‘+ Hannah, bebé de 6 meses de idade © Origem judia asquenaze +» Doenca de Tay-Sachs Testaros imdos? « Tiiagem paraa doenga de Tay sachs? GENETICACLINICA 281 gem, Para a freqtiéncia de portadores (heterozigotos) de | em cada 23, é necesséria tuma sensibilidade de 99,8% para testar 0 cOnjuge de um portador conhecido (de modo que o risco de um falso-negativo seja de 1 em cada 500}. Os niimeros da Tabela 11.1 suugerem que a obtengio de uma sensibilidade de 99.8% deve ser um desafio. ‘Tabela 11.1 DistribuigSe das mutagées do gene CFTR em 1.754 cromossomos de pessoas com fibrose cistica, analisados em Manchester, Reino Unido Numero Porcentagemde Porcentagem Muracio Exon encontrado _—_fibrosecistica__cumulativa F508de! 10 1420 810 GISSTASp 1 6 35 2%, pciisaax " 20 H 856 62417 Intron ” wo 866 1898+1G>A, Intron 12 16 os 875 pArg5s3x n 13 07 883 pArgl V7His 4 13 o7 290 pArgséoTre " u 08 896 327226006 lnwonVa 10 16 902 .3659deIC 9 9 05 907 pAsn1303Lis 2 8 os 9 CITITI@A Intron 10 7 04 76 ca7iiderr 14a 7 04 920 (Ourras detectadas 4 65 985 Desconhecidas 2 5 Total 1754 100,0, Poser se bia uma sensbiidade de 90 de 95% engi atestagem de Dados gentimente cecidos pelo Or. Matin Schwarz, St. Mars Hospital, Manchester. ima testagem das rove m.tagoes mais comuns.a sensibiidade Entre os judeus asquenazes, a freqéncia de portadores theterozigotos) para a doenca de Tay-Sachs € de 1 em cada 30, por isso foram estabelecidos os programas de triagem de portadores, nos EUA e em muitos outros paises, a partir do inicio da década de 1970. A Tabela 1.2 mostra algumas estatisticas. Nos paises cuja comunidade asquenaze aceitou entusiasticamente essa triagem, a maioria dos bebés afetados agora é nascida de casais nao-judeus. A triagem em questo usa um teste bioquimico que mede a capacidade da Brhexosaminidase A, no soro, para hidrolisar um substrato artificial denominado MUG282 ANDREW READ & DIAN DONNA ‘Tabela 11.2 _Triagem de portadores para Tay-Sachs entre os judeus asquenazes, 1971-1998 Casais portador- Local Numero testado Portadores portador Estados Unidos 925876 35372 795 Isae 302395 nan 360 Canads 65813 3301 6 Afica do Sul 1582 82 17705 17 3 027 20 México 655 26 ° Argentina a 5 ° Australia 354 4 Total 1.332.087 Dados de Gravel RA. ta (20 (uma N-acetiigicosamina derivada da 4-metil umbreliferona). A testagem do DNA nao & usada para a triagem populacional, porque nem todos os portadores tém uma das mu- tages comuns entre os asquenazes (veja Tabela 10.2, no Capitulo 10). E necessario um teste diagndstico definitivo, apés um resultado positivo na triagem. Aproximadamente 2% dos judeus © 35% dos individuos nao-judeus identificados como portadores pelo teste de triagem carregam, de fato, o chamado alelo de pseudodecigncia, Tal alelo co- dlfica uma forma variante da enzima que é inativa contra 0 substrato artificial usado no teste de triagem, mas conserva atividade suficiente contra o gangliosideo Gy. para ser nao-patogénico. A triagem para a doenca de Tay-Sachs geralmente é combinada com a triagem de uma selecao varidvel das outras “doencas de judeus” listadas no Quadro de doengas 10 (Capitulo 10) Na varias maneiras de se implementar um programa de triagem e diversas a¢des que poderiam seguir-se a um resultado positivo nos testes. Qual delas pode ser adotada é "uma questao significativa principalmente para a comunidade envolvida. Seja qual for 0 Protocolo adotado, a triagem deve ser voluntaia e necessita de consentimento com: pletamente informado, * ‘estar bebés ou criangas & antiético ¢ ineficaz. A crianga nao pode dar seu proprio consentimento, ¢ 0 resultado do teste nao tem conseqiiéncias até muitos anos de- ois, época em que é bem possivel ter sido esquecido. Testar alunos egressos de escolas levanta questdes a respeito de quao realmente voluntario é seu consentimento e precisa de manipulacio cuidadosa para evitar a estigmatizacao dos portadores. Algumas comunidades ortodoxas tentam resolver esse problema fornecendo os resultados a um casamenteiro, nao ao individuo tes- tado (veja adiante) * Testar adultos jovens solteiros e voluntarios minimiza os