INTRODUCAO A METODOS CROMATOGRAFICOS Carol H. Collins - Gilberto L. Braga - Pierina S. Bonato coordenadoresEste livro é uma introdugdo descritiva de varios métodos cromatograficos que est4o sendo usados tanto em pesquisas universitdrias quanto em andlises de rotina em laboratérios industriais. Ele retine os principios basicos da cromatografia com descrig6es de suas diferentes modalidades, seus equipamentos e aplicagGes. fos O livro preenche lacuna resultante da falta de uma obra em I{ngua portuguesa que aborde de forma didatica e completa as varias técnicas cromatograficas. Ele tanto serve como livro-texto para alunos de graduacio e de pdés-graduac4o quanto como um manual para usudrios de . cromatografia, apresentando, além dos conceitos basicos, varias teferéncias que podem compleméntar o interesse de pessoas que atuam n@ycampo cromatografico. O livro também traz uma série de experiéncias simples e relativamente faceis que podem auxiliar no ensino da técnica. Assim, esta obra, ao lado de ser uma | ~~ = pega importante para g*pesquisadores quimicos, é também'teé grande valia para pesquisadores de outras 4reas, como biologia, ciéncias farmacéuticas, engenharia de alimentos e geologia, que possuam problemas de separacao quimica e.rectorram a cromatografia coma: feffamenta auxiliar, de trabatho. ofa Se tol gy, sand te a “goat F SSeS yey tet aadFICHA CATALOGRAFiICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL DA UNICAMP Introduc4o a métodos cromatograficos / coord. Carol H. Ins Collins, Gilberto L. Braga e Pierina S. Bonato. -- 7.ed. -- 7.ed. Campinas, SP : Editora da UNICAMP, 1997. (Série Manuais) |. Cromatografia — Quimica analitica. I. Collins, Carol H. II. Braga, Gilberto L. III. Bonato, Pierina S. IV. Titulo. ISBN 85-268-0164-3 20.CDD - 543.089 Indice para Catdlogo Sistematico: 1. Cromatografia: Quimica analitica 543.089 Série Manuais Copyright © by Carol H. Collins Gilberto L. Braga Pierina S. Bonato Coordenagao Editorial Carmen Silvia P. Teixeira Produgao Editorial Sandra Vieira Alves Editoragao Nivia Maria Fernandes Revisao Adagoberto Ferreira Baptista : Diagramacao/Formatac4o/ Impressfo a laser Projeto A Comunicacées Ltda. a Arte-Final Nelson Norte Pinto Capa Vlad Camargo ’ = Editora da Unicamp Caixa Postal 6074 Cidade Universitaria - Barao Geraldo CEP 13083-970 - Campinas - SP - Brasil Tel.: (019) 239.8412 Fax: (019) 239.3157SUMARIO APRESENTACAO . 000 9 I- PRINC{PIOS BASICOS DE CROMATOGRAFIA?. , . eee eee 1 — l.Introdugdo 2... 13 2. Aspectos hist6ricos da cromalografia . 0. 13 3. As classificagdcs da cromalografia 2... 15 4. Alguns termos (6cnicOS 26 20) 5.Referéncias ...... ee 26 Il -~P CROMATOGRAFIA EM PAPEL . 2. 1 0. 29 MIntrodugdo 2. ns G1) 2. Definicdes e termos usados na cromatografiacmpapcl 2... (33) 3. Considcragées sobre a cromalografiacm papel . 6. 34 —__\4. Cromatografia em papel com fase normal ¢ com fase reversa ww 37 5. Técnica da cromalografiaem papel... 66. 38 6. Métodos de delectar as substancias separadas «2. 39 C Andlise qualitaliva .. 2... ees Les 4f) ~ 8. Andlisc quantilaliva . 000 Al) — 9.AplicagdesdaCP . 1. - ee 42 10. Referencias 0.0 ns 43 Be _, I] >CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA. |. . . ce Lecce eee eee eee 45 om L PG Q)Introdugdo ....-.-- ys: ee 47 . 2 OsadsorventCS 2.66 eee ee ee es ne 47 pO 3. Técnicas gerais 6 of) 4. Formas de desenvolvimento i... 0 54 5. Andlise quantilaliva . 6... 55 6. Cromatografia em camada delgada de alta cficiéncia (CCDAE) 0.0.6 0 ee et 55 7. Aplicagdes daCCD ooo ee 8 Referencias 6. 56IV- CROMATOGRAFIA POR ADSORCAO A eee eae ene eee nee 59 MIntrodugdo 2. ne ee 61 2Acoua oo... ccc cece e bbe teens 61 3. Os processos de adsorcfo emcoluna 1... . 0-0 ee ts 62 / 4. Preparagéo dos adsorventes 0.2.00. 0000 eee tt tts 63 C f 5. Reacgdes nacoluna...... : ne ee 64 6.Escolhadeeluentes ..........0. 000 eee ee 64 7.Enchimento dacoluna .......... 008 eee es 65 8. Aeluigdo0 2... ns 65 : 9. Cromatografiaemcolunaseca ....... 000 et 68 : | 10. Uso da cromatografia por adsorgdo . 2.1 ee 70 11.Referéncias . 2... G0) V- “@ROMATOGRAFIA PORTROCAIONICA .. 2.200000 00 ee ee 71 C1 Introdugado Ce 73 ‘ 2. O mecanismo de cromatografia por trocaiOmica .. 1. 6 74 B.A matriz 2 75 4.Os grupos trocadores 2.1... 81 5. Propriedades de trocadores i6nicos «6... 84 6. Fatores que influenciam a cromatlografia por trocaiénica 2. 2 86 7. Eluicgdo em cromatografia por trocaidnica .. 6... 88 8. Aplicagdes 2.6 90) 9. Referéncias .. 1. ce 93 VI -DCROMATOGRAFIA POR EXCLUSAO ..........00--00-0005- wee 95 (1 )Introdugao Ce a - ... 97 2. Conceitos que caracterizam a cromatografia por exclusaO «22.7. ee ee ee ee 98 3. Recheios usados em cromatografia por exclusaO .. 2... ee 103 4, Equipamento para cromatografia por exclusaO 7... ee 109 5. Pardmetros expcrimentais cm cromatografia por cxclusaO 7... ee ee 110 6. Aplicagdes de cromatografia por exclusaO «1... ee, ~ 114, 7.Referéncias ....... ek ee ee | VIE CROMATOGRAFIA POR BIOAFINIDADE .................0 06. et Ky Introdugdo «1... ; . Lee ee ey . Lk 2. Principio do método 2... ee 3. Selecdo do suporte insolivel ou matriz «1... 2... ee ee el, 4. Preparagao de fases estaciondrias scletivas ..... ee 5. Metodologia operacional .......... 2.000000... 200000000 eee ee, 6. Aplicagoes da cromatografia de afinidade ...........0.20202020.2..., 7. Referéncias ..-- ee ee, ee eee,VILL DC@ROMATOGRAFIA GASOSA HL. IntrodugdO 2. 143 2. Técnicas usadas cm cromatografia gasosa y. ee 144 3. Eficiéncig 145 4.Fascestacionaéria 0. 148 5. Equipamento para cromatografia gasosa .. 2... ee es 152 6. Andlise qualitativa .........-. Es 166 7. Andlise quantilaliva oes 168 8. Derivaghio 2. es 172 Q.Aplicagdes 2... es 174 1 Referéncias 2... 180 . y LX <> CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA «2. 2-2-2 183 — GPrincipios de cromatografia liquida de alta eficiéncia cc 185 2. As técnicasda CLAE ..........-+48:5 . De 189 3. Caractcristicas das fases méveis usadasem CLAE «wwe ee 195 4. Caracteristicas das fases estaciondrias usadasem CLAE .... 2... ee eee et ts 195 5. Caractcristicas das colunas usadasem CLAE «1.1... ee ee 207° 6. Equipamento paraCLAE .. bebe b bb bb bbb bebe nee 210 7. Aplicagoes da CLAE «6. ee es 229 8 Referéncias 2. es 238 X . APRATICAS DELABORATORIO ..... 00000000 239 (WCromatografiacm papel... 241 4. Cromatografia cm camada delgada bebe bb beeen ete eee 243 3, Cromatografia por adsorgaO 6. ss 246 4. Cromatografia por troca IOMICA we . . 248 5. Cromatografia por exclusdiO ww ee ee es 251 6. Cromatografia por bioafinidade 2... 253 7. Cromatografia gasosa . 6 eee es Re eee 254 8. Cromatografia liquida de alta cficiéncia $e 259 APENDICES ...00 0000 ttt tnt ees 265 INDICE REMISSIVO 000000 eee eee 273APRESENTACAO De modo geral, as técnicas cromatograficas sao de larga aplicagéo em quimica e bioquimica, na pesquisa ¢ na indastria. , ( Estas técnicas cromatograficas variam desde as de extrema simplicidade, que podem ser facilmente manipuladas por nao-pcritos, alé as de alla sofisticagao, usadas s6 por especialistas. Entre estes dois extremos existem muilas variagoes de maior ou menor complexidade. ) Para cada modalidade de cromatografia estado disponiveis livros especializados, bascados em artigos originais, publicados em inglés ou outra lingua cstrangeira nas revistas de cromatografia. Porém, sao raros os livros em lingua portuguesa que contém as informagoes bisicas, tcGricas ¢ praticas sobre estas técnicas de tao largo uso. Na tentativa de evitar a dependéncia de livros em lingua estrangcira, publicamos, ¢m 1987, a primeira edicio deste livro bdsico sobre técnicas cromatograficas que apresentou informagocs sobre as varias modalidades de cromatografia. O sucesso obtido nos motivou a langar esta nova edicdo, cxaustivamentec revisada e ampliada, tanto no conteddo dos capitulos jd cxistentes quanto do novo, descrevendo outra modalidade de cromatografia. Este livro continua sendo destinado ao uso, Como texto, CM Cursos a nivel de graduagao ou como livro ‘ntrodut6rio as técnicas de separacgdo cromatografica para pos-praduandos. Pode também servir como base para o pesquisador que pretende usar a cromatografia apenas como uma ferramenta em suas experiéncias, scm necessitar de uma basc tc6rica profunda. \ Conseqiientemente, este livro nao se destina a especialistas ¢ nem € um compéndio que abrange as a todos os novos desenvolvimentos no campo. Técnicas cromatograficas estao em continuo . a} e . . . desenvolvimento'e rapidamente tornam obsolcto qualquer livro desta categoria. Sendo assim, esta finalidade —_ sera melhor atingida pela consulta a livro c outras referencias citadas nas listas bibliograficas que referénci acompanham cada capitulo, bem como novos livros ainda nao publicados. A obra consiste de um capitulo descrevendo os principios basicos de cromatografia, oito capitulos que descrevem as diferentes técnicas cromatograficas ¢ um capitulo que retine sugestocs para experimentos na programagao expcrimental das disciplinas; bem como os apéndices que apresentam os simbolos recomcendados para uso cm cromatografia na lingua portugucsa c outras informagocs importantes. 9Apesar dos capitulos terem autores diferentes, cada um descrevendo a sua especialidade, houve um esforco coletivo na confeccao do texto para que Os termos e simbolos fossem uniformes. Os termos e simbolos usados sao os sugeridos em publicagoes recentes na revista Quimica Nova (vol. 11, pp. 443-464 (1988) e vol. 12, pp. 92-94 (1989)), que se baseiam, em sua maioria, nos recomendados pela Unido Internacional de Quimica Pura e Aplicada. Entretanto, leitores que procurarem as refcréncias citadas deverdo estar alertas para o fato de que os simbolos e termos aqui usados podem estar substituidos por outros, sendo que, recentemente, nao existia uniformidade nos simbolos e termos usados nas diferentes modalidades de cromatografia. As unidades das quantidades fisicas e simbolos adotados seguiram as indicacoes do Sistema Internacional de Unidades (Le Systéme International d’Unités (SI), 5* edigao, 1985). Os editores e autores desta obra consideram que nela aplicaram o melhor de seus esforcgos. No entanto, agradeceriam nao s6 sugestOes como indicacgoes para erros e/ou conccitos mal formulados. Além disto, agradecem aos que direta ou indiretamente colaboraram com seu trabalho e entusiasmo para que esta publicagdo se tornasse viavel. 