desorvidas como se fossem uma s
unidade:
Exemplo: glicose isomerase: 4 subunidades idnticas.
o espectro de massas utilizando cido nicotnico como matriz dominado pelo pico do
tetrmero. Utilizando cido sinapnico, somente o on molecular da subunidade monomrica
observado, possivelmente porque a soluo dessa matriz denatura a protena. Isto indica
que a dessoro por laser pode refletir a conformao da molcula antes da dessoro.

56
protenas com pesos moleculares superior a 200.000Da tem sido analisadas, assim como um
grande nmero de glicoprotenas.
Gramicidina S sintetase: 512KDa
Anticorpo: contm pouco ou nenhum pico que possa ser atribudo a fragmentos formados
durante ou antes da dessoro.
tolera impurezas das amostras comumente encontradas em amostras de origem biolgicas,
tais como sais e tampes.
no fcil de ser hifenado.
o uso de MALDI-TOF-MS na caracterizao de produtos naturais foi demonstrado pelo
estudo de taxanos.

a observao dos ons [M + H]+ , [M + Na]+ e [M + K]+ confirmam o peso molecular.


Fragmentos correspondendo a perda de substituintes tambm observado, gerando
informaes estruturais.
melhores matrizes em termos de abundncia e reprodutibilidade dos espectros foram 4-
nitroanilina e 4-nitrofenol.
menos de 5 min foram gastos na aquisio e calibrao de um espectro de massas
foram examinados para dessoro a 337 nm.
espectrmetro de massas com tempo de vo linear.
fonte de laser a 337 nm, laser de nitrognio .
ons acelerados a 10KV e detectados utilizando um detector padro de dual microchannel
plate.

M a tr iz o a s p e c to c h a v e d o M A L D I - T O F - M S
L aser

o n s
M a tr i z
c o n te n d o D e te c to r
a a m o s tr a

A lta
V o lta g e m

57
58
Figura: Espectro de massas da albumina srica bovina obtida por analisador de massas do tipo
tempo de vo e laser para desorver e ionizar a molcula. Massa molecular de 66650 Daltons.

PDMS - Plasma Dessorption Mass Spectrometry


dessoro por plasma foi desenvolvida por Macfarlane colaboradores em 1974;
so empregados fragmentos decorrentes da fisso do elemento Califrnio (252 Cf
142Ba18+ + 106Tc 22+ ) para ionizar compostos termolbeis.

envolve exposio de uma amostra no voltil ao impacto com fragmentos de alta energia.
ionizao obtida pelo impacto de ons primrios com energia da ordem de 100MeV
anlise de massas efetuada com tempo de vo. 105 - 107 espectros so acumulados para se
obter ons estatisticamente suficientes.
no possvel utilizar EM-EM utilizando-se tubos de vo retos.
acoplamento com tcnicas de separao no possvel.
Vantagens: tolerncia a impurezas, sensibilidade e simplicidade. Estas esto relacionadas ao
uso do suporte de nitrocelulose.
tem sido til na obteno de pesos moleculares.
so gerados fragmentos e podem gerar informaes parciais sobre o seqenciamento de
peptdeos e pequenas protenas.
a tcnica pode determinar massas at ~ 35 Kda.

59
LIQUID SIMS
espectrometria de massas de ons secundrios.
a ionizao por Liquid SIMS (LSIMS) obtida quando ons primrios de Csio,
acelerados a 30-35 kV colidem com uma amostra posicionada sobre uma superfcie e so
produzidos ons (ons secundrios).
ions secundrios so produzidos como resultado do bombardeio de uma superfcie (SIMS) ou
de um filme de lquido (LSIMS) por um feixe de ons acelerados.
tem sido utilizado para a anlise da superfcie de materiais inorgnicos (como SIMS) e, mais
recentemente, para substncias orgnicas pouco volteis (como LSIMS)
os resultados obtidos por FAB e LSIMS so comparveis.
sugere-se que LSIMS seja mais sensvel devido possibilidade de focalizao para o feixe
de ons de Csio.