problemas do consenti- mento, mas perderd alguma fracao do grupo-alvo.GENETICA CLINICA 283) ' Testar casais identifica 0 pequeno niimero de casais de alto risco sem perturbar 0 ‘grupo muito maior de portadores cujo cOnjuge nao € portador (compare as duas Sltimas colunas da Tabela 11.2). No entanto, isso retira a possibilidade da escolha de nao casar com um portador. Em algumas comunidades ortodoxas, em que os casa _mentos so semi-arranjados, o casamenteiro ja possui os resultados da testagem de pessoas jovens solteiras para uma série de condigdes recessivas, e indicara se um ‘casamento proposto seria arriscado. 11.4 Resumoe extensao Que condicées devem ser sujeitas a triagem? ‘Tecnicamente, as possibilidades de triagem genética parecem quase ilimitadas ~ cer- tamente jé sao enormes ¢ esto aumentando a cada ano. Na pratica, entretanto, 0 {que esta em oferta & muito mais limitado. Além da inevitavel demora em trazer novos desenvolvimentos para o servigo, existem quatro razdes técnicas principais de por que a triagem genética nao & mais difundida (os fatores sociais e éticos sao considerados posteriormente). * Se voet resolver completamente as questdes de auto-avaliacao 1-3, vera que o valor preditivo positivo de um teste pode ser muito baixo, mesmo que o teste seja bem desempenhado no laboratério. © Uma variante de DNA pode estar indiscutivelmente associada ao risco aumenta- do de uma doenca, mas pode ser responsdvel apenas por uma pequena fraao do risco total. E importante considerar 0 risco populacional atribuivel (Quadro 11.3) em qualquer programa de triagem. Se uma variante explica somente 5% do risco total, qual & o seu ponto de triagem? Se esses 5% estiverem concentrados em alguns individuos que tém um risco muito alto, para essas pessoas pode- ria ser valioso conhecer tal variante ~ mas essa é a abordagem adotada para as doengas mendelianas, cuja testagem € principalmente de base familiar. Se a variante for comum, de maneira que o risco extra encontra-se disperso em uma ‘grande proporgao da populagao, conhecé-la parece ser de pouca utilidade para qualquer pessoa. ‘© E importante considerar nao apenas o risco relativo, mas também o risco absolu- to. Até um isco relative alto pode nao ser tao preacupante se for traduzido em lum risco absoluto baixo. Um exemplo € fornecido pelo Fator V de Leiden (OMIM 227400), que é um fator de risco de alta credibilidade para a tromboembolia ve~ nosa, por exemplo, entre os passageiros de rotas aéreas de longa distancia e as, tusuirias de anticoncepcionais orais. O risco relativo entre as usuarias de anticon cepcionais orais € alto (em torno de 15), mas o risco absoluto ainda é bastante baixo, porque essas usuarias geralmente sao jovens, ¢ 0 risco de embolia é muito dependente da idade. ‘Em geral, nao hi motivo para a triagem, a menos que um resultado positive provoque uma agao itil. Tal efeito poderia significar mudangas no estilo de vida, uso de drogas profilticas para reduzir 0 risco, ou talvez aumento da vigilancia, por exemplo, onde 0 risco € de cdncer, ¢ 0 diagnéstico precoce melhora o prognéstico. As vezes, 0s testes _genéticos s20 feitos simplesmente a fim de fornecer informacoes as pessoas para pla- nejarem seu futuro, como, por exemplo, no teste preditivo da doenga de Huntington, ‘mas normalmente um teste de triagem deve motivar algum resultado pratico.284 ANDREW READ & DIAN DONNA! Risco populacional atribuivel Crisco populacional atribuivel (PAR)* é a proporao do risco total de doenga na populagdo que é atribulvel a0 fator em questao. As vezes, é também denominado fracdo populacional atribuivel. Se 0 PAR for baixo, coloca ‘em duvida o valor da triagem para esse fator Se orisco total na populagao forr,mas a proporcao p da populacéo tiver uma variante que fornece um rsco adcional de , além do risco geralentao 0 PAR para essa varianteserd pi * N-deT, Doinalés population etnbutable nik 0 Servico de Gendmica e Prevencio de Doengas dos Centros de Controle e Prevencio de Doengas dos EUA elaborou um projeto que pode ser usado para avaliar qualquer teste genético (ou outro), ndo apenas um