10 ee eee. aCAPITULO I PRINCIPIOS BASICOS DE CROMATOGRAFIA Carol H. Collins Instituto de Quimica da Universidade Estadual de Campinas@) t INTRODUCAO | a Lo Entre os m€todos modcrnos de andlisc, a cromatografia ocupa um lugar de destaque devido a sua facilidade em efetuar a scparacao, identificacdo e quantificagdo das espécies quimicas, por si mesma ou em conjunto com outras técnicas instrumentais de andlisc, como, por exemplo, a espectrofotometria ou a espectrometria de massas. ee — © 4a cromatografia € um método fisico-quimico de scparagéo dos componentes de uma mistura, - fealizada através da distribuigéo destcs componcntes entre duas fascs, quc estao em contato intimo. Uma ) das fases permanccc estaciondria cnquanto a outra move-sc através dela. Durante,a passagem da fase movel sobre a fase estaciondria, os componentes da mistura sao distribufdos entre as duas fases, de tal forma que cada um dos componcntes € selctivamente retido pela fase estaciondria, resultando em migracoes difcrenciais destes componentes.."(# Existem varias formas dese realizar o processo cromatografico, Detalhes sobre algumas destas formas scrao assuntos dos capitulos a scguir, enquanto que neste serdo aprescntados alguns dos conccitos mais gerais. Antes disto, sera relatada uma breve revisdo hist6érica do desenvolvimento das técnicas \ cromatograficas mais importantes., x" \ NL 2. ASPECTOS IIISTORICOS DA CROMATOGRAFIA Os termos "cromatografia", "cromatograma" e "método cromatografico" s4o atribuidos ao botanico russo MIKHAEL SEMENOVICH TSWETT, quc, em 1906, utilizou estes termos em dois trabalhos descrevendo suas experiéncias na scparagao dos componentes de extratos de folhas ¢ gema de ovo, onde usou colunas de vidro recheadas com varios sdélidos, finamente divididos, ¢ arrastou Os Componentes com éter de petréleo. O nome deriva-se das palavras gregas "chrom" (cor) ¢ "graphe" (escrever), embora o processo nao dependa da cor, exccto para facilitar a identificagao dos componentes separados. ~ [Todavia, nesta época os processos, aplicando a migracao diferencial, j4 cram bem conhccidos. Paralelo aos desenvolvimentos de TSWETT, REED, na Inglaterra, e DAY, nos Estados Unidos, aplicaram colunas contendo s6lidos para a scparacao de sais orgiinicos c amostras de petrélco, respectivamente. bem antes destcs, RUNGE descreveu os "descnhos" fcitos por misturas de sais ¢ por tintas que foram colocadas no centro de um papel de fillro e¢ depois cspalhadas pcla passagem de um solvente, enquanlo 13SCHOENBEIN fez experiéncias similares com tiras de papel mergulhadas em solventes. O uso de sdlidos em camada delgada sobre vidro, no lugar de papcl, para o desenvolvimento circular de misturas de sais inorgsinicos fol experimentado por BEYERINCK em 1889. “_Apesar destas experiéncias, considerou-se que a época moderna de cromatlografia comegou na década de 30, quando KUHN c LEDERER "redescobriam" ¢ aperfcigoaram a cromatografia em coluna, repetindo as experiéncias de TSWETT, scparando c identificando as xantofilas da gema de ovo, usande uma coluna recheada com carbonato de calcio pulverizado e éter de petrdlco como fase movel. / Em 1941, MARTIN e SYNGE publicaram um trabalho no qual descreveram a cromatografia por particaa (cromatografia liquido-lfquido), aplicaram o conceito de altura cquivalente a um prato tedrico a cromatografia e anteciparam o surgimento de duas cromatografias: a gasosa € a liquida de alta eficiéncia, Por este trabalho receberam o Prémio Nobel em 1952. MARTIN também participou em outros desenvolvimentos importantes na hist6ria da cromatografia: com CONSDEN € GORDON, reintroduziu a cromatografia em papel; com HOWARD, desenvolveu a cromatografia liquida aplicando as chamadas “fases reversas"; e com JAMES, atualizou a cromatografia g4s-liquido. A cromatografia g4s-sélido foi descrita pela primeira vez. cm 194], por HESSE c col., que scpararam dois Acidos graxos, no vapor a 100°C, arrastando-os sobre silica com 0 gas, didxido de carbono, enquanto CREMER e PRIOR foram os primciros a descrevercm um cromalografo a gas completo. 7 O desenvolvimento, quase simultaneo, do detector por ionizagéo cm chama por PRETORIUS ¢ col. e por McWILLIAMS e DEWAR, ampliou a sensibilidade do método cromatografico, enquanto que a introdugao de colunas capilarcs por GOLAY ampliou os scus poderes analiticos, ao ponto de tornar a cromatlografia gasosa o método analitico de separacao c determinagdo mais usado no mundo. ‘| A cromatografia em camada delgada foi reintroduzida em 1938, por IZMAILOV & SCHRAIBE R, paraa andlise de produtos farmacéulicos, mas nao foi muito usada alé 0 desenvolvimento, por KIRCHNER e col., do método de aderir o sélido ao suporte e, por STAHL, do método de preparar as placas com reprodutibilidade. A cromatografia por troca iénica também (eve scu inicio, na €poca moderna, nos anos 30, com a sintése, por ADAMS e HOLMES, das primeiras resinas de troca idnica, bascadas em fenol ¢ formaldeido, que permitem a troca de cAtions. Posteriormente, resinas de poliacrilico ou poliestircno entrecruzado com divinilbenzeno, com substituinfes sulf6nicos, carboxilicos ou alquilaminos, substituiram as originais. ~ As resinas de poliestireno-divinilbenzeno so as mais aplicadas em bioquimica, tendo inicio com as experiéncias de COHN na separagao de aminodcidos originados de Acidos nucléicos. “A separagao de aminodcidos foi aperfeigoada por MOORE c STEIN ¢, postcriormentc, mecanizada por cles, usando uma bomba peristaltica para cmpurrar a fase mévcl c um fol6metro para a delecgao, apos uma reacgio para produzir os derivados com ninhidrina. Em 1959, este sistema para a anilise de aminodcidos foi modificado por HAMILTON e ANDREWS, con a introdugao de uma bomba lipo pistao, similar as usadas ainda hoje em cromatografia liquida de alta eficiéncia. Outros desenvolvimentos na década de 60, por KARR ¢ col., JENTOFT ¢e GOUW, HUBER e HULSMAN, SNYDER, KIRKLAND e outros, aperfcigoaram os sistemas de bombeamento e deteccao de cromatografia liquida de alta sae Peeve que 0 uso destes equipamentos, operado com fase mével liquida sob presséo e com métodos de detecgao sensiveis, possibilita andlises de rapide comparavel as de cromatografia gasosa, com resultados allamente satisfatdrios. Paralclamente, os enchimentos para a cromatografia liquida de alta eficiéncia foram sendo desénvolvidos, inicialmente os peliculares (particulas superficialmente porosas) por HALASZ ¢ por HORVATH, , 9 postcriormente as parliculas completamente porosas de didmetro pequeno (10 sem, Sem e 34m) por KIRKLAND e outros. O desenvolvimento, por NICKLESS ¢ col., de fases estacionarias 14contendo grupos alquilas quimicamente ligados ao suporte permitiu a aplicagao da chamada “fase reversa" (fase estaciondria apolar), ampliando as aplicacées desta técnica, enquanto a introdugao de colunas de diametro interno menores (as "microbores" € as "capilares recheadas") por SCOTT e por NOVOTNY viabilizaram o uso de cromatografia lfquida de alta cficiéncia para qualquer tipo dc an4lise, quer organica quer inorganica. / Outra (écnica cromatografica que deve seu crescimento ao desenvolvimento das fases estacionarias cont grupos alquilas quimicamente ligadas 6 a cromatografia usando um fluido supercritico como fase movel.JEsta técnica, que foi aplicada com sucesso por KLESPER e col., em 1962, quando se usou um cromatdgrafo a g4s modificado, recebeu varias outras alleragoes por GOUW c JENTOFT no decorrer dos anos Seguintes, Somente cm 1983 € que foi lancado o primeiro aparclho comercial dedicado a esta técnica. . “Além do fato de que varios zcolitas e amidos naturais ¢ modificados j4 tenham sido testados para a separacado de compostos neutros de tamanho grande, |foi o desenvolvimento de um gel de dextrano entrecruzado que possui propriecdades de uma pencira quase perfcita, por PORATH e FLODIN, que . iniciou a cromatografia por exclusdo para separacées de moléculas de interesse biolégico em solugoes aquosas. —— f Scparagécs por tamanho de polfmeros, requisitando o uso de solventes organicos, foram realizadas por MOORE, usando poliestirenos com grau varidvel de entrecruzamento. . CAs primciras expcriéncias cm cromatografia por bioafinidade foram [citas por LERMAN e col. em os % 1954 Bles isolaram anticorpos usando uma coluna recheada com celulose contendo os antigenos aprepriados. Aperfeigoada por ANFINSEN c col., com o uso de gels de dextrano contendo grupos espccificos quimicamente ligados, esta técnica tem grande aplicagao na scparagao ¢ purificagao de protcinas ¢ dcidos nucléicos, pois permite a imobilizagao de somente as espécics complementares aos grupos ligados, c a sua posterior cluigaéo com nova fase mével. Varias outras revisoes histéricas, mais extensas e/ou mais especificas, se encontram na leitura de cromatografia. O Icitor interessado pode consultar, dentre estas, a publicada por MORHY. —= wah. Lakes ® 3. AS CLASSIFICACOES DA CROMATOGRAFIA “oO | Sao v4rios os critérios usados para a classificagao das diferentes modalidades de cromatografia, sendo os mais comuns relacionados a técnica empregada, ao mccanismo de separagao envolvido ¢ aos diferentes lipos de fases ulilizadas. A forma fisica do sistema de cromatografia define a técnica geral: a fase estacionaria pode ser 4€ colocada em um tubo cilfndrico ou disposta sobre uma superficie planar, Baseando-se nesta, a cromatografia pode scr subdividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar..Na primeira, de acordo com o tamanho do didmetro interno do tubo, temos as colunas preparativas (6-50 mm), analiticas (2-6 mm) e com microdiamctro (<2 mm). As colunas preparativas c analiticas sempre apresentam a fase estaciondria na forma de particulas ¢ a fase aliva na forma de um sdlido ou de um liquido que tanto pode recobrir a superficie do sélido como estar quimicamente ligado a ele. As colunas com microdiametro também podem ser recheadas coma fase estacion4ria ou podem possuir a fase estacion4ria sob a forma de um filme ou de particulas aderidas nas paredes do tubo. - pers “Considerando o cstado fisico da fase movel, distingue-sc alcromatografia gasosa, onde a fase moével _ éum gis, a cromatografia liquida, onde a fase mével é um liquido, ¢ a cromatografia supercritica, onde se usa como fase mével um vapor pressurizado, cm temperatura acima de sua tempcratura critica, com as vantagens de ter viscosidade menor do liquido, mas mantcndo as propriedades de interagao com Os solutos. 