+ + + V ac = 8 kV

C s+
C s+
C s+ V ac + 35 kV

60
Tcnicas Hifenadas
acoplamento em linha (on-line) de mtodos de grande potencial na qumica analtica.
seletividade da amostra pode ser ajustada , levando a uma maior velocidade de anlise ou
uma melhora nos limites de deteco.
tcnicas hifenadas acoplamento de um mtodo de separao como a cromatografia
com fase gasosa (CG), cromatografia com fluido supercrtico (SFC), cromatografia
lquida de alta eficincia (CLAE) ou mtodos por eletromigrao (eletroforese em zona
capilar - CZE) com a espectrometria de massas.
consiste em diferentes blocos preparao da amostra, separao, interface, deteco
e aquisio/manipulao dos dados.
tcnica de separao, interface e a tcnica de ionizao esto se tornando indistinguveis
como unidades separadas nos novos sistemas

CL/EM
CLAE tem se tornado uma das tcnicas mais utilizadas na anlise de compostos
orgnicos.
tem vantagens sobre a cromatografia com fase gasosa pois os compostos no precisam
ser vaporizados para a anlise, necessita-se menos pr-tratamento da amostra e tem maior
grau de seletividade .
limitao da CL a ausncia de um detector universal como o detector por ionizao
com chama na CG.
EM gera especificidade, seletividade e sensibilidade e informao estrutural na anlise de
compostos orgnicos.
a faixa de tcnicas de ionizao e a faixa de massa analisvel, permite a anlise de um
grande nmero de compostos orgnicos.
CL/EM atualmente utilizada routineiramente. Permite anlise quali e quantitativa.

Interfaceamento CL/EM
MBI - acoplamento via correia mvel
PBI - feixe de partcula (particle beam)
HNI - nebulizador aquecido
CF-FAB - FAB com fluxo contnuo

61
TSP - acoplamento com nebulizador aquecido
ESI - acoplamento e ionizao por nebulizao em um campo eltrico.

interface de primeira gerao como a de correia mvel se procura contornar a aparente


incompatibilidade entre a introduo de um lquido em um alto vcuo pela remoo do
lquido.
interface de segunda gerao, mtodos de ionizao brandas foram acoplados com a
introduo dos lquidos, por exemplo: CF-FAB.
sistema CL/EM de terceira gerao, o interfaceamento e a ionizao emergem como uma
tcnica combinada. O mtodo de interfaceamento simultaneamente uma tcnica de
ionizao, como no caso do termospray e electrospray.

E s tr a t g ia d e In te r fa c e a m e n to C L /E M

E flu e n te d a C o lu n a

R e m o o d o S o lv e n te N e b u liz a o

Io n iz a o D ire ta D e sso lu o d a g o ta
S o lu to V a p o riz a d o
Io n iz a o n a fa se g a s o sa
Io n iz a o C F -F A B E v a p o ra o d o o n

M B I, P B I T S P , E S I, H N I

62
Interrelaes entre a polaridade do soluto,
a interface e a
velocidade de fluxo permitida
Apolar Polar Inico
MBI Faixa veloc. fluxo
PBI
TSP , HNI ml/min
CF-FAB l/min

ESI
ESI

Fase Normal Fase Reversa


(Fase Mvel (Fase Mvel Ion-exchange
ex. Hex./solv. gua/Metanol Ion-par
Polar 9:1) (8:2)

Interface CL/EM via Nebulizador Aquecido (interface ao API)


Caractersticas
aceita fluxo total de uma coluna de grande dimetro sem a nessecidade de diviso
fase mvel aquosa at 100% de gua
velocidade de fluxo maior 1,0 ml/min
possibilidade de uso de tampes volteis e no-volteis
vaporizao por pulverizao de involteis e compostos lbeis com o mnimo de degradao
trmica
espectro simples ideal para EM/EM
pode ser utilizado para introduo rpida de amostra sem a CL.

As necessidades de um sistema CL/EM so:


confiana
compatvel com tecnologia padro de colunas para CL
aceitao de fase mvel aquosa e tampes comumente utilizados pelos utilitrios dos
cromatgrafos
63
sensibilidade
especificidade no volteis e compostos
Cromatografia lquida est rapidamente se tornando o mtodo de escolha na separao de
compostos que no podem ser analisados por cromatografia gasosa devido a sua baixa
volatilidade.
o eluente de uma coluna cromatogrfica de grande dimetro introduzido diretamente na fonte
API onde o lquido pulverizado em um vaporizador aquecido brandamente.
rpida retirada do solvente e vaporizao das gotas minimiza a decomposio trmica e
preserva a identidade molecular para a ionizao por transferncia de prton na fonte APCI.
introduo de toda a amostra da coluna resulta no limite de deteo na faixa do picograma.
tampes so tolerados pela fonte a presso atmosfrica sem problemas de contaminao
significante e a rpida vaporizao do eluente pulverizado permite o uso de 100% de gua.