teste de triagem. O projeto ACCE” sugere que tum teste deve ser avaliado de acordo com quatro grupos de criterios. * Validade analitica: com que precisio o teste mede realmente o que deve medi? Para um teste de DNA, isso poderia traduzir-se na pergunta: qual 6a proporcao de todas as mutagDes de um gene que é detectada pelo protocolo do teste? * Validade clinica: com que precisao o teste detecta ou prediz a presenga ou a ausén cia da doenga? Por exemplo, a maioria das pessoas com hemocromatose hereditar (OMIM 235200) tem mutagdes em ambas as c6pias do seu gene HFE, geralmente p.Gis282Tir fou p.tis63Asp. Entretanto,o teste para esas mutagoes tem validade clinica baixa, porque a grande maioria de homozigotos ou de heterozigotos com- postos para essas mutagdes nao tem hemocromatose clinica. * Utilidade clinica: os resultados dos testes sio teis, fornecendo beneficios clin 0s? Todas as pessoas com a sindrome de Waardenburg tipo I (OMIM 193500) cém tuma mutagdo no gene PAX3. O teste tem alta validade analiticae clinica ~ mas @ deteccao das mutagdes ndo propicia outros beneficios clinicos dbvios a maioria dos pacientes, além da satisfacao de sua curiosidade * Conseqiiéncias éticas,legaise sociais, 0s programas de triagem populacional, nos quais os individuos evitam ingressar a0 in vés de optarem por neles participar, precisam ser financiados pelo Estado ou por com- Panhias seguradoras. Os financiadores avaliardo crticamente qualquer projeto quanto aos critrios técnicos, financeitos e éticos. Geralmente esses critétios se baseiam em um conjunto de critérios estabelecido por Wilson e Jungner, em um relatorio de 1968, para a Organizagao Mundial da Sade (OMS; veja Referencias). 0 Quadro 11.4 mostra wna selecio dos crtérios utilizados pelo Comité Nacional de Triagem do Reino Unido. No setor de marketing, os argumentos parecem muito diferentes. As seguradoras oferece- io um teste genético se perceberem um mercado provavelmente lucrativo pata isso, independentemente de resultar, ou ndo, em ages proveitosas ou em beneficios de longo prazo. Em conseqiiéncia, virias companhias oferecem a triagem genética ho “es- tilo de vida" — testagem de variantes associadas ao risco aumentado de alguma doenca comum, acompanhada de recomendagdes sobre como atenuar qualquer aumento desse risco (veja Quadro 11.5), No entanto, a rentabilidade pode depender da capacidade de twansferir parte dos custos para mais alguém. No Reino Unido, o individuo que obtém, dde uma companhia de base virtual, um resultado perturbador em um teste esperar, provavelmente, que 0 médico de sua familia e o servigo de genética do NHS tratem de suas preocupacdes. *N- de Do inglés analytical valty incl vl cnc wilt and ethic, egal ond sca implicationsGENETICA CLINICA 285) ritérios usados pelo Comité Nacional de Triagem do Reino Unido Para uma lista completa dos 22 crtérios, veja: wwwunsc.nhs.uk/pdfs/criteria.pf Acondigao: (1) Acondigao deve ser um importante problema de sadde. Paar) (2) Aepidemiologia e a histéria natural da condigdo... devern ser compreendidas adequadamente. (3) Todas as intervencdes de prevencao primaria de custo efetivo devem ter sido realizadas, se praticaveis, (A) Se os portadores de uma mutacao forem identificados, em consequéncia da triager, a hist6rla natural das pessoas com esse status deve ser conhecida, inclusive as implicagdes psicol6gicas dessa descoberta, Oteste: (5) Deve ser um teste de triager simples, seguro, preciso e validado. (7) Oteste deve ser aceitével a populagao. (9) Se for um teste para mutacées, caso nem todas as mutacSes possiveis sejam testadas, os critérios usados para selecionar o subconjunto de mutagées a ser abrangido pela triage devem ser claramente explicados. Otratamento: (10) Deve existir um tratamento ou uma intervencao eficaz para os pacientes identificados mediante detec¢ao inicial, com evidéncia de um tratamento precoce que produza melhores resultados do que um tratamen- to tardio, O programa de triagem: (13) Deve haver evidéncia de provas controladas e randomizadas de alta qualidade, demonstrando que 0 pro- agrama de triagem é