15\ A cromatografia liquidaem ‘m coluna também se divide em dois grupos: a cromatografia liquida classica, feita em colunas de vidro, sob: pressao atmosférica, com 0 fluxo da fasc mével devido a forga da gravidade (poris isto, as vezes esta técnica 6 chamada' 'cromatografia liquida por forga da gravidade’);ca a cromatogr afia liquida de alta eficiéncia (CLAE), que usa colunas metélicas ¢ pressocs de fase mével clevadas, obtidas_ op PN eee com auxilio. de un uma a bomba de alta pressao (c, por isto, é, as vezes, chamada ' ‘cromatografia liquida de alta pressao") que pode cmpurrar a fase mével com vaz.do_mais rapida ) resultando cm outro nome: "cromatografia liquida de alta velocidade’ ). Sugere- sc, como y nome prefcrido desta técnica ,.cromatografia liquida de alta eficiéncia, devido d sua caractcristica'mais importante, que € a ‘clevada eficiéncia atingida na separacao. > O estado fisico da fase estaciondria_ pode ser liquido ou sdlido. O liquido pode estar simplesmente espalhado sobre um suporte solido ou imobilizado sobre este. A imobilizagao_pode en envolver r ligagdes. quimicas entre o liquido €0 ‘0 suporte a ou somente ‘entre as cadcias do o proprio liquido. Devido as vantagens de volatilidade e solubilidade reduzidas atribuidas as fases estacionArias contendoa parte ativa na separacao quimicamente imobilizada sobre o suporte, € comum considerar-se esta uma categoria distinta, ou seja, a cromatografia com fase ligada. Justifica-se esta distincdo pelo fato de que seu mecanismo de separacao freqiientemente difere dos mecanismos atribu{dos as fases estacion4rias lfquidas ou sdlidas. A Figura I-# mostra as cla afia, segundo as formas fisicas mais cncontradas, CRITERIO DE CROMATOGRAFIA CLASSIFICACAO . | | TECNICA PLANAR . EM COLUNA | ae FASE MOVEL Liouloo GAS FLUIDO Liautoo | | SUPERCRITICO | FASE LiouID0 §=—- SG LIDO FASE Liquioo S6LID0 FASE 56.100 FASE LrouIDO s6L100 FASE ES TACIONARIA LIGADA LIGADA LIGADA | LIGADA ® TIPO CE cco cco CGL CGS CGFL SS t c 5 7 . CROMATOSRAFIA C CSFL tel cL cE CLEL cv 8 FIGURA I-1 Classificagdo de cromatografia pclas formas fisicas. Uma outra classificagao bascia-se na polaridade rclativa das fascs. Em cromatografia gasosa, a fase movel € inerle e a separacao ocorre devido as inlteracgdes das moléculas da amostra coma fase estacionaria, enquanto que, na cromatografia liquida, a polaridade de ambas as fases é importante, Chama-se cromatografia liquida com fase normal quando a fase estaciondria é mais polar do quc a fase mével, e cromatografia com fase reversa quando se tem o inverso, OU scja, a fase mével é mais polar ec a fase cstacion4ria mais apolar. O método de introdugao da amostra c scu subseqiiente desenvolvimento constitu; um Oulro po de classificagao (Figura 1-2). A introdugao da amostra cm uma tinica aplicacao e scu desenvolvimento com 16t. uma fase mével pura, que arrasta a amostra ao longo da coluna, 6 0 método da eluigdo, 0 tipo mais encontrado em cromatografia analftica. Na cromatografia preparativa, especialmente em nivel industrial, freqiientemente usa-se 0 desenvolvimento por deslocamento, onde os componentes da amostra, uma vez aplicados a coluna, sao arrastados ao longo da mesma usando, como fase mével, um deslocador que € mais atrafdo pela fase estacion4ria que qualquer um dos componentes. O cromatograma resultante nao mostra picos separados, mas bandas dos componentes separados (Figura I-2). Também se encontra em uso industrial a andlise frontal, onde a amostra é continuamente aplicada a coluna, sendo o componente menos retido o Gnico que sai na forma pura (Figura 1). | IN(CIO A+B+c ’ FASE, . ESTACIONARIA / a (COM ELUENTE) DESENVOLVIMENTO aN ELUENTE - DESLOCADOR AMOSTRA | | — CrtE B+E elk A tet ad ae NRE cet ANALISE FRONTAL FIGURA 1-2 Métodos de desenvolvimento cm cromatografia. ' 17Entretanto, considera-se que a classificag4o mais importante ¢m cromatografia baseia-se no mecanismo de separagao, que pode ser por processos fisicos, quimicos ou. mecanicos, Os processos ffsicos sao de sorgao - adsorgao ou absorgao (partigdo) - e sao baseados principalmente em atracoes eletrostdticas ou dipolares (forgas de van der Waals), incluindo a formacao de pontes de hidrogénio. Quando se trata de um sélido, como sflica ou alumina, como fasc estacion4ria, a adsorgao do soluto ocorre na interface entre 0 sélido € a fase mével, devido a presenga.de grupos ativos nas suas superficies (Figura I-3a). A dessorcao do soluto implica na volta deste a fase mével. Este € © Mecanismo mais comumente encontrado em cromatografia em camada delgada (CCD), em cromatografia gés-sélido (CGS), (RE ce ry ty cromatografia liquido-sélido (CLS) e cromatografia supercritica com fase estaciondria sdlida (CSS). CLE L EL ITIA ITT TTI IT TTT T TT T N N & & x S S ty FIGURA I-3 Fisquema dos mecanismos cromatogrdaficos de a: adsorcao; b: particdo; c: troca iOnica: d: bioafinidade c c: exclusioQuando a fase estaciondria 6 um Ifquido, espalhado na superficie de um suporte solido e inerte, ou nas paredes do tubo cromatografico, 0 processo 6 intrafacial; ocorrendo por absorgao, ou particao, que se baseia nas diferentes solubilidades dos componentes da amostra na fase estacionaria, (Figura I-3b).A volta dos componentes A fase mével depende de sua volatilidade (fase mével gasosa) ou de sua solubilidade nesta fase (fase mével liquida), Encontra-se este mecanismo na cromatografia em papel (CP), na cromatografia gds-liquido (CGL) e na cromatografia lquido-Ifquido (CLL). As fases quimicamente ligadas sfio preparadas reagindo-se alguns grupos hidroxilicos que se encontram na superficie do sélido, normalmente a sflica, com grupos alquilas ou alquilas substituidos. Dependendo do tipo de ligacdo entre o suporte ¢ a cadcia substituente, estas fases mostram maior estabilidade As temperaturas altas ¢ resistem a dissolugéo pela fase mével. Estas fases estacionarias apresentam aos componentes da amostra tanto cadcias longas de alquila, que funcionam como liquido apolar, como regides da superficie com pontos ativos interfaciais. Sendo assim, 0 mecanismo de separa¢gao destas fases 6 um compromisso entre particgio ¢ adsorcio ¢ as suas contribuigoes dependem da quantidade rclativa de cada tipo de grupo funcional. Estas fases estaciondrias quimicamente ligadas sao as formas mais represcntativas de cromatografia Ifquida em coluna (CLFL), sendo também muito usadas na cromatografia que cmprega um fluido supereritico com fase mével (CSFL). Apesar de terem sido inicialmente descnvolvidas para a cromatografia gasosa (CGFL), 0 scu uso nesla modalidade 6 menor, exceto com colunas de dimens@es capilares, onde a fase estacionaria est4 freqicntemente imobilizada ou quimicamente ligada a parede do tubo. Fases quimicamente ligadas cstéo sendo usadas com mais freqiiéncia na cromatografia em camada delgada (CCD), especialmente na técnica chamada cromatografia em camada delgada de alta cficiéncia (CCDAE). Para o processo quimico de (roca idnica, a fase estacion4ria € constituida de uma matriz, onde sao adicionados grupos funcionais ionizdveis. Assim sao obtidos os trocadores aniOnicos que tém sitios ativos carrcgados posilivamente, retendo anions, ¢ os trocadores calidnicos, que tém sitios carregados ncegalivamente que retém cations. A fase mével 6, geralmente, uma solugdo iénica com propricdades tamponantes, escolhidas de forma a ser compativel com o tipo de trocador usado. Desta mancira, se a fase estaciondria retém cations, a fase mével deve conter cations capazes de substitui-los preferencialmente. A Figura I-3c indica uma representacao do mecanismo de cromatografia por troca ionica (CTI) (ver capitulo V). Outro processo quimico encontrado na cromatografia utiliza grupos com especificidade bioldgica quimicamente ligado as matrizes. Estes grupos, que podem ser, por cxemplo, antigenos, enzimas ou lecilinas. rctiram da fase mével somente os componcnics complementares, os anlicorpos, protcinas ou acticares, respectivamente, deixando passar todas as outras espécics da amostra, como indica a Figura I-3d. Na cromatografia por bioafinidade (CB), a cluigao dos componentes rctidos pode ocorrer coma mudanca das propricdades da fase movel, por cxemplo, a sua acidez, que modifica as propricdades ou do grupo ligado ou do scu complementar, ou por métodos de deslocamento usando outro grupo fortemente atraido wer capitulo VII). =A cromatografia por | exclusao, ) (CE) bascia-sc cm um processo puramente mecanico. A fase natriz de composicao inerte, com particulas de forma, tamanho ¢ porosidade uniformes.s sstaciondria€ umat As moléculas da amosira sao separadas porque as menores sao capazcs de penctrar facilmente em todds. os poros da fase estaciondaria, equilibrando-se com a fase mével intrasticial e intersticial, enquanto_as NAO aes, . maiorcs sao excluidas de todos os poros{ passando entre os granulos acompanhando a fase mével intersticial, isto 6, a fase mével que fica fora dos poros (Figura I-3e). As moléculas com tamanho efetivo intermedidrio migram com velocidades variaveis entre cstcs dois extremos, sendo que possucm penetragao sclctiva nos poros, entrando cm alguns, mas nao cm todos, ¢ saindo da coluna em ordem rclacionada com, scu tamanho efetivo (ver capitulo VI). 194, ALGUNS TERMOS TECNICOS /A A cromatografia tem aplicagGes qualitativas e quantitativas, obtidas analisando o cromatograma depois de seu u desenvolvimento, quer. diretamente na superficie planar, quer pelo sinal registrado apés o eluato passar por um detector/ dosde s¢ obter informagoes quantitalivas sao especificos para cada tipo ipo de cromatografia; eles serao expostos nos capitulos seguintes. Aqui serao comentados algumas definicdes e termos mais gerais, comuns a todos os tipos de cromatografia.” As Figuras I-4 e I-5 mostram cromatogramas tipicos de cromatografia planar e cromatografia em coluna, respectivamente. Nelas também sao indicadas algumas medidas de distancia, importantes a cada 3 tipo de cromatografia utilizada. = a Na cromatografia planar, a fase mével, proveniente de um reservat6rio, passa através dos pontos de partida da amostrae arrasta os componentes da amostra durante o processo de desenvolvimento. Define-se por dr a distancia percorrida pelos componentes e por dm a distancia percorrida pela fase mével (Figura I-4). Linha de chegada da fase movel ponto de partida profundidade da fase movel FIGURA I4 Cromatograma tipico desenvolvida por cromatografia planar. = me Os mesmos termos se aplicam a um proccsso cromatografico realizado cm coluna, desde que os componentes permanegam no tubo cromatografico sem sercm cluidos. Contudo, normalmente a cromatografia em coluna procede com fluxo continuo da fase mével, até que todos os componentes tenham saido da coluna ec as suas presengas seyam detectadas pclo detector e indicadas graficamente Alternativamentc, 0 cluato pode ser coletado cm fracgées de volumes idénticos, as suas concentracdes medidas e 0 cromatograma construfdo, considcrando o némero do tubo de cada fracgdo equivalente a uma unidade de distancta. 