Descrio da Interface
consiste em um pulverizador acoplado a uma cmara aquecida de dessoluo/vaporizao.
o eluente flui atravs de um tubo de ao inoxidvel de grande dimetro diretamente a um
nebulizador onde convertido em uma neblina fina por um jato de ar ou nitrognio a alta
velocidade.
gotas so carreadas por uma capa de gs.
o gs aquecido (120oC) e a mistura da amostra fluem do tubo para a regio de reao da fonte
de API onde a amostra quimicamente ionizada pela transferncia de carga ou de prton pelos
ons reagentes.

a fase mvel vaporizada atua como gs reagente, produzindo ons [M+H]+ no modo positivo e

[M-H]+ no modo negativo.


a cortina de gs previne que qualquer solvente, amostra ou tampo entre a regio do analisador
e mantm o sistema de vcuo, lentes e os polos do quadrupolo sem contaminao.
molculas agrupadas (clustered) so retiradas dos ons ao passarem pela cortina de gs e
pelo orifcio de amostragem atmosfera-vcuo.
a grande quantidade de solvente, amostra e tampo que so constantemente pulverizados para
a fonte so carreados pelo fluxo de gs para fora da regio de reao de 760 Torr. Uma bomba
de ar utilizada para bombear o gs para fora da fonte.

64
Vaporizao da amostra
a incompatibilidade entre CL e EM tem sido a dificuldade de se converter molculas
relativamente no volteis solvatadas em um lquido em uma molcula gasosa sem induzir
decomposio excessiva.
processo nesta interface um de se dispersar o fluxo de lquido na forma de pequenas gotas
suspensas em um gs carreador.
a uma temperatura suficientemente alta, as gotas so vaporizadas a uma velocidade que
permite que molculas orgnicas intactas sejam dessorvidas das gotas ou partculas com o
mnimo de decomposio trmica.
o processo de evaporao por pulverizao rpida atua para preservar a identidade molecular
de compostos involteis e relativamente lbeis, para formar um vapor molecular no gs
carreador til para uma ionizao qumica branda.

Ionizao da amostra
as molculas da amostra vaporizada so carreadas no fluxo de gs direto para uma regio de
reao on-molcula a presso atmosfrica
a ionizao primria cria ons reagentes do vapor do solvente o qual flui atravs da regio.
a probabilidade de fragmentaes durante a ionizao pequena e resulta em ons moleculares
e quase-moleculares .Gera informaes sobre o peso molecular e o domnio dos ons quase-
moleculares ideal para experimentos EM/EM onde se obtm informaes estruturais.

65
66
100
(A) m/z 195

0 tR
21.00 21.75 22.50 23.25 24.00 24.75 25.50

100
195 197
(B)
%
199

0 m/z
100 150 200 250

Figura: CLAE/EM utilizando ionizao qumica a presso atmosfrica no modo negativo.


Fragmentograma do on m/z 195 e espectro de massas do 2,4,6-triclorofenol de uma amostra de
gua de rio.

Figura: CLAE/EM-MSI utilizando ionizao qumica a presso atmosfrica no modo positivo.


Fragmentogramas dos ons m/z 252, m/z 238, m/z 216 e m/z 202, caractersticos dos herbicidas
alachlor, metolachlor, atrazina e simazina, e cromatograma de ons totais (CIT; TIC) de uma
amostra de gua de rio.
67
CG/EM

vem se tornando rotineiro desde a dcada de sessenta.