eficaz na reducao da mortalidade ou da morbidade. Quando o propésito da tiagem é exclusivamente fornecer informagées que possibilitem 8 pessoa que esta se submetendo a triagem fazer uma’escolha informada'(p. ex, triagem de portador de fibrose cistica, ou de sindrome de Down), deve existr evidencia comprovada e de alta qualidade de que esse teste mede o isco com precisao. As informag6es fornecidas sobre o teste e eu resultado dever ser valiosas efacilmente compreendidas pelo individuo que esta se submetendo &triagem. (14) Deve existirevidéncia de que o programa completo de triagem teste, procedimentos diagnésticos,tra~ tamentofintervencao) é clinica, social ¢ eticamente aceitavel pelos profisionais da rea da satide e pelo paiblico em ger (15) 0s beneficios do programa de triagem devem superar os danos fsicas e psicolagicos (causados pelo teste, pelos procedimentos diagndsticos e pelos tratamentos) (16) O custo do programa de tiagem (incluindo testagem, diagndstico e tratamento, administracéo, tren: | mento e garantia de qualidade) deve estar economicamente equilbrado em relacdo as despesas com os cuidados médicos totais, ito ¢ equilibrado em valor monetéro, (19) Todas as outras opées para o manejo da condi¢do devem ter sido consideradas (p. ex. aperfeicoamento terapéutico, fornecimento de outros servigos), para garant que nenhuma intervengo mais vantajosa, em relacao ao custo/beneficio, pudesse ser apresentada, (20) As informacdes fundamentadas na evidencia, explicando as consequéncias da testagem, a investigacao € o tratamento, devem estar disponiveis a0s possivels participantes para ajudé-los a fazer uma escola infor- mada, (22) Se atragem for para uma mutagio, o programa deve ser aceitavel 8s pessoas identificadas como portado- ras ea outros membros da familia286 ANDREW READ & DIAN DONNA Testagem genética no*estilo de vida" Pesquisando na internet, vocé pode encontrar facilmente companhias que se oferecern para genotip-lo {quanto a certas variantes comuns de DNA, a fim de ajudé-lo a determinar seu mais saudavel estilo de vida Essas ofertas baseiam-se em relatos de associagdes entre polimorfismos comuns de DNA e o isco de doengas especificas. Esses relatos provavelmente foram feitos por cientistas tenomados em periddicos revisados por profissionais do mesmo nivel. Ainda que a lista de referéncias possa parecer excelente, hd varias perguntas que voc’ precisa fazer. (@)_ Essa ass0ciacdo fo validada? A proporcao de associagdes descritas que so replicadas em estudos inde- pendentes ¢ deprimentemente baixa ~ veja Capitulo 13, para ulterior discussao desse problema, (b) Foi validada em todos os grupos étnicos? Multosfatores de isco identifcados sdo especificos para deter- minados grupos étnicos. (©) Qual € a razio de risco? Isto, a variante aumenta o seu isco por um fator de 20, 5,2 ou 1,12 Voce se im- porta com um aumento de 10% em seu rsco? E importante distinguir entre asignficanciaestatstica ea ‘magnitude de um efeito, Um estudo amplo pode identifcar uma associagao altamente sigifcatva (isto 6,ndo ha dlivida de que é eal) com uma razdo de risco bastante trivial. Observe, incidentalmente, que é bbem sabido que as razdes de riscoinicials quase sempre se reduzem em estudos subsequentes, mesmo quando 0 risco é confirmado, (@) Qual é0risco populacional atrbuivel? Presumindo que um teste seja satisfatorio de acordo com tados esses critérios, resta a pergunta: ¢0 que importa isso? Do ponto de vista de sade publica, atestagem genética no’estlo de vida" arisca-se sim- plesmente a enfraquecer as mensagens validas universalmente sobre a necessidade de comer moderada- ‘mente, fazer algum exercicio e parar de fumar. As empresas que procuram as oportunidades de mercado podem ser menos importunadas por essas idéias - mas nenhuma se ariscaria a dizer as pessoas que aparecerem que, como seu isco é baixo no teste, podem, portanto, entregar-se, de bom grado, a um estilo de vida insalubre. 