20Nestes cromatogramas, Figura I-5, a linha de base representa a passagem somente da fase movel através do detector. Quando eluem os componentes sdo registrados os picos, cujos perfis sao proporcionais as concentracécs respectivas. Denomina-se dr a distancia percorrida pelo papel desdc o instante da t injegao da amostra no sistema cromatogréfico até o m4ximo do pico tragado, e dM a distancia desde a injecdo até a eluigdo de um componente que n4o inlerage com a fase estaciondéria.O dm também representa a distancia gasta por uma molécula da fase mével para ir do ponto de injegao alé o detector. aa O _ O LJ + LJ (a) O ~ C) . ms Y) OW Y) Lu 7 ponto de Wp injecdo DISTANCIA ——~— FIGURA I-5S Cromatograma tipico obtido por cromatografia em coluna. o f= =§=6 Para a cromalografia cm coluna é mais comum utilizar ou tempo ou volume, em vez da distancia, pat pe TOILE AT Rt OR A sendo que esta tillima é medida no papcl, cnquanto 0 tempo ou o volume podem ser diretamente rclacionados com o processo ocorrendo na coluna cromatografica. —. Por isto, o (empo dc relengao, o tempo gasto desde 0 ato dei injegao até a safda do componente do sistcma, tr , 6 a varidvel impressa pclos dispositivos cletrdnicos, freqiientemente acoplados a sistemas automatizados de cromatografia. Faltando este dispositivo, o tr € calculado a partir das medidas fcitas no cromalograma: ir = dr /f, onde f é a velocidade do papel no registrador grafico, em unidades de cm/min ou mm/s. O tempo de retencd4o cngloba todo o tempo que 0 componente em questao fica no sistema cromatogréfico, quer na fase mével, quer na estaciondria. Quando as moléculas do soluto ficam na fase mével, elas devem movimentar-se com a mesma velocidade que as moléculas da propria fase mével. Entao, a parte do tempo em que as moléculas do soluto estao na fasc mével ¢ igual ao (empo gasto para as moléculas de fase mével percorrerem a coluna, ty, : (mM = dM /f. 21Sendo assim, a parte do tempo em que as moléculas do soluto ficam retidas na fase estaciondria € calculada pela diferenga: O tp, otempo que o soluto fica retido na fase estaciondria, € também chamado de tempo de retengao ajustado. Similarmentce, 0 volume da fase mével necess4rio para cluir um componente, VR, € calculado a partir do cromatograma: VR = trF = dR F/f, onde F € a vazdo da fase mével em unidadcs de mL/min ou mL/s. De mancira similar € calculado 0 volume requisitado para um componente nado retido sair da coluna: VM = tmMF = dnmF/ f. O Vm, também chamado volume morto, representa o volume da fase mével nos intersticios de uma coluna recheada, ou nos espacos vazios em colunas contendo a fase estaciondria somente recobrindo as paredes. Para evitar possivcis confusdcs resultantes dos diferentes mecanismos de separaGdo, na cromatografia por exclusdo o volume da fase mével necess4rio para cluir um componente nado retido € chamado Vo ; este volume representa a parte intersticial da fase mével nesta modalidade, isto 6, 0 volume da fase mével fora dos poros, enquanto o volume total da fase mével na coluna, Vt, € a soma do volume intersticial, Vo , = e o volume intrasticial, Vj: phon | Vi = Vo + Vi . O volume total contido na coluna em cromatografia por exclusdo, We , inclui também o volume da wv matriz inerte; Vz : Vc = Vo + Wi + Ve. Nas outras modalidadcs de cromatografia, o volume total dentro da coluna €¢: Ve = VM + Vs, onde Vs €0 volume da fase estaciondria. Estas medidas de distancia, tempo e volume sao usadas diretamentc para fins qualitalivos, isto é, para a identificagao das substancias contidas nas amostras, por comparagao dos tempos ou volumes de retencdo ajustados. Estas medidas sao também usadas para calcular os varios valores rclacionados a retencao ¢ a cficiéncia das scparagocs cromatograficas. O fator de retengao para cromatografia planar é definido: Ry = d; / dm : PM. a a eee i 7 : Comparacoes do valor de Rr da amostra com o de um padrao é 0 método qualitativo mais usado na cromatografia planar. Na cromatografia em coluna, a retengao de um componente € determinada pela razdo dos tempos que as suas moléculas ficam retidas na fase estaciondrta ou percorrenda a coluna na fase mével Este termo ° y chamado raz4o de distribuigao das massas, Dm , ou, nos vocabularios vclhos, fator de capacidade, k, é J y definido por: M Dm =————._ = UR / tm. 22Ele € relacionado ao coeficiente de distribuigéo, Kp , pelos volumes das fases: Kp = Cs / Cu = Dm YM / Vs = Dmf ’ onde Cs e Cm representam as concentracées do soluto nas fases estacion4ria e mével, respectivamente, eB €arazao do volume da fase mével, Vo , pclo volume da fase estaciondria, Vs. Na cromatografia por exclusao, 0 fator de capacidade, k’, € definido: VR - Vo Vo A diferenga entre Dm e k’ relaciona-sc ao fato que, na cromatografia por exclusao, o volume requisitado pela passagem de uma substancia nao retida € Vo, o volume da fase mével intersticial, e nao oO volume total desta fase. O coeficiente de distribuigéo de cromatografia por exclus4o, Ko , também utiliza os termos relacionados a esta modalidadez 1 4 i . Ko = C, /Cyy = 2 lean VR - Vo . Vi | Os termos de retencio sao caracteristicos de um componente. Quando sao envolvidos mais de um ! : componente na amostra, também calculam-se termos de separagao. { O fator de separacao, a, € calculado pela razdo entre as respectivas razOes de distribuigao que sao, ‘ ; _. por sua vez, relacionadas aos tempos de retengao ajustados: a= Dm2 /Dmi = UR2 / URI. O fator de separagio sempre trata com dois picos adjacentes. Um outro termo, a retengao relativa, ILp , envolve a razo de tempos de retengao ajustados do componente € de um padrao, respectivamente. "A retencdo relativa é usada para identificagao de substancias e pode ser calculada para quaisquer picos no cromatograma, livre da restrigao de serem adjacentes. Uma outra medida quantitativa de separacdo de dois componentes consecutivos € a resolucao, Rs , usada em cromatografia em coluna e calculada a partir da distancia que separa as mAdximas dos picos divididos pela média das larguras de suas respectivas bases, Wp (Figura 1-6): 2 - Ad YR (dro - dri ) a= AdR os S ~ Wol + Wb2 Wb2 Para a largura de basc € sempre tomada a distancia entre as tangentes tracgadas nos lados do pico. Quando os picos sdo bem adjacentes, a média das suas larguras pode ser substituida pela largura do segundo pico. = a ‘ “ eS A resolucao em cromatografia planar € determinada pcla separacao entre as manchas: ang eo an mel igus ae R, (planar) = 2(dri -dr2 )/(wsi + wsz ) onde Ws €a largura longitudinal da mancha, enquanto o fator de separagao € representado pela razao entre os fatores de retengao: -_ , pee = RG Ro = da Mn A eficiéncia representada por um cromatograma é medida em termos de numero de pratos gerados, teéricos ou efetivos. Um prato teérico pode ser considcrado equivalente a uma etapa de equilfbrio entre as duas fases, andlogo aos pratos teéricos da teoria de destilagdo. Quanto maior o nmero de pratos, mais equilibrios existirao, maior seré a eficiéncia e, portanto, mclhor a separacao. 23FIGURA 1-6 Mcdidas relacionadas a determinagdo de resolugdo. Al Na cromatografia planar, o namero de pratos tcéricos, np , € calculado usando as medidas do Ail cromatograma: ze np = 16 dr? / ws? Portanto, quando as manchas nao sao bem definidas, a eficiéncia da corrida € baixa. Na cromatografia em coluna, o nimero de pratos leéricos, np, € calculado a partir do cromatograma: n = 16d? / wo = 5,545(dR / Wh ’, onde wh €a largura do pico na sua meia altura. Sendo que a eficiéncia € melhor rclacionada com o tempo que o soluto permancce retido na fase estacion4ria, € nao com o (empo total requisitado pela corrida, o nGmero de pratos efetivos, N, pode ser calculado usando o tempo de retengao ajustado: N = 16¢'R? / wo? = 5,545 (UR /wh )? Lembre-se que a medida da largura da base, neste caso, deve também ser em unidades de tempo sendo que o nimero de pratos € um nimero puro, sem unidades. Sibi « od O nimero de pratos obtidos pode ser afetado por varios fatores, incluindo as condigoes de anilise, o tamanho da amostra, 0 tipo de soluto e, principalmente, o comprimento da coluna, fato que torna dificil uma comparac¢ao do numero de pratos entre diferentes colunas. Por esta razao, a avaliagdo comparativa entre colunas é feita usando a medida da altura equivalente a um prato, que corresponde a razdo entre o comprimento da coluna, L, e o nimero de pratos. 24O valor da altura equivalente a um prato tedrico, h, é obtido: h = L/n, enquanto a altura equivalente a um prato efetivo, H, € calculada: H = L/N. Sendo que a finalidade mais importante de qualquer separagao cromatogrdfica € a de resolver os componentes da amostra, devem-se considerar os parametros experimentais que influenciam a resolugao. A Figura I-7 mostra trés cromatogramas, destacando as contribuigécs de cficiéncia e seletividade na resolucao. Assim, m4 cficiéncia e mé4 seletividade rcsultam cm mé resolugao, Figura I-7a, pois bandas largas €pouco separadastendem asobrepor-sc. Quandoaselctividade € boa, pode-se compensar a m4 eficiéncia, Figura I-7b, obtendo boa resolugdo. O ideal é boa resolugéo conquistada com boa eficiéncia e boa scletividade, Figura I-7c. a FIGURA I-7 Cromatogramas ilustrando a rclagdio entre resolucdo, seletividade ¢ eficiéncia. a: m4 resolucdo causada por ma cficiéncia c md scletividade; b: boa resolugdo devido a boa scletividade, porém com mé eficiéncia; c: boa resolugd4o com boa cficiéncia c boa scletividadc. 