Trabajo final: PCR en tiempo real

Alumno: V. Adolfo Rojas Mendoza

Profesor: M. en C. Hctor Rodrigo Snchez Porras

Materia: Biologa molecular

Universidad Tecnolgica De Guadalajara

Guadalajara, jal. A 11 de mayo del 2017

Nombre De La Tcnica: PCR En Tiempo Real

Fundamento:
La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre
cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la
fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado. Este termociclador es un aparato con
capacidad para calentar y enfriar rpidamente las muestras, de modo que se aprovechen
las cualidades fisicoqumicas de los cidos nucleicos y las enzimticas del ADN polimerasa.
El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de cambios de temperatura que se
repiten en 25 - 40 veces, llamados ciclos, donde cada uno posee un mnimo de tres etapas:
la primero, en torno a los 95 C, permite la separacin de los cidos nucleicos de doble
cadena; el segundo, a una temperatura en torno a los 50-60 C, permite el alineamiento de
los cebadores al ADN molde;5 el tercero, a 68 - 72 C, facilita la polimerizacin por parte
del ADN polimerasa. Debido al pequeo tamao de los fragmentos amplificados
usualmente en este tipo de PCR puede omitirse el ltimo paso, pues la enzima es capaz de
amplificar durante la rampa entre la temperatura de alineamiento y la de desnaturalizacin.
Adems, algunos termocicladores aaden a cada ciclo unos segundos a otra temperatura,
por ejemplo 80 C, a fin de reducir el ruido por la presencia de dmeros de cebadores cuando
se emplea un colorante inespecfico. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada
ciclo dependen de gran variedad de parmetros, como: la enzima usada para la sntesis de
ADN, la concentracin de iones divalentes y desoxirribonucletidos (dNTPs) en la reaccin
y la temperatura de unin de los cebadores.

Reactivos Y/O Materiales:

El RT-PCR puede utilizar fluorforos generales de unin no especfica a ADN como el
Bromuro de Etidio o el SYBR Green I, sondas de hidrlisis (Sondas 5 nucleasa), sondas
de hibridizacin, molecular beacon o sondas de secuencias especficas.

Un requerimiento imprescindible para llevar a cabo con efectividad esta tcnica es la

utilizacin de una instrumentacin adecuada que permita detectar la seal fluorescente y
grabar el proceso de la reaccin de PCR.

Materiales Para PCR:

Termociclador Thermo cycler dNTPs ( dATP, dTTP, dCTP,

Microcentrfuga dGTP de [25 M] c/u)
Micropipetas de 2, 20 y 200 ul 10X buffer para PCR (Solucin
Microtubos para PCR, estriles amortiguadora para PCR)
Puntas estriles MgCl 2 (25 mM)
Agua destilada, desionizada y BSA
estril Polimerasa Taq
ADN molde (ADN en estudio) Sondas Taqman y sybr Green
Primer Forward y Reverse
Aplicacin De La Tcnica:
La emergente tecnologa del PCR en tiempo real ha demostrado su versatilidad y utilidad
en diversos campos de la investigacin biomdica y el diagnstico biomolecular, siendo la
limitante la imaginacin de investigadores y fabricantes de nuevos equipos, productos y
servicios asociados a estas ramas del conocimiento. Entre los campos de accin que ms
recurren a esta tecnologa se cuentan la virologa, la microbiologa clnica y la investigacin
biomdica, aunque existen otras como las industrias alimenticias y farmacuticas que han
hecho o harn uso de esta tecnologa. En el presente captulo se revisarn algunas de las
aplicaciones actuales y las perspectivas futuras de la tecnologa del RT PCR.

Si bien el uso ms ampliamente difundido de la PCR en tiempo real consiste en la

evaluacin de la expresin gnica de genes concretos de forma relativa (empleando ARNm
de la muestra y retrotranscribindolo a ADNc, que es medido mediante la tcnica), otras
aplicaciones han sido desarrolladas fuera del entorno puramente acadmico. Las
aplicaciones de impacto en la industria incluyen la cuantificacin de carga microbiana en
alimentos o en material vegetal, la deteccin de OGM (organismos genticamente
modificados) y la cuantificacin y genotipado de patgenos virales en humanos.

Bibliografa:

Mtodos fsico-qumicos en Biotecnologa (2006-II), Dr. Roberto P. Stock Silberman.