0s advogados deverdo ter um dia incomum de trabalho quando, como devera ocorter inevitavelmente, algumas pessoas sucumbirem a doengas para as quais seu risco informado era baixo. Esse Fisco nunca era nulo, era simplesmente inferior ao de outras pessoas. Portanto, independentemente do fesultado do teste, a ecomendacao da empresa deve ser a mesma informacao rotineira de vida saudave ‘apenas fornecida um pouco mais enfaticamente para as pessoas de alto risco, Por esse motivo, poderia set argumentado que essa testagem nao tinha quaisquer implicagbes éticas. A mesma informagao pode estar disponivel gratuitamente a todas as pessoas, mas algumas somente tomardo conhecimento dela se tiverem pago um preco razodvel e obtido uma folha de papel aparentemente cientifica. A questo de satide publica é: qual é 0 balango entre os que seriam motivados a agir adequadamente por receberem a informacao de um alto risco e os que agiriam inadequadamente por receberem a informacao de um risco mals baixo? Uma questao cientifica separada, normalmente ignorada pelos proponents da testagem no estilo de vida, ¢a relacao do resultado do teste com a satide total, nao como isco de uma doenca espectica, Todos esses testes se baseia em pesquisas que comparam a frequéncia de uma determinada variante de DNA em um grupo de pessoas com uma doenca espectfica, com a frequéncia dessa variante de DNA em controles que nao tém essa doenca, Uma variante pode aumentaro rico dessa doenca ~ mas talvez haja uma reducao compensadora 1 sco de alguma outra doenca. Is0 nao & to inusitado como possa parecer. Nossos ambientes metab6l os esto em equilibrio,otimizado em milhares de geracdes para manejar uma variedade de circunstancias, Esse equilorio envolve compromissos, Uma variante que atere esse equilibrio pode simplesmente alterar os ‘comppromissos. As varlantes comuns na populagdo nao podem ser inteiramente mas, ou a selecao natural as teria eliminado. Naturalmente, ¢ possivel que uma variante pudesse apenas te sido benéfica no ambiente das cavetnas, sendo completamente prejudicial para as pessoas que vivem nas opulentas sociedades ocidentals, cae R Lire)GENETICACLINICA 287) como é sugerido pela teoria do “genétipo econdmico” da suscetibilidade ao diabete (Hales e Barker, 2001), Atualmente, porém, quase nio temos informacdes sobre os efeitos de variante alguma sobre a satide geral, sso é particularmente relevante ds preocupacées de que as companhias sequradoras desejariam usar 0s dados sobre as variantes comuns de DNA em seus contratos de sequros, mas isso também parece uma observagao ‘acauteladora sobre o valor da testagem genética como um guia de vida saudavel. deRT. Oc gendtpo econimico fi itroduedoem 1963, com a propasta de que uma secrecio rida de insulin favoreceria ipo aimazenamento de nutientesnos ecidos mas em um apare Ine de graces quaildades de calras core uma esta Incline dabete ¢poshel que com os confiecenentos tus Sobea leptin, sa sj sna de sfcia au rsucénia de reseva5 trergehase que mas do que um hornono atcbesdadetenhaexrido um papel importante naesoluo do homem coma hormdnio| recor das eservs energtcas Fonte: Botella Catt, Len Barbancho MD. Valero Gonzalez Ma.e al eptina:impcacones fio os) cincas An Med. inte Wadi (enine 200, vo. 18,3 fctado 2007/07/05 48.56 Dsponvel er chp /wwscisaisc svscelapholsciptc testis 27199200100030002Ring=eskowmes0> Acessado er 09/07/2007 ‘A triagem neonatal é a drea da triagem populacional menos eticamente controversa, porque seus alvos sao condicies trataveis. Seu objetivo é assegurar tratamento precoce para evitar dano irreversivel. © American College of Medical Genetics recomendou que todos os recém-nascidos sejam submetidos a triagem para 29 condighes (Tabela 11.3). Essas recomendagées foram amplamente aceitas. Ainda que sua implementagio nos EUA varie de estado para estado, em 2006 quase dlois tercos dos reeém-nascidos norte-ame- ricanos foram submetidos a triagem para no minimo 20 condigdes — aproximadamente 0 dobro da atividade, em comparagao com 0 ano anterior. A Figura 11.6 mostra a distribui- ‘ao dessa atividade por estado norte-americano. Na maioria dos outros paises, a triagem neonatal esti limitada a uma lista menor, principalmente por razbes financeiras. THA Distro de Columbia © raise 20 concgbes cena 31) © 10 20condigdes cena (1 ae © menos de 10 conagoes cers Mele cas hachuradasindcom testagem soictade para New Jersey algumas condgbes, mas ainda no implementada igi Figura 11.6 Oestado de implementagao das recomendagées do American College of ‘Medical Genetics sobre a triagem neonatal, em junho de 2006. Dados de March of Dimes Birth Defects Foundation, gentiimente cedidos para reproducao.