25A otimizacdo da resolugao est4 relacionada com os parametros experimentais na equacdo geral da resolugao: _ Vn Dm2 a-1 Rs = ————__— 4 Dm2 +1 a que apresenta termos relacionados a eficiéncia, representada pelo namero de pratos teéricos; a distribuigado dentro da coluna, representada pela razdo de distribuicgdo das massas, Dm, € 4 seletividade, representada pelo fator de separagdo, a. Mudangas nestes trés termos geram mudangas na resolucao e, consequentemente, na separacao. A equacao geral de resolugdo pode ser rearranjada, permitindo o cAlculo do nimero de pratos requeridos para uma dcterminada separacao. 2 a | ? Dm2 +] Dm2 2 Nreq = 16Rs a-1l Este nimero € titil na determinagdéo do comprimento da coluna necess4rio para consegulr-se a separacao. Nos Apéndices 1 a 3 séo sumarizados estes e outros termos bdsicos 4 cromatografia com suas respectivas definigdes. 5. REFERENCIAS 5.1. Gerais BRAITHWAITE, A. e SMITH, FJ. Chromatographic Methods, 4* edigao, Chapman and Hall, London, 1985, capitulos 1 e 2. COLLINS, C.H.; DE AQUINO NETO, F.R. e DA SILVA, J.R.P. Quim. Nova, 11, 443 (1988). GROB, R.L., ed. Modem Practice of Gas Chromatography, 2? edicao, John Wiley & Sons, New York, 1985, capitulos 1 e 2. JOHNSON, E.L. e STEVENSON, R. Basic Liquid Chromatography, 24 edigdo, Varian Associates, Palo Alto, 1978, capitulos 1 ¢ 2. McNAIR, H.M.c BONELLI, E.J. Basic Gas Chromatography, 5? cdigdo, Varian Associates, Palo Alto, 1969, capitulos 1 ¢ 2. SNYDER, L.R. e KIRKLAND, J.J. Introduction to Modem Liquid Chromatography, 2? edicdo, John Wilcy & Sons, New York, 1979, capitulos 1 ¢ 2. §.2. Historicas ABEL, E.W.; POLLAND, F.W.; UDEN, P.C. e NICKLESS, G.D. J. Chromatogr., 22,23 (1966). ADAMS, B.A. e HOLMES, E.L. J. Soc. Chem. Ind., 54, 1 (1935). BEYERINCK, M.W. Z. Physik. Chem., 3, 110 (1889). 26CAMPBELL, D.H.; LUESCHER, E.¢e LERMAN, LS. Proc. Natl, Acad. Sci. (U.S.), 37, 575 (1951). COHN, W.E. Science, 109, 377 (1949); J. Am. Chem. Soc., 71,2275 (1949). CONSDEN, R.; GORDON, A.H. e MARTIN, A.J.P. Biochem. J.,38,244 (1944). CREMER, E. c PRIOR, F. Osterr. Chem. Zig., 50, 161 (1949), CUATRACASAS, P.; WILCHEK, M.¢ ANFINSEN, C. Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.), 61, 636 (1968). DAY, D.T. Proc. Am. Phil. Soc., 36, 112 (1897). GOLAY, M.J.E.em DESTY, D.H., ed. Gas Chromatography 1958, Butterworths, London, 1958, p.36. GOUW, T.H.e JENTOFT, R.E .J. Chromatogr., 68, 303 (1972). HALASZ, I. e HORVATH, C.G. Anal. Chem., 36, 1178 ¢ 2226 (1964). HAMILTON, P.B. c ANDREWS, R.A. Anal. Chem., 31, 1504 (1959). HARLEY, J.; NIL., W.c PRETORIUS, V. Nature (London), 181,177 (1958). HESSE, G.; EILBRACHT, H. e REICHENDER, F. Liebigs Ann. Chem., 546, 233 (1941). HORVATH, C.G.; PREISS, B.A. e LIPSKY, S.F. Anal. Chem., 39, 1423 (1967). HOWARD, G.A. e MARTIN, A.J.P. Biochem. J., 46, 532 (1950). HUBER, J.F.K.e HULSMAN, J.A.R.J. Anal. Chim. Acta, 38, 305 (1967). IZMAILOV, M.A. e SCHRAIBER, MSS. Farmatsiya, 3, 1 (1938). JAMES, A.T.e¢ MARTIN, A.J.P. Biochem. J., 50, 679 (1952). JENTOFT, R.c GOUW, T.H. Anal. Chem., 38, 949 (1966). KARR, C. Jr.; CHILDERS, E.E. e WARNER, W.C. Anal. Chem., 35,1290 (1963). KIRCHNER, J.G.; MILLER, J.M.c KELLER, G.J.; Anal. Chem., 23,420 (1951). KIRKLAND, J.J. Anal. Chem., 40, 391 (1968). KIRKLAND, J.J. J. Chromatogr. Sci., 10, 593 (1972). KLESPER, E.; CORWIN, A.H.e TURNER, D.A.J. Org. Chem., 27,700 (1962). KUHN, R.c LEDERER, E. Naturwissenschaften, 19, 306, (1931); Ber. Deutch. Chem. Gesell., 64, 1349 (1931). MARTIN, A.J.P. e SYNGE, R.L.M. Biochem. J., 35, 1358 (1941). McWILLIAMS, T.G. e DEWAR, R.A. Nature (London), 181, 760 (1958). MOORE, J.C. J. Polymer Sci., A2, 835 (1964) MOORE, S.c STEIN, W.H. J. Biol. Chem., 192, 663 (1951). MORHY, L. Ciénc. Cult., 28, 1185 ¢ 1189 (1976). PORATH, J. c FLODIN, P. Nature (London), 183, 1657 (1959). REED, L. Proc. Chem. Soc., 9, 123 (1893). RUNGE, F.F. Ann. Phys. Chem., 31, 65 (1834); 32, 78 (1834). SCHOENBEIN, C.F. Poggendorf’s Ann., 42, 422 (1837). SCOTT, R-P.W. ec KUCERA, P. J. Chromatogr., 125, 251 (1976). SNYDER, L.R. Anal. Chem., 39, 698 (1967). SPACKMAN, D.H.; STEIN, W.H. ce MOORE, S. Anal. Chem., 30,1190 (1958). STAHL, E. Pharmazie, 11, 633 (1956). TSUDA, T. ce NOVOTNY, M. Anal. Chem., 50, 27 (1978). TSWETT, M. Ber. Deutch. Botan. Gesell., 24, 316 c 384 (1906). 2/ ae EBCAPITULO II CROMATOGRAFIA EM PAPEL Gilberto Leite Braga Faculdade de Ciéncias Farmacéuticas de Ribetrao Preto Universidade de Sado Paulo 29(® 1. INTRODUCAO Te TP pee ee Hs A cromatografia em papel/ desenvolvida por CONSDEN, GORDON e MARTIN em 1944, é uma técnica ‘a simples, utiliza utiliza “pequcha quantidade de amostra, tem boa capacidade de resolugao € aplica-se, de” jp preferéncia, na separacao e identificagaéo de compostos polares como antibidticos hidrossoliveis, 4cidos ae : orgdnicos € fons metalicos. Segundo BROWNING e col., classifica-se como cromatografia por partigao — liquido-lfquido e na classificagao dos métodos cromatogrAficos apresentada por COLLINS e col. como qe cromatografia planar liquido-liquido. “> A separagao ou distribuigao dos componcntes de uma mistura, na cromatografia liquido-lfiquido em papcl, rclaciona-se com as diferentes solubilidades rclativas destes componcnies,/na fase mével ¢ fase estacionéria. ' Os componcntcs mcnos soltiveis na fase estacionéria (¢m uma movimentagado mais rapida ao longo do papel, enquanto que os mais soldveis na fase estaciondria scrdo seletivamente retidos, tendo uma movimentagao mais lenta., Este mecanismo de separacgdo pode ser explicado da seguinte maneira: a celulose é constituida por 2.000 ou mais unidiades de glicose anidra ligadas por 4tomos de oxigénio; tum liquido polar como a 4gua tem grande afinidade pelas hidroxilas de cada glicose, formando pontes de hidrogénio, ficando retido e funcionando como fase estacionaria, e os Iiquidos menos polares (solventes organicos) sao repelidos por-esta estrutura c funcionam como fase mével. ON (a _cromatografia em papcl € uma microtécnica muito itil para_a separagao de componentes de uma_ mistura e_realizacdo_da andlise qualitativa dos mesmos,em fungdo dos Rr _(fatores de retengao) e cores apresentadas,JPode- -sc também realizar a andlise quantilativa, utilizando-se o densitémetro, bem como a extracdo dos componentes separados mediante um solvente adcquado, e entdo, utiliza-se um método instrumental para quantificar o componente isolado. A forma mais simples da cromatografia em papcl € a cromatografia ascendente que utiliza uma tira de \papel de comprimento ec largura varidveis, em funcao da cuba cromatografica a ser utilizada. Marca-se com | J4pis o ponto de partida da amostra, a uns 2 cm de uma das bordas do papcl, e marca-se também a linha de chegada da fase mével (ou frente do solventc), geralmente distando 10 cm do ponto de partida. Dependendo da largura do papel, pode-se colocar apenas uma alfquota do padrao ou da amostra, centralizando-se esta aplicagao na linha de partida. No caso da possibilidade de colocar-sc mais de uma alfquota no ponto de partida, deixa-se 2 cm de distancia das bordas laterais e um intervalo entre os pontos de aplicagao de 1,5a 2,0 cm. / A largura da tira do papel, acima da linha de chegada da fase mével, deve ser igual ao diametro interno da cuba, de mancira que 0 papel fique suspenso na vertical, impedindo de deslizar-se para baixo. [O nivel da / fase mével deve ficar abaixo do ponto de partida da substincia; devendo, sempre, haver uma boa vedacao _da cuba cromatogréfica para que nao se perca 0 vapor desta fase (Figura IT-1). om \ > 31Ay, i ; : P| fj 10 cm j / PP 1-AMOSTRA 2-AMOSTRA Tira de papel Circulo de papel P- PADRAO ascendente CF te 5 5] f el on 4 FM dr. 4 ar dm _+ dr, “el | ---J CE ee Oo LC |} ——— Cromatografia descendente Cromatografia ascendente Papel circular Placa de-—” Petri —e FM Crometografia horizontal 22 desenvolvimento 12LC 12 PP 12 Desenvolvimento 29PP 29LC Cromatografia bidimensional FIGURA HI-1 Diferentes tipos de cromatografia em papel de acordo com as técnicas de desenvolvimento. IM: fase mével; PP: ponto de partida; LC: linha de chcgada da fase mével; dri ¢ dr2: dist4ncias percorridas pelas substAncias; dm: distancia de migracdo da fase mével. 32: j j a €Xpressao: . T° ———-p Fase mével: um lfquido ou mistura de liquidos que flucm através do papel, arrastand - Por capilaridade a fase mével comeca ase movimentar em fluxo ascendente, inicialmente rapidamente, diminuindo gradativamente até parar por completo quando a forga ascendente da capilaridade for neutralizada pela acdo da gravidadei Quando a fase mével atingir a linha de chegada) geralmente a 10 cm do ponto de partida, retira-se o papel da cuba cromatogrAfica e seca-se a tira de papel com secador de cabelo com ar quente ou frio até eliminar-se a fase m6vel. No caso de mistura de substancias de componentes coloridos, 4 medida que ocorrer a separacdo, a cor tinica se desdobrar4 em cores distintas em fungao do niimero_ de substancias que a compéem. No caso de mistura de substancias incolores pode-se detectar (revelar) estes componentes por técnicas diversas; A anflise qualitativa de uma substancia realiza-se atrayés de scu. Rr. que.se determina utilizando-se - “~ distancia (cm, mm) percorrida pela substancia { = e a ° distancia (cm, mm) percorrida pcla frente da fase mével ( i to de Na pratica, a distancia percorrida pelo soluto em um tempo determinado, mede-se desde 0 pon aplicacgdo ou ponto de partida da amostra até o_centro.da mancha, € a distancia percorrida pela fase movel, desde o ponto. de. partida até o ponto extremo_atingido por ela, Le, a linha de chegada.da fase moyel (Figura II-1). “OR; €éumaconstante fisica de uma determinada substancia, desde que se observem_as caracteristicas do papel, a qualidade e quantidade da fase mével, a temperatura, 0 volume e a concentragao da substancia aplicada. 