o acoplamento de um mtodo de separao como a cromatografia com fase gasosa com a
espectrometria de massas aumenta grandemente a especificidade da anlise e a CG/EM
atualmente uma ferramenta rotineira na anlise de misturas orgnicas complexas.
Aplicaes: estudos estruturais, para compostos desconhecidos, anlise de misturas (obter
informaes de muitos componentes ou identificar e quantificar alguns componentes).
Principais limitaes: vaporizao trmica da amostra seguida pela ionizao na fase gasosa;
somente molculas apolares ou de mdia polaridade, termoestveis e volatilizveis so
analisadas. Molculas polares somente so analisadas via derivatizaes.
Exemplo: acares, lcoois, cidos, molculas polifuncionalizadas.
maioria dos compostos de interesse biolgico no se vaporizam ao serem aquecidos.
Derivatizaes se faziam necessrias.
problemas com as colunas empacotadas: baixas eficincias das colunas e grande tempos de
reteno.
Colunas capilares permitem a separao de misturas com alta resoluo. Desta forma,
possvel analisar misturas cada vez mais complexas em espaos de tempo cada vez menores.
As quantidades de amostra que podem ser injetadas nas colunas capilares so muito pequenas,
acarretando a necessidade de injetores especiais e detectores mais rpidos e sensveis.
o espectrmetro de massas pode ser acoplado diretamente ao cromatgrafo a gs, de modo que
os componentes que eluem vo diretamente para a fonte de ons, que operam sob vcuo. Desta
forma, uma parte da coluna trabalha em presses baixas. Portanto, o controle do gs de arraste
mais crtico, havendo sempre alguma perda da eficincia da coluna.
Gases: hlio (melhor e mais caro) e Hidrognio (explosivo e mais barato). Com estes gases as
colunas capilares trabalham com maior eficincia de separao.
SCAN: velocidade de varredura dos espectros.
os tempos de varredura so suficientemente rpidos para permitir a obteno de vrios
espectros de massas completos durante a eluio de um nico pico (vrios espectros de massas
por segundo) na unidade de cromatografia com fase gasosa.
velocidade de varredura afeta a acurcia da medio on-molcula.

68
ideal que sejam obtidos de 8 a 15 medidas de cada pico. Caso sejam efetuadas um nmero
menor de medidas, pode-se perder informaes do cromatograma, comprometendo a sua
resoluo.
J um nmero excessivo de medidas pode provocar o acmulo desnecessrio de informaes,
saturando a capacidade do disco e tornando demoradas as operaes de tratamento dos dados
adquiridos.
Cromatogramas de massas ou fragmentogramas: so o registro da variao da intensidade
correspondente aos ons de uma determinada relao m/z.
SIM : Monitoramento Seletivo de ons - MSI.
descreve a operao na qual as intensidades de vrios ons especficos so registrados ao invez
do espectro de massas inteiro.
alta especificidade e sensibilidade de deteco podem ser obtidos para compostos escolhidos
previamente.

69
Figura: Frao de hidrocarbonetos aromticos do material particulado da atmosfera de Campos
dos Goytacazes, amostrado em 21/11/97 no stio Corpo de Bombeiros, centro da cidade.
(A) Cromatograma de ons totais (CIT);
(B) Fragmentograma m/z 152, pico base do acenaftileno.

70
(A)

16.00 20.00 24.00 28.00 32.00

(B)

16.00 20.00 24.00 28.00 32.00

Figura: Anlise do extrato orgnico total de uma amostra de sedimento de um afloramento de


Jundia, Bacia do Parnaba (Maranho):
(C) Cromatograma de ons totais (CIT);
(D) Fragmentograma m/z 219, pico base do reteno.

71
SUMRIO CG/EM

VARREDURA LINEAR

PERFIL TOTAL DA AMOSTRA


ESPECTRO DE MASSAS
DETECO DE COMPONENTES
TRAOS

MONITORAMENTO SELETIVO DE
ONS (MSI)

DETECO SELETIVA
DETECO DE COMPONENTES
TRAOS
PERFIS DE DISTRIBUIO DE
FAMLIAS CONHECIDAS
NO EXISTE ESPECTRO DE MASSAS

72
CROMATOGRAFIA GASOSA-
ESPECTROMETRIA DE MASSAS

ANLISE DE MISTURAS COMPLEXAS

ENVOLVENDO

SEPARAO CROMATOGRFICA DE
MISTURAS COMPLEXAS
IONIZAO DE COMPOSTOS
SEPARADOS
SEPARAO DOS ONS
DETECO DOS ONS
ANLISE DA DISTRIBUIO DOS ONS

73
(A)

(B)

Figura: Anlise de uma mesma amostra contendo fenantreno e antraceno (mesma concentrao,
mesmo volume de injeo). No se atenha a diferena no tempo de reteno. (A)
fragmentograma m/z 178; (B) Monitoramento seletivo do on m/z 178.