‘288 ANDREW READ & DIAN DONNAI Deficiéncia de desidrogenase aci-Coa de edeia média Hipotieoidsmo congénito Fenicetoniria Defcitncia de botnidase Doenga das cus actormes Hiperpasia adrenal congenita ‘cider isovaléca Deficiéncia de desidrogenase aci-CoA de cadeia muito longa Doenga do xarope deboldo na urna Galactosemia Hos/talassemia Doenga HES/C Defciéncia de desickogenase 3-hidroxiai-CoA de cadeia longa ‘Acidemia gutrca tipo! Acid hickoximetiusrica Defic de proteins tefurconal mtocondil Defcizncla mtipa de caboxlase ‘Acideia metimalinica(defcéncia de mutase) Homocistiniria Defcincia de 3-meti crotoni-CoA-carboxlase Perda auditiva ‘Acidemia metilmalonica (deficiéncia de cbiA oucbla) Acidemiapropionica Deficigncia de wansocase cantinaaccartina Deficiéncia de cetotiolase Cratinemia Acids arginino-sucinica Tiosinema po! Fibrose cstica 261600 253260 603903 201910 243500 201475 248600 230400 141900 141900 09016 231670 246450 cosas 253270 251000 236200 210200 251100 606054 212138 203750 215700 207800 276700 219700 Suplementos nuticionas; evitarjjum Hotménio thesideo oral Dieta pobre em fenialanina Biotina oral ciaiamente Cuidados médicos vigilantes: evitarinfeccdes Cirurgia genital reposigéo hormonal Dieta pobre em proteinas:suplementos nutricionais Dieta rca em carboidratos e pobre em lipideos; suplementos evitar eum Dieta pobre em protenas Eviar eee laticiios, CCuidados médicos vigilantes; eitarnfeegdes Cuidadios médicos vigilantes; evitarinfecgdes Dieta ica em carboidratos e pobre em lipideos: suplementos; evita jejum Dieta pobre em proteinas com carina oral Dieta rca er carboidatose pobre em ipideose proteinas; evita jjum Dieta pobre em ipideos suplementos;evtarjejum Biotina orl tamina 8, outs suplementos: dita pobre em proteins Dieta; suplementosincluindo vtaminas B, eB Dieta pobre em proteinas Estratégia de comunicacéo,aparelhos audiives; possvel implant ccoclear Vitamina 8, dieta pobre em proteinas Diet pobre em protenas suplementos Comniting Cuidados médicos vigilantes; deta pobre em proteinas Dieta pobre em proteinas:suplementos Dieta pobre em proteinassuplementos NTBC (ej Seo 14.4 Cuidados médicos vigiantes to Istadas em ardem de priodade, com base na reqbénila cravidade icici do ratamenta e praicablidade da tiagem Algumascondigbes ras em ‘aa posigio porque podem ser adiclonadas em riagem por espectrometria mpl atenada de massa gu cromatograa liquid de ata resolugSo, por umn ‘ust acicional muito pequeno. **Ohipottecidismo congénitoe a peda auitiva tém muias causes, nem todas geneticasGENETICACLINICA 289) Aaatitude em relagio a triagem pré-natal, de criangas ou de adultos para o status de por tadores ou para o risco de desenvolverem uma condigo de inicio tardio, esta mais en- raizada em culturaslocais. Os critérios 7, 14, 15, 20 € 22 do conjunto de eritérios do NSC do Reino Unido abrangem as questoes éticas e socials. A triagem & uma expressdo dos desejos ¢ valores da sociedadle em que ocorre. A triagem pré-natal teré pouco espaco ‘em uma sociedade em que o aborto seja inaceitavel sob circunstancia alguma, ainda que ambos nao estejam necessariamente ligados. Algumas sociedades so mais receptivas 8s pessoas anormais, ou mais fatalistas sobre as anormalidades, enquanto em outras 0 desejo de um filo normal é muito forte. Os aspectos da responsabilidade individual e dos valores relativos da liberdade individual e da satide publica afetarao a aceitabilidade de programas especificos. As atitudles em relagdo as criangas sao importantes ~ até que Ponto os genitores sao donos de seus filhos e tém o direito de conhecer sua consttui- «ao genética, ou até onde a autonomia dos filhos deve ser respeitada, nao se