4 E aconsclh4vel, quando sc realiza a andlisc qualitativa ¢ quantitaliva de uma substancia ou mistura de substancias, trabalhar com padrio ¢ amostra de forma a mais semclhante possivel c fazer-se a analise de ambos nas nicsmas condicocs, cvitando-se desta mancira, Os crros de an4lise devidos ao papel, fase mével, temperatura, etc. Uma separacao adequada dos componcntes de uma mistura est4 também relacionada com a difusao cm funcéo da concentragao, difusdo lateral, cquilfbrio incompleto, soluto, fase mével ¢ fase estacionaria. A separacado dos componentes de uma mistura pode ser incompleta (superposi¢ao das manchas) ou por causa da movimentagao do soluto de regides de maior concentragdo para regioes de menor concentragao ou por difusao lateral, quando soluto ca fase mével percorrem distancias diferentes (percursos laterais em determinadas regides do papel) ou ainda também por fluxo rapido, nado dando um tempo ideal de contacto do soluto entre a fase mével e a fase estaciondria. Uma sugestao para a resolugao destes problemas € a de que sc procure trabalhar nas condigoes mais proximas possiveis, de qualidade e quantidade, entre padrao c amostra, usando-sc 0 mesmo papel, fase mével, tempcratura, etc., isto €, cromatografando-se, adrao c amostra em condigécs absolutamente idénticas. concomitantemente, p 2. DEFINICOES E TERMOS USADOS NA CROMATOGRAFIA EM PAPEL Cromatografia em papel (CP): método fisico-quimico de separacdo dos componentes de uma mistura, cm funcdo do deslocamento diferencial de solutos, arrastados por uma fase movel, scndo retidos scletivamentc por uma fase estaciondria liquida (4gua), na cromatografia com fase normal. 9 . . . 4 \" —Y Suporte: papel sobre o qual fica retida a fase estacionaria, agua. Qo os solutos. 33a . a . | | Sy —p Revelador ou Agente cromogénico: .agente fisico (U.V., por exemplo) ou qu{mico (por ex., vapores { de iodo) que tornam visiveis as substancias separadas pela cromatografia em papel. ¢ Le —P Resolugao: distancia minima em que se encontram duas manchas sendo ainda possivel distingui-las individualmente. . Desenvolvimento: € 0 movimento: diferencial dos componentes de uma amostra, ao serem deslocados pela fase mével. Em fungdo de sua diregao podemos ter: ascendente, de baixo para cima; descendente, de cima para baixo; horizontal, do centro para a periferia conforme um circulo imaginario tragado no plano \ horizontal. | Aplicagao: colocagao da solucdo da amostra (mistura das substancias) no ponto de partida sobre o papel cromatografico. Frente da fase movel: linha de chegada da fase mével, visivel ainda quando se retira o papel da cuba 1 4 cromatografica. ‘ Distancia percorrida: distancia percorrida pela fase mével, desde o ponto de partida até a linha de chegada (geralmente 10 cm) ou a do componente, no mesmo tempo. Re: 0 quociente entre as distancias percorridas simultaneamente desde 0 ponto de partida, até 0 centro de maior concentracao da mancha do soluto e até a frente da fase mével. Camara ou Cuba cromatografica: recipicnte de vidro com tampa [echada hermcticamente, nao deixando escapar vapores da fase m6vel e onde se coloca o papel de cromatografia. Cromatograma: papel com as substancias separadas. Saturagao da cuba: distribuigao: uniforme no interior da cuba da fase vapor da fase mével apés alcangado o equilibrio (para obter-se a saturagao deve-se colocar papéis de filtro, embebidos na fase mével, aderidos as parcdes laterais internas das cubas). 3. CONSIDERACOES SOBRE A CROMATOGRAFIA EM PAPEL 2 ~~ é Empregam-se quantidades de amostras da ordem de microgramas a miligramas. A resolugao depende da concentragao ce didmctro da mancha ap aplicada. A anilisc é rapida, desde minutos, 5, OU demorada, até horas. E facil eluir as substancias do papel. Substancias hidréfilas so separadas com facilidade, as hidréfobas requerem (ralamento especial do papel. As As fases méveis devem estar saturadas com agua. Usam-se cubas me cromatograficas perfeilamcnte vedadas para ara manter- -s¢ o vapor do sistema solvente. O desenvolvimento pode ser asccndente, descendenie, circular ou horizontal. Tem suporte flexivel, muito pratica no prceparo do Suporte, é s6 cortar o papel de cromatografia, 0 Ry € reprodutivel para caracterizagao; distancias ole rigoroso das condicées, ¢”. — ee & a Substancias corrosivas nao servem como agentes cromogénicos e lcm-se e condigdes, limitadas para revelar. elar. ee — eee oo _——— —————— Existc um ntiimcro limitado de suportes: papel ¢ scus dcrivados; inadcquada para a sclegdo da fase move] ve para a cromatografia cm coluna; 6lima para acompanhar 0 desenvolvimento de uma técnica d de produtos e pode scr quantitativa. A CP tem sensibilidade regular, porque ha difusao particularmente quando os Ry sao altos. € s¢paracao da amostra, 34 neeatografia em papel; As explicagées anteriores tratam principalmente dos aspectos elementares dacrom plicagoes relatam-se, a seguir, mais explicagoes sobre ateoriae a pratica desta técnica, assim como, sobre as a € as varidveis (papel, fase mével e temperatura). 3.1. Papel O suporte na cromatografia em papel é uma tira retangular ou uma folha circular de papel que funciona como uma camada fina de celulose. Deve-se observar que o papel cromatografico € uma vari importante e, dependendo da amostra a ser analisada, empregar (testar) os papéis das marcas Whatman (Tabela II-1), S & S (Schleicher e Schull) e Macherey-Nagel. 4vel muito Para usos especiais € preferivel modificar-se 0 papel; os mais utilizados sao: a. Papel acetilado - itil para separar substancias hidrOfilas. b. Papcl impregnado - emprcga-se na separagao de substancias modcradamente hidréfobas ou hidr6filas. O papel € umedecido ou com silicona, ou com parafina, ou com dimetilformamida ou aminas de alto peso molecular. c. Papel carregado - dispersao de resinas poliestirénicas, trocadoras de ions, nas fibras de celulose, permitindo a separagao de substancias organicas c inorganicas. d. Papel de fibra de vidro - as fibras de cclulose sao substituidas por fibras de vidro (Whatman Gf 81, 82 c 83), usa-se para condigdes extremas de temperatura c de acidez, ¢ devem ser impregnados com suspens6cs aquosas de silica gel ou alumina. c. Papel tratado - para substancias anf6tcras ou com muitas hidroxilas. a a. Tabela IT-1 ° Principais tipos de papéis Whatman utilizados em cromatografia Espessura Distancia aproximada (mm) (mm) percorrida pela Agua apos 30 minutos em CP ascendentle I TCI 00 1 Mais citado c o mais ulilizado dos papécis 0,16 130 2 Vclocidade de fluxo um pouco menor que o anterior 3 Papel espesso com superficic rugosa quc se usa para grande quantidade de amostra 3MM_ Papcl espesso que sc usa também para grande quanti- dade de amostra, fuxo mais Icnto que o anterior 4 Papel com velocidade de fluxo mais rdpida que os anteriores 540 ‘Papel previamente lavado com Acido cloridrico diluido para climi- nar cations c Anions que possam - interferir em determinadas scparagocs. , Superficie muito lisa 0,10 90 N° Observagoes 0,18 120 0,38 130 0,33 120 0,20 140 353.2. Fase movel A fase mével na cromatografia em papel € a vari4vel que possui maior cfeito nas scparagoes dos componentes de uma mistura. Considerando um par de liquidos, o menos polar funciona como fase mével € oO mais polar, como fase estacionéria (cromatografia com fase normal). Para uma separagao particular dos componentes de uma mistura, tem que se levar em consideragao a natureza quimica devem ser separadas, assim como, a viscosidadc e a polaridade da fase movel (Tabela II-2). das substancias que a Algumas fases méveis ordenadas em fungao de suas polaridades 0 ____ Solubilidade da dgua Constante dielétrica Viscosidade eto marry) Pn 8 TE) Eter de petréleo (30-60°C) " imiscivel 1,84 0.3 Ilexano imiscivel 1,88 0,32 Benzeno 0,08 2,29 ’ 0,65 Eter dietilico 7,50 4,34 0,23 Cloroférmio 0,82 4,80 057 Acctato de etila 8,60 6,02 0,45 Dicloroetano 0,60 10,40 0,79 Butanol-2 12,50 17,80 4,21 Acetona miscf{vel 21,50 ),32. Etanol miscivel 24,60 1,20 Metanol miscivel 33,60 0,09 Agua niiscivel 80,40 1,00 SSNS a —a Acidos organicos séo razoavelmente soluveis em dgua. Acidos ¢ bases inorgdnicos sao allamente soluvecis cm agua. 3.3. Efeitos da temperatura ~ A temperatura na cromatografia cm papel deve ser controlada porque, em fungao desta varidvel, pode-se aumentar a capacidade de resolugao da técnica. Teoricamente, tem-se um tempo ideal de contacto entre 0 soluto ¢ as fascs cslacionaria ¢ mével para que Ocorra uma parligdo mais Completa possivel em decorréncia de uma movimentagao ideal da fase mével, através do papel, relacionada com a ltemperatura da expcriéncia. A temperatura idcal vai depender da amostra a scr analisada, assim como, do papcl ¢ da fase mével que scrao usados. A tempcralura acima daqucla do ambicnte melhora o tempo de andlisc, mas pode prejudicar a rcsolugdo da mesma. = Temperatura abaixo da do ambiente pode melhorar a resolucdo, mas prejudica o tempo de anilise. Pode-se trabalhar na temperatura ambiente com um tempo e resolucao de analise idcais para casos particularcs. Em laborat6rios bioquimicos, com 0 emprego de estufas de cultivo a 36 eS . aye 2 wae Mm, “at sacha aig37°C pode-se trabalhar com temperaturas mais elevadas que a ambiente e de uma forma controlada. E muito importante manter-se uma temperatura para conscguir-se reprodutibilidade do Ry, porque este varia com a (empcratura. Existem laborat6rios onde se realiza a cromatografia em papel, em locais com temperatura controlada, constantc, ou com variagoes de fracodes de graus. Deve-sc observar que o papcl, a fase mével e a temperatura sdo varidveis que interferem na resolucao da andlise cromatogrdfica em papel, assim como na reprodutibilidade do Rf ; mas isto tudo pode ser controlado quando sc trabalha com um padrao interno ou quando se prepara uma solucao padrao quali e quantilativamente o mais semclhante possivel da amostra, c realiza-se a andlise do padrao e da amostra nas mesmas condigoécs do papcl, fasc moével, temperatura, ctc. a 4. CROMATOGRAFIA EM PAPEL COM FASE NORMAL E COM FASE REVERSA ~ | 4.1. Cromatografia em papel com fase normal O papel é saturado ou tratado coma fase estaciondria polar. O desenvolvimento cromatografico € com uma fase mével rclativamente apolar. 