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75
H30

m/z 191

H29

H31
T23 G
T21 Ts
H33
H35

20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0

m/z 218
C27
R
C29
C28
S

35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0


Figura: CG/EM-MSI, fragmentos m/z 191 e m/z 218, ons caractersticos de srie de hopanos e
esteranos de frao de hidrocarbonetos alifticos de amostra de petrleo de bacia brasileira.

CZE/MS
Eletroforese de zona capilar (CZE) e a espectrometria de massas (MS) foram
interfaceadas em 1987
tem emergido como uma aquisio importante no campo da qumica analtica, combinando
velocidade e alta eficincia de separao e baixo consumo de amostra gerado pela CZE, com
a sensibilidade e universalidade da espectrometria de massas.
CZE uma tcnica de separao de compostos inicos em um tubo aberto pela aplicao de
um gradiente de voltagem. Compostos migram diferentemente pelo tubo como resultado de
sua mobilidade eletrofortica. O fluxo eletroosmtico da CZE lquida uma tcnica
instrumentalmente simples, utilizando normalmente um capilar de slica fundida (50-100 cm)
contendo uma soluo tampo como coluna de separao, aplicando-se uma voltagem de 20-
76
60kV em uma das extremidades da coluna e com deteco UV ou fluorescncia atravs das
paredes do capilar.
os dimetros dos capilares so de 100microns ou menores no sentido de minimizar
gradientes trmicos atravs do tubo, o qual pode romper o fluxo laminar e destruir o processo
de separao.
amostras so introduzidas por mtodos eletroforticos (voltagem induzida) ou hidroesttica
(sifon), com volumes de injees na ordem de 1-200nL.
molculas biolgicas como peptdeos, protenas e nucleotdeos tem demonstrado eficincia
de separao to alta quanto 106 pratos tericos utilizando CZE.
o fenmeno de eletroosmose produz fluxos de lquidos de sub-mL/min na direo impressa
pela polaridade da voltagem e pela qumica de superfcie do capilar de separao.
Smith e colaboradores (1988) desenvolveram uma interface via electrospray para a CZE/MS,
sendo atualmente o mtodo de ionizao em espectrometria de massas mais favorvel.
a interface faz um contato eltrico com o tampo eletrofortico por intermdio de uma
pequena agulha ou um fino filme de metal depositado na superfcie do capilar. O solvente da
nebulizao produzida deste modo evaporado com N2 quente antes que os ons entrem no
analisador de massas.
quando informaes adicionais so necessrias utiliza-se a espectrometria de massas
tandem com o modo de varredura de on filho.
Desvantagem da CZE: pequeno volume de amostra que pode ser injetado. Resultado a
necessidade de solues mais concentradas a ser injetadas do que ocorre na CL/EM.
Lee e colaboradores (1989) descreveram uma variao da interface via electrospray, a
interface Ionspray para CZE/MS e CZE/MS/MS.
uma interface via FAB com fluxo contnuo tambm foi descrita para CZE/MS. Nesta, o
efluente da CZE combinado com um fluxo de matriz glicerol-gua via um capilar de slica
fundida coaxial.

As fontes de Electrospray e Ionspray resultam em:

produo de ons de espcies carregadas em solues aquosas, como preferido na CZE;


processo de ionizao a temperaturas ambiente suaves para compostos lbeis.

77
formao de cargas mltiplas o que amplia a faixa de massa do analisador e permite a anlise
de biopolmeros na faixa de massa do kDa, uma aplicao tpica de CZE.
utilizao do sistema EM/EM, gerando informaes estruturais e/ou alta especificidade de
anlise.

ESPECTROMETRIA DE MASSAS EM TANDEM


Dissociao induzida por coliso DIC: fragmentao de um on poliatmico aps coliso
energtica com um gs de coliso (CID - collision induced dissociation)
Conceito bsico: medio das razes massa/carga de ons antes e depois da reao no
espectrmetro de massas

mp+ md+ + mn

mp+ on pai
on pai X on molecular
on molecular o on de massa equivalente ao peso molecular do composto introduzido; pode
ser selecionado como on pai;
on pai no necessariamente um on molecular, fragmentos formados na fonte de on so
freqentemente selecionados como ons pai

md+ - on filho, indicando uma relao direta entre ele e o on pai;

mn - fragmento neutro formado na reao de dissociao. Como o espectrmetro de massa

s analisa partculas carregadas, esta espcie no detectada. mp+ e md+ so medidas, mn


inferido.
Experimento bsico: seleo do on pai no primeiro estgio de anlise em um instrumento e
depois a anlise dos ons filhos, freqentemente formado em um processo DIC, no segundo
estgio. Uma barreira de energia de ativao deve ser ultrapassada antes que a reao possa
ocorrer.
admitindo-se um gs de coliso em uma regio de reao para induzir dissociaes ativada
por coliso do on pai com um gs de coliso inerte (DIC) corao da EM/EM. Energia extra

adicionada a mp+ .