realizando teste algum até que esses tenham idade suficiente para fornecer adequadamente seu consentimento informado? E o principio geral de que triagem deve ser voluntaria e necessita de consentimento informado, mas mesmo nesse aspecto as questdes nao si0 claras. Um bebé nao pode consentir sua triagem para PKU. Se os pais nao concordarem em fazé-la, tém o direito de arriscar a condenagao de seu filho @ uma vida institucio- nalizada, enquanto esperam que a populacao geral salde as despesas? No entanto, as pessoas devem ser livres para evitaratriagem, se assim desejarem. Isso nao significa que simplesmente podem recusar a testagem: significa também que, digamos, se apés rejei- {arem a testagem pré-natal, tiverem um filho afetado, nao devem, de maneira alguma, ser culpados ou punidos, Na Gra-Bretanha, a comunidlade cipriota grega se submeteu com entusiasmo a triagem para Brtalassemia, ao passo que a comunidad paquistanesa, também de alto risco, de modo _zeral ndo a quis. Em Israel, diz-se que existe uma forte demanda popular para todos os pos- siveis testes de triagem, enquanto no Reino Unido essa abordagem & muito mais cautelosa Por exemplo, uma rede de lojas do centro comercial britanico cessou de oferecer uma série de testes em “estilo de vida” depois que o puilico se inquietou com suas conseqiiéncias ~ ainda que muitos pucessem argumentar que esses testes ndo so mais prejudiciais do que uum hordscopo e, na pior das hipsteses, consistem apenas em desperdicio de dinheiro, De acordo com as lojas, a razao para interromper a oferta foi a falta de interesse da populagao, ‘0 que, se verdadero, reflete melhor o bom senso do povo britanico. Com referéncia ao aspecto economico da triagem, é interessante notar como o critério 16 dalista do NSC do Reino Unido & formulado com muita cautela. A avaliagdo das vantagens financeras de um programa de triagem geralmente envolve o balango dos custos imedia tos da triagem e a reivindicada poupanca de mais longo prazo. Esse & um setor dif, em bora naturalmente vital, em muitas éreas politica. £ administrado mediante uso do luxo de cava de descontos. Para comparar 6 custo atual com a poupanca no prazo de 10 anos, esse custo 6 tratado como um investimento, cujo valor, em 10 anos, é calculado mediante uso dos juros compostos. taxa de uros ulizada (a taxa de desconto) afeta obviamente 0 resultado, Contudo, os diferentes tipos de instituicdes podem ter diferentes pontos de vs ta sobre a relevancia da poupanga potencial, no futuro distant. Além disso, esses cleulos ‘am suas imitagdes como marcos de acao. Aplicado a geracao de filhos normais, 0 método do fluxo de cana de descontos sugere que a reprodugdo ¢financeiramente desastrosa para a sociedade:€ realmente improvavel que a contribuigao individual a sociedade, sob a forma de impostos, como um trabalhador aduto, possa algum dia reembolsaro custo descontar do de seu parto, de sua criagao e de sua educagio. Se 0s célculos das despesas parecerem razodveis, a decisio de implementar um pro- sgrama de triagem gira em torno da demanda publica e da aceitabilidade social, Uma vez que a opinio piiblica jamais € unanime sobre esses assuntos, as decisdes estao na politica final.290 ANDREW READ & DIAN DONNA Hipercolesterolemia familiar ou hereditaria Estamos todos familarizados com um nivel alto de colesterol como um sinal de ingestdo alimentar nao-saudavel =mas aproximadamente 1 pessoa em cada S00 tem um nivel extremamente alto de colesterol,em consequéncia cde uma condigdo genética e independentemente da dieta. A hipercolesterolemia familar ou hereditria(FH"; ‘OMIM 143890) é uma condigio autossémica dominante. Na maioria das populagdes, é a mais comum de todas as condigdes mendelianas clinicamente sigificativas. Os heterozigotos tém,tipicamente,niveis de colestero sérico e colesterol na LDL (ipoproteina de baixa densidade) de 250-450 e 200-400 mg/dl respectivamente (os limites nor- mais tespectivos s40 de 150-250 e 75-175 mg/d) Desenvolvem xantomas (depésitos subcutaneos de colesterol) nos tend6es e softem da doenga arterial coronariana na meia-idade, com muitas