4.1.1. Fase cstacionaria aquosa © papel é saturado com vapor de agua ou com vapor de 4guac outro solvente no interior de uma cuba cromatografica, hermeticamente fechada, antes de iniciar-se © descnvolvimento cromatografico. @ 4.1.2. Fase estacionaria nao aquosa O papel é tratado (embebido) em solugao de acetonac dimetilformamida, por 10a 15 minutos, e depois dceixa-se secar. As suas propricdades sao sumarizadas na Tabela I-3. I Tratamentos do papel Papel tratado com solugdo de acetona ¢ Papel tratado com parafina, dleo ou dimetilformamida (fase normal) silicone, dissolvidos em solvente orgdnico (fase reversa) lfase estaciondria Fase mével apolar ou de baixa polaridade polaridade média ou alta Apos desenvolvimento — oo no ponto de partida substancias hidrdfilas subst4ncias hidréfobas subst4ncias hidrdéfobas subst4ncias hidrdfilas na linha de chegada a 374,2. Cromatografia em papel com fase reversa O papcl é tratado com substancias hidr6fobas (parafina liquida, 6lco, silicona) dissolvidas em solventes orginicos como éter de pctrélco, hexano e benzeno . Emprega-se, como fase mével, uma fase polar (isto é, 0 inverso do normal). Nesta técnica, separam-se solutos hidréfobos. Segundo BARNARD e CHAYEN, pode-se preparar papéis com fase reversa muito facilmente: papéis Whatman n® 3 sido empregnados com solucdo de parafina liquida (ou de vaselina, ou de silicona etc.) em éter, na maioria dos casos, solugoes a 5 ou a 10 por cento. Apés a imerséo por 5 minutos, Icvanta-se o papel para evaporar o €ter. As suas propricdades encontram-sc na Tabela [-3. x 5. TECNICA DA CROMATOGRAFIA EM PAPEL ) 5.1. A amostra A amostra a ser analisada (dc 1 a 100 mg) deve estar dissolvida de preferéncia cm um solvente volatl, emprcgando o mcnor volume possivel, sendo recomendados: ‘éter elilico, cloroférmio, acctato de etila, acctona, ctanol, ctc. A quantidade de amostra aplicada depende da técnica utilizada, mas, quanto menor a quantidade, maior a capacidade de resolugdo. O volume da solugao da amostra a ser empregado deve dar uma mancha no papcl de cerca de 0,5 cm de didémetro maximo. 5.2. Aplicacao da amostra O volume de amostra a scr aplicado vai depender da sensibilidade da reagao cromogénica empregada na sua revelacdo. Aconsclha-se trabalhar da scguinte mancira: preparam-sc solugdes padrocs quali e quantilativamentc semelhantes as das amostras a screm analisadas; aplicam-se no papel de cromatografia; descnvolve-se o cromatograma; revela-sc pelo agente cromogénico c cntao verifica-se qual a diluigdo minima dos padrocs que deu sensibilidade a reagao cromogénica (mancha nitida que dé seguranga de anilise). Exemplo: Padrao das substancias a c b Substancia um microlitro de cada solucaéo (ppm) Resultado: substancia a foi sensivel 4 reagdo cromogénica a partir de 1 Lda solugdo de 1 ppm; substancia 5, foi sensivel a rcagao Cromogénica a partir de 1 «Lda solugdo de 2 ppm. 38A seguir, procede-se com as amostras da seguinte mancira: Excmplo: amostras c e d. Amostra . Cc lain . os se 8 @ ae Volumes aplicados ( 4«L) 20 10 5S 2 Aplica-se 1 «L por vez, secando-se com ar qucnte ou {rio para mantcr-se 0 diametro da mancha aplicada em torno de 0,5 cm. Apés toda aplicagao ¢ desenvolvimento do cromatograma, revclam-se as manchas com 0 agente revelador. Resultado: No caso daamostra c 0 volume idcal para andlisc é de 24¢L ¢ no da amostra d, de 5 aL. A aplicacdo das solugdes padrées e das amostras € realizada, preferencialmente, através de microsscringas ou, altcrnativamente, por mcio ou de micropipetas ou de tubos capilares adequadamente preparados para esse fim. 6. METODOS DE DETECTAR AS SUBSTANCIAS SEPARADAS . f, . . . Quando a fase mével atinge a linha de chegada, retira-sc 0 papel da cuba cromatografica ¢ seca-s¢ com o auxilio de ar frio ou quentc de um sccador de cabclos, Normalmente, as substdncias scparadas sdo incolorcs ou invisiveis a luz ordindria, necessitando de artificios externos para sercm observadas. Emprcgam-se métodos quimicos, fisicos, biolégicos ou enzimaticos para detectar (revelar ¢ localizar) as substancias separadas. / 6.1. Métodos quimicos . A solugao reveladora ¢€ borrifada sobre o papcl usado na cromatografia, sendo cada amostra uma mistura le substancias como fons inorganicos, carboidratos, inscticidas, ctc. Existem na literatura fontes que = informam qual deve scr a solugdo reveladora (agente cromogénico) a scr empregada, qual a técnica de preparo c modo dc conscrvacdo, qual a scnsibilidade c quais as substancias detectadas por certos reveladores. Para exemplificar, vamos considerar a detecgao de fons chumbo: usando a ditizona (difeniltiocarbazona) a 0,05% cm tetraclorcto de carbono (solugao I) scguida de borrifagao com hidréxido de amonia a 25% (solugao II), aparecer4 uma mancha de coloracao intensa ¢ caracteristica porque houve a formagao, no local do papel onde sc encontrava 0 fon, do quelato dilizonato de chumbo, complexo formado somente apos as borrifagocs seguidas das solugocs I ¢ II sobre o papel. 39Muitas substancias orgdnicas absorvem radiagoes de luz ultravioleta ¢ tornam-se fluorescentes. () papel, quando tratado com solugao de fluoresceina, freqiicntemente destaca as manchas tornando-as amarelo-esverdeadas, brancas ou azuis. Entretanto, as substancias que absorvem a luz UV aparecem como | manchas escuras sobre um fundo fluorescente azulado, normalmente apresentado pclo papelf Podem ser usadas lampadas UV de onda curta (240-260 nm) e onda larga (360 nm). E aconsclh4vel trabalhar-se em ambiente com luminosidade apropriada para melhor observagao. 6.3.Métodos biolégicos e enzimaticos ‘, Os métodos-para localizar antibidticos por bioautografia basciam-se na inibigdo do crescimento de cerlos microorganismos. As substancias biologicamente inalivas, os produtos de sua decomposigao ¢ as a impurezas nao altcram a proliferagao de tais microorganismos. | Qs métodos enzimaticos podem servir ou para localizar enzimas ou os seus substratos. Assim, para localizar amilases, por exemplo, desenvolve-se 0 cromatogramafborrifa-sc 0 papel com solugao de amido, incuba-se umas 24 horas A temperatura controlada(¢_ depois borrifa-se com solugao de iodo. As amilases aprescntam-sc como manchas brancas em fundo azul, o qual reflcte a cor do complexo iodo-amido enquanto as manchas brancas indicam a posicdo das enzimas que dcegradarem 0 amido. 7. ANALISE QUALITATIVA Na cromatografia cm papel, a andlisc qualitativa € realizada normalmentc cm fungao da cor c do Rr apresentados pela substancia. E aconselhdvel descnvolver-se um cromatograma tendo a amostra ¢ as substancias (padrées) provaveis de ‘constituirem esta amostra colocadas lado a lado, pois, assim alcanga-se a situacdo que visa dar igualdade de condig6cs a ambos, padrao c desconhccido. As vezes € necessario mais de um desenvolvimento do solvente para alingir-se o idcal, isto €, que os componentes da amostra € Os padrées, colocados ao lado, aprescntem o maximo possivel de igualdadce, quali e quantitalivamente. No caso de substancia desconhccida, esta, depois de perfeitamente separada, deve ser eluida do papel e submetida a uma técnica instrumental adequada, tal como a espectrometria de massa, o infra-vermelho, a ultravioleta, a absorcao at6mica, a fluorescéncia por raios-X, etc., para sua identificacao. 3. ANALISE QUANTITATIVA | _ Para rcalizar-sc a andlisc quantitaliva em cromatlografia cm papcl, tem-se quc, primciramente, fazer a andlise qualitaliva c, cm scguida, sclecionar-sc um sistema de fase mével que separe perfeitamente as substancias a serem analisadas c que produza manchas regularcs, além de trabalhar-se com padrées quali e 404 a3 a ee et age tkeracy . ae : quantitativamente semelhantes Aquelas substancias a serem determinadas na amostra. Pode-se fazer a determinagao quantitaliva da substancia que foi separada diretamente no papel ou depois de extraida do mesmo. 8.1. Diretamente sobre o papel 8.1.1. Comparagao da intensidade das cores reveladas Trabalha-se com uma série de pontos de partida de diluicgdes variaveis tanto do padrao como da amostra e, depois do cromatograma pronto, por comparacdo entre as intensidades das cores e€ dos tamanhos das manchas do padrao e da amostra que mais se aproximam, pode-se ter um resultado semiquantitalivo, com um erro aproximado de mais ou menos 20 % podendo servir a determinadas anilises. 8.1.2. Arca da mancha Depois do cromatograma pronto, corla-se a Area correspondente a mancha e pesa-se a mesma. Constroem-se graficos de area em fungao dos logaritmos das quantidades da substancia presente na mancha. E importante que o tamanho da gota aplicada scja sempre o mesmo. Usa-se uma séric¢ de pontos de partida da solucdo padrdo, com pouca diferenga entre a concentracdo minima c a maxima; desta mancira, pode-se dar o resultado da andlise cm fungdo do grafico tragado. Aconsclha-se, para uma maior exatidao, trabalhar-se com solugaéo padrao quali ¢ quantilativamente scmelhante 4 amostra ¢ realizar-se a andlisc nas mesmas condicées de papcl, solvente, cuba, temperatura, etc. 8.1.3. Analise densitométrica Determina-se, diretamente sobre o papel, com um densit6metro, a intensidade da cor apresentada pela substancia padrao e pela amostra, sendo o densil6metro constitufdo de uma fonte luminosa, filtro, colimador, fotocélula ec microamperimetro. Existem aparclhos com rcgistrador potenciométrico onde aparecem picos das substancias, cujas 4reas sao proporcionais a conceatragao das substancias. Mesmo com o densitdmetro, aconsclha-sc trabalhar com padrao c amostra nas mesmias condi¢ocs, para obter-sc uma melhor exatidao. — 8.2. Extracao da substancia Para a extracdo da substancia do papel podem ser ulilizadas duas técnicas: a. Aplica-sc asubstancia cm andlise no papel, descnvolve-se 0 cromatograma, emprega-se um agente cromogénico para formagao do dcrivado colorido, ¢ depois de pronto, extrai-se o derivado colorido do papel ¢ faz-se a lcitura em espectrofol6metro; o resultado é dado em fungao da comparagio deste com aqucles encontrados cm uma curva de calibracdo desta mesma substancia, previamente determinada neslas mesmas condicécs. 41b. As substincias, depois de separadas, sao extraidas do papcl c depois quantificadas por métodos analiticos (espectrofotometria, microtitulagao, microgravimctria, etc.). Para a extragao, delimita-se a regiao do papel onde deve estar a substanciaa scr extrafda, desenvolvendo-se padrocs nas laterais do papel e revelando-os, tendo-se 0 cuidado de proteger as substancias que scrao extraidas e, posteriormente, analisadas (Figura []-2). Papel Tira de pépel ©] —e substincia Oda Solvente—e> |_| amostra sendo extraida da tira de papel Ponto de pep RPadroes Padroes Amostra Solvente aradas. A, Bc C: substfncias padroes; 1 ¢ 3 repides do papel FIGURA II-2 EEsquema de extragado das substancias depois de sep a como revelador, 4,5 ¢ @ tiras de papel que contem borrifadas com o revelador; 2: regido do papel nao borrifad as substAncias A, B ¢ C da amostra. 9, APLICACOES DA CP Esta técnica cromatografica uliliza-sc, de preferéncia, na separagao Cc identificagao de compostos | r 4 1 } — “874° - ’ . . ae “ve polares, substancias hidr6filas, como antibidticos hidrossoldveis, Acidos organicos c fons mctalicos, etc., sendo | mal i . . ; ais pralica que a cromatografia em camada delgada e de facil reprodugao de Rf para a caracteri7agao.. E muito Gtil para ; - Ae, = ys para acompanhar a scqiiéncia de uma rcagao quimica ou de acompanhamento de scparacao de com ‘ oy: aye Lo. paragé poncnics de uma amostra c pode ser utilizada para a anilise quanuitativa. Devemos lembrar que a crom: aft: cha ar que a cromatografia em camada delgada (cclulose microcristalina "papel moido ) ¢ mais clicientc quc a cromatogralia ¢ . - que a cromatografia cm papel, mas para scparagocs de componentes de amostras nao mullo complexas, esta técnica € muito dtil e de facil aplicacio 4210. REFERENCIAS , - BARNARD, J.A. c CHAYEN, R. Métodos Moderos de Analisis Quimico, Ediciones Urmo, Espartcro, Bilbao, 1965. ~ -~ - BROWNING, D.R. Cromatografia, Toray-Masson, S.A., Barcelona, 1971. - COLLINS, C.H.; MANFREDI, J.F.; VALENTE, A.L.P.; MURTA, A.L.M.c McNAIR., H.M. Quin. Nova, 6, 46 (1983). - CONSDEN, R.; GORDON, A.H.c MARTIN, A.J.P. Biochem. J, 38,224 (1944). - EWING, G.W. Meétodos Instrumentais de Andlise Quimica, vol. 2, Edgard Blucher Ltda, Sao Paulo, 1971. ~ HAIS, Il; LEDERER, M.M.; e MACEK, K. /dentification of Substances by Paper and Thin-Layer Chromatography, Elsevier, New York, 1970. - MANDSEN, B.C. J. Chem. Educ., 50, 852 (1973). — RANDERATH, K.-Thin-Layer Chromatography, 22 edigdo, Academic Press, New York, 19608. * — Reativos de Coloracién para Cromatografia en Capa Fina y en Papel, E. Merck, Darmstadt, 1972. —~ SHERLLARD, E.J. Quantitative Paper and Thin-Layer Chromatography, Academic Press, New York, 1968. - STAHL, E. Thin-Layer Chromatography, Academic Press, New York, 1965. — - “ eho 4 ' ae 43CAPITULO II CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA Jodo Luts Callegan Lopes Faculdade de Ciéncias Farmacéuticas de Ribeirado Preto Universidade de SGo Paulo i Rie 451. INTRODUCAO A cromatografia cm camada delgada (CCD) consiste na scparacao dos componentes de uma mistura através da migragao diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superficie plana. Esta técnica teve inicio com os trabalhos de IZMAILOV ¢ SHRAIBER em 1938, sendo que somente a partir da década de 60 passou a scr largamente utilizada, de tal forma que hoje é praticamente indispensdyel em ~ qualquer laboratério que cnvolva analise de substdncias organicas ¢ organomctalicas. O grande descnvolvimento desta técnica é conseqiiéncia natural das mUlliplas vantagens que ela — ye ofcrece, tais como: facil comprcensao ¢ exccu a0, scparagocs em breve cspaco de tempo, versatilidade, grande reprodutibilidade ¢ baixo custo, Pode ser de aplicacao analitica ou preparativa,-cuja escala esta na dependéncia da espessura da camada de adsorvente e da amostraem anilise) O processo de scparacao esta fundamentado, principalmente, no fen6meno da adsorgao. Entretanto, usando fases estaciondrias tratadas pode ocorrer_ também _por particdo ou troca i4nica, o que permite seu cmprcgo. tanto. na scparagao de substancias hidrof6bicas como hidrdfilas. 2.OS ADSORVENTES E disponivel no mercado uma grande variedade de_tipos de adsorventes pata fins cromatograficas, podendo-se destacar fornecedores como "Merck", "Carlo Erba", "Woclm’, "Fluka", "Macherey-Nagel” e "Baker", entre outros. Entre os adsorventes mais utilizados.em CCD estado a silica, alumina, celulose_e pohiamida. 2.1. Silica (SiO2) | . Acido silicio amorfo, altamente poroso, é scguramente um dos adsorventcs mais ulilizados em pela presenga cromatografia por adsorgao. Apresenta cardlcr fracamente dcido, que pode ser aumentado u reagoes de impurezas Acidas, podendo ocorrer como conscqiiéncia fendmenos de quimiosorgao de bases 0 474cido-catalizadas das amostras. Existem varios tipos de silica disponfvcis no comércio, de acordo com cerlas caracteristicas adicionais de cada produto. Em vista disto, so cncontradas nos rétulos dos frascos informagées sobre estas caracterfsticas. Como excmplo citamos a simbologia ulilizada pelos produtos "Merck": G indica a presenga de aglutinantes (em geral com 10-15% de gesso, ou 1-3% de amido ou talco) com 0 objetivo de reter o adsorvente sobre a placa de vidro; H indica que nao contém aglutinante; P é para uso cm camada preparaliva; F indica a presenga de substancias fluorescentes, sendo neste caso indicado o comprimento de onda onde ocorre a excitagdo da substancia incorporada, R indica adsorvente extra puro, sem aditivos. Em geral, f silica é empregada na separagio de compostos lipofilicos como aldeidos, cetonas, fendis, Acidos graxos, aminodcidos, alcaléides, terpcndides c-esterdides, usando_o mecanismo_de adsorgao. Entretanto, quando ndo esta ativada ou for desativada com vapor d’dgua, retém agua suficiente para que as scparagées ocorram por um mecanismo semelhante a.cromatografia em papcel./ Na preparacio de placas, mistura-se cerca de 30 g de silica com 60-70 mL de agua destilada. Esta quantidade de suspensao é suficicnte para preparar cinco placas de 20 x 20 cm, com uma espessura da camada ao redor de 0,3 mm. 2.2. Alumina (Al2 O3 ) A alumina 6é, depois da silica, o adsorvente mais ulilizado. Tem caracteristicas alcalinas, embora possa também ser preparada para aprescntar caracterfsticas ncutra ou dcida. Deve ser sempre considcrada a possibilidade da alumina catalizar diversas reagOcs organicas, como as condensagodes de compostos carbonilicos. Além daqucla simbologia mencionada para a silica, a alumina de produgdao da Merck pode também apresentar outras duas indicagoes do processo de fabricagao: Tipo E, que apresenta superficie especifica de cerca de 120-180 m’/g, elaborada a temperaturas baixas; c Tipo T, com superficie especifica de cerca de 60-90 m?/g, elaborada a temperaturas clevadas. BROCKMAN e SCHADDER classificaram a alumina em cinco tipos (Ia V) segundo sua capacidade de retengao de corantes azéicos. Este procedimento esta descrito no Capitulo IV. - A alumina é geralmente empregada na scparacdo de compostos lipofilicos e,_pelo_fato de. poder_ser preparada com caractcristicas 4cida, ncutra ou alcalina, 6 bastante til na separacao de substancias que aprescntam variagocs destas caractcristicas. Ela separa bem hidrocarbonetos pgliciclicos, alcaléides, aminas e vilaminas liposoliveis. Para se preparar cinco placas de 20 x 20 cmc espessura de 0,3 mm, recomenda-se a ulilizacdo de uma suspensao de 30 g de alumina em 40 mL de 4gua destilada. 2.3. Terra Diatomacea E um adsorvente ncutro amplamente emprcegado como Suporte nas separagOes por particdo. Quando comparado com a silica e alumina € menos adsoryente ¢. com menor poder de resolugdo. Algumas vezes é adicionado a silica para diminuir seu poder adsorvente. Pode ser encontrado comercialmente com ou sem aglutinante. Na prepara¢gao de placas utiliza-se as mesmas proporgoes citadas para a silica, ou seja, uma parte de adsorvente para duas partes de 4gua destilada. 482.4. Celulose Tem sido empregada como suporte da fase estaciondria liquidaem cromatografia por partigao ou troca idnica. Assim temos a cclulose impregnada com polictilenoimina (PEI - cclulose), empregada na separacgao de nucleotidcos ¢ nucleosideos; a carboximetil-cclulosc (CM- celulosc) para a separagao de proteinas; a dictilaminoetil-celulose (DEAE-cclulose) para a scparacao de proteinas e 4cidos nucléicos, e uma mistura de celulose alcalina, trictanolamina e epicloridrina (ECTEOLA-cclulose) para separagao de proteinas € Acidos nucléicos. A .celulose microcristalina pode ser empregada cm todos os tipos de separacoes realizaveis por cromatografia em papel (Capitulo II), uma vez que exerce as mesmas fungoes, com as vantagens de.ser de desenvolvimento mais rapido ¢ de_ter. aumentada.a sensibilidade do método, Neste caso tem sido cmpregada na separagdo de Acidos carboxilicos, aminodcidos, carboidratos, cations inorganicos e fosfatos. Para a preparacao de cinco placas de 20 x 20 cm, mistura-se 25 g de celulose com %) mL de agua destilada, agitando-se em agitador por dois minutos antes de colocar na placa de vidro. 2.5. Poliamida A utilizagdo de poliamidas vem crescendo nos tltimos anos. Pode ser de dois tipos, de acordo com sua prcparacao. A poliamida 11 € preparada a partir do Acido poliaminoundccandéico (Nylon 11), enquanto que a poliamida 6 vem da aminopolicaprolactama (Perlon). Em geral, as separagocs ocorrem através da compcticio, pela formagao de ligagées tipo ponte de hidrogénio com o adsorvente, entre soluto c as fascs. Tem sido empregada, com maior freqiiéncia, na separagio de [endis ¢ de acidos carboxilicos, Sua maior utilizacdo € comprometida pela dificuldade.em_sc.preparar.as cramatoplacas no laboratorio, em fungao de sua_baixa aderéncia ao vidro.. ea Para a preparacio das placas, recomenda-se fazer a suspensao de 15 g de p6 cm 60 mL de metanol, previamente purificado. Estas quantidades sao suficientes para cinco placas de 20 x 20 cm e 0,3 mm de espessura. 2.6. Outros \\ { Na literatura sao encontradas referéncias a outros adsorventes organicos c inorganicos, porém de ulilizagdo mais restrila. Sao Os casos da ur¢ia c polictileno para scparar acidos graxos; silicato de calcio ou de magnésio para separar acacares; gel de dextrana para scparar aminadcidos ¢ protcinas.c carvay_alivado para scparar {cndis} De um modo geral, os adsorventes utilizados para scparagécs por cromatografia em coluna podem também ser aplicados para camada delgada, evidentemente com diminuigao do tamanho do granulo e muitas vezes com a incorporagao de aglutinantc. Tem sido também muito utilizado o expediente de incorporar rcagentes aos adsorventcs, visando a scparacio de isomcros ou estruturas muito relacionadas. Uma das misturas mais ulilizadas é a silica com 3-30% de nilrato de prata (bons resultados sao obtidos em média com 5-10%) para scparar compostos insaturados, devido a formagio de complexos entre o ion Ag” com duplas ligagdcs. A incorporagao do nitrato de prata pode ser {cita através da substituigao da agua por solugdo aquosa do sal na preparagéo da suspensio ou através da pulverizagao das placas, ja sccas, com ay