mp+ N md+ + mn
instrumentos de baixa energia, se o gs for espcie quimicamente reativa, pode ocorrer uma
reao de associao on/molcula;
78
mp+ + N md+ + mn
Varredura do on filho: a massa do on pai fixada e as massas de todos os ons filhos

formados a partir deste on pai so medidos, isto , md1+ , md2+ , md3+ .


essencialmente o espectro de massas de um on em um espectro de massas.
ons filhos so normalmente caractersticos da estrutura do on pai e um modo de se
determinar sua estrutura.
o primeiro estgio de anlise de massas seleciona ons de uma razo m/z particular (on pai)
de todos os ons inicialmente formados. Este on pai selecionado passa atravs da regio de
reao. ons filhos formados da dissociao do on pai na regio de reao so analisados;
espectro analtico nico da EM/EM - estudar misturas desconhecidas rapidamente em
relao a uma classe de compostos
Varredura de perda de fragmento neutro: experimento EM/EM especificando-se mn ;
muitos ons se dissociam pela perda de uma molcula neutra pequena associada ao grupo
funcional ou subestrurura do on pai.
identifica todos os ons pais de uma mistura que se fragmentam pela perda de um fragmento
neutro de massa definida;
confirmao da identidade do grupo funcional pode ser obtida pelo espectro de ons filhos do
on pai identificado pela varredura de perda de fragmento neutro;
vantagem: significante ganho de velocidade de anlise, evitando-se identificar todos os
componentes de uma mistura se somente uma classe definida de compostos de interesse.
Varredura de on pai: md+ a varivel independente
classe de compostos pode incluir uma subestrutura particular que forma um on bem estvel.
ons pais derivados de membros desta classe tendem a se dissociar levando a um on desta
subestrutura. Quando h um on filho comum, este pode ser fixado e se faz uma varredura
para detectar todos os ons pais.
EM/EM: limites de deteco melhores do que um espectrmetro de massas de estgio nico.
A sensibilidade e limite de deteco de um espectrmetro de massas no est limitado pelo
rudo do detector mas pelo rudo qumico.
Rudo Qumico: sinal medido no espectro de massas devido a gerao de ons de outros
componentes da amostra, contaminao de fundo da amostra do sistema de introduo de
amostra e da fonte de ons do espectrmetro de massas.

79
Maior sensibilidade e limites de deteco so obtidos na EM/EM, pois o primeiro estgio de
anlise de massas filtra muito deste rudo qumico.
Monitoramento Seletivo de ons (MSR): experimento que atinge o menor limite de deteco
possvel para um determinado composto na EM/EM de on filho.
todas as variveis so fixadas.
o primeiro analisador de massas fixado para selecionar um determinado on pai e o segundo
analisador de massas fixado para selecionar um determinado on filho. Anlogo ao
monitoramento seletivo de ons (MSI).
aumentar especificidade: EM/EM/EM: o on filho selecionado se fragmenta em uma segunda
regio de reao, e um on neto selecionado por um terceiro analisador de massas.
Ativao por coliso: processo no qual um on colide com um gs de coliso e uma parte da
energia do on convertida em energia interna do on. No caso em que h uma subsequente
dissociao do on na mesma regio de reao, o processo denominado dissociao induzida
(ou ativada) por coliso (DIC ou DAC).
Regio de reao: regio usualmente entre os analisadores, em um instrumento de setores, no
qual um on pode sofrer uma mudana na massa e/ou carga. Em espectrmetro de massas
baseados em setores esta regio de reao normalmente referida como regio livre de
80
campo. Outros instrumentos tm regies de reao nos quais campos eltricos so utilizados
para confinar um fragmento.

81
Figura: Sistema triplo quadrupolo da Varian e parmetros a serem ajustados.

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Figura: Espectrometria de Massas utilizando analisador tipo on Trap, EM6.
Espectrometria de massas aplicada a peptdeos e protenas

98
devido ao tamanho, polaridade e baixa volatilidade dos peptdeos e protenas, sua anlise por
espectrometria de massa s se tornou realmente til aps a descoberta da tcnica de ionizao
por dessoro, a PDMS em 1974 e FAB em 1981.

necessrio que a tcnica seja aplicada a


protenas/peptdeos simples
protenas/peptdeos conjugados (a carboidratos, lipdeos, fosfatos)

Produzindo
peso molecular (Mr)
estrutura covalente (sequncia, grupos modificantes)
estruturas no-covalentes (conformao, interao)
Gerando
faixa de massas alta
alta preciso na determinao da massa
compatibilidade EM/EM
capacidade de anlise de misturas
tolerncia frente a impurezas
alta sensibilidade
simplicidade

Performance necessria na tcnica analtica


desejvel a obteno de faixa do peso molecular por volta de 1MDa e uma exatido de 1Da.
maioria das tcnicas de ionizao so brandas
fragmento limitado e a informao estrutural escassa.
obteno de informaes estruturais detalhadas EM/EM
pode-se manipular picomole e com certos mtodos de separao atinge-se femtomol com
CLAE capilar e eletroforese

PDMS
limite prtico tem sido 20-35kDa, para protenas simples ou conjugadas
99
no tem sido eficiente na anlise de glicoprotenas, protenas altamente fosforiladas e
metaloporfirinas.
acoplamento com tcnicas hifenadas no possvel
til na obteno dos pesos moleculares

FAB
faixa de massa prtica 10-15kDa, bom para protenas e peptdeos pequenos
de grande valor a compatibilidade da tcnica EM/EM com FAB no estudo estrutural
detalhado.

ESI
determinao de massa precisa de pedaos de DNA com massa molecular at 100MDa foi
obtida por ESI/FT/ICR/MS
a espectrometria de massas pode sem dvida substituir o mtodo padro de sequnciamento de
peptdeos e protenas, degradao de Edman.
somente instrumentos que utilizam alta energia de coliso como o espectrmetro de massas de
4-setores, podem distinguir entre leucina e isoleucina, as quais apresentam a mesma massa.
1990 - foi demonstrado o uso da EM na determinao da conformao de protenas. Gera
informaes a respeito do estado conformacional de protenas.
determina-se a estrutura de adutos de DNA - DNA modificados por interaes com compostos
carciongnicos e drogas
Exemplo: uso da EM/EM par determinar a estrutura de adutos de Hidrocarbonetos Policclicos
Aromticos (HPAs - carciongnicos) com DNA. Pode-se distinguir diferenas estruturais
pequenas em HPA-DNA ao nvel do subpicomole.
McLafferty e colaboradores utilizaram a EM para estudar a mudana Hidrognio/Deutrio na
fase gasosa, baseado no conceito de que o nmero de prtons que sofrem mudana na fase
gasosa uma medida dos prtons situados no exterior da extrutura tridimensional da protena
na fase gasosa.

MALDMS
especialmente vantajoso na anlise de protenas bem grandes e protenas conjugadas

Como medir a Massa Molecular de uma protena


100
o programa do sistema calcula automaticamente a MM de uma protena
o espectro de massas de uma protena obtido via ESI consiste em uma srie de picos, cada um
representando um on da molcula da protena contendo um nmero especfico de prtons.
os ons tem a frmula geral (M+nH)n+

M a massa molecular da protena


n o nmero de prtons (cargas)
H a massa do prton (1,00794)
o espectrmetro de massas mede a razo massa para carga (m) de cada pico como m
= (M+nH)/n
segue-se que a MM (M=n(m-H)) pode ser rapidamente calculada pela razo massa para carga
medida se n for achado.
pode-se determinar n atravs de qualquer dois picos consecutivos diferindo de um prton na
srie
m2 =(M+nH)/n m1= (M+(n+1)H)/(n+1)
onde m2 e m1 so as razes massa/carga medidas de quaisquer dois picos com n e n+1
prtons respectivamente
resolvendo as duas equaes acima, a carga n de m2 determinada como
n= (m1 -H)/(m2 - m1)

101
102
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Peridicos:
- Journal of Mass Spectrometry - antigo Organic Mass Spectrometry
- Journal of American Society of Mass Spectrometry
- Biomedical Mass Spectrometry
- Biomedical & Environmental Mass Spectrometry
- International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes
- Rapid Communications in Mass Spectrometry

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