mortes prematuras por infarto do ‘miocardio. Os rarosindividuosafetados homazigotos apresentam essas caractersticas em gfau mais extremo. @ ) a Deposicao de colesteral em pacientes heterozigotos para ahipercolesterolemia familia (,b) Kantomas tendinosos(c) arco comeal.Fatos gentimente cedidas pelo Dr. Paul Durrington, Manchester Royal Infirmary Michael Brown e Joseph Goldstein receberam, em 1985, 0 Prémio Nobel de Medicina por seu trabalho sobre FH, que ocasionou um conhecimento detalhado da homeostasia do colesterol (veja Referéncias para informa- ‘GOs adicionals). Demonstraram que a FH era geralmente causada por mutagdes no gene LDLR, do receptor da lipoproteina de baixa densidade. Esse receptor de superficie celular introduz LDL, que contém colesterol nas, Células hepaticas (um exemplo de endacitose mediada pelo receptor), nas quais reprime a sintese do colesterol ‘endégeno como parte de umn mecanismo homeostatico. O receptor mutante esta ausente ou falha na ligac3o coma LDL, dependendo do tipo especifico da mutacao, acarretando uma producao endégena descontrolada de colesterol, As vezes, a FH pode ser causada por mutagdes em outros dois genes: ‘= algumas pessoas produzem LDL que nao é reconhecida pelo respectivo receptor, porque um mutante do gene APOB codifica uma forma anormal dessa lipoproteina ‘= pacientes ocasionais tém mutagdes com sentido errado, de ganho de fungdo, no gene PCSK®, que codifica uma enzima de processamento protéico que faz parte do mecanismo homeostatico. Aatividade normal da LDL internalizada é reprimir a 3-hidroxi-3-metilglutarl coenzima A (HMG CoA) reduta: | se, que catalsaa etapa que limita a taxa de sintese do colesterol.Em pacientes com FH, sdo usadas as drogas | estatinas para inibir essa enzima, Essa é uma estratégia clinica muito eficaz, que pode normalizar os niveis de olesterol e 0s riscos a satide, Uma vez que essa condicao é comum, tendo graves implicacdes para a satide podendo ser tratada com eficacia, hd uma boa razdo para a triagem de FH em toda a populacao. Entretan 10,05 problemas de recursos financeiros so consideraveis.A tiagem com base nos niveis de colesterol ena ppresenga de xantornas tendinosos tem baba sensibilidade, especialmente nas pessoas mais jovens.A triagem ‘com base no DNA é dispendiosa, porque o gene LDLR, localizado no cromossomo 19p13.2, contém 18 éxons € varias centenas de mutacdes diferentes ja descritas Visto que essa condigaa dominante afeta grandes genealogias estendidas, um método econémico de averiguar ‘grande quantidade de pessoas afetadas ¢ testar parentes de casos afetados conhecidos, um procedimento conhe- cido como triagem em caseata ou testagem em cascata. Esse principio foi mencionado anteriormente, em alu: s80 8 testagem de parentes de Joanne Brown (Caso 2), para as mutacdes de fibrose cstica. 0 melhor programa de triagem em cascata para FH, desenvolvido nos Paises Baixos, vem ocortendo desde 1994, Os parentes so con: *NedeT, Doingls, 2 Fy a 3 = a 8 8 2GENETICACLINICA 291 tatados diretamente por um geneticista.O rastreamento familar é excepcionalmente completo, evando a uma Imédia de 25,7 parentes testados por probando. Dos que foram detectados como afetados, somente 39% js esta ‘Yam usando estatinas,Os detalhes desse e de outros programas s80 revisados por Hadfield e Humphries (2005). 5 estudos do programa holandés demonstraram beneficios clinicos muito claros: 93% das pessoas afetadas, aver Quads por meio do programa, subsequentemente tomaram estatinas, teduzindo muito, assim, seu risco de morte rematura.Vtias questbes éticas podem ser levantadas.O contato diteto com os parentes é considerado eticar mente problemitico em alguns paises, por isso, em seu lugar, os probandos s80 levados a sugerir aos seus parentes ‘Que poderiam benefciar-se da conversa com um geneticista Essa abordagem evita alguns problemas, mas diminui bastante o numero de parentes testados por probando. Hi perguntas sobre a identificacao de criancas afetadas 0 beneficio do tratamento precoce supera 0 rsco de estigmatizacao ou prejulzo da auto-imagem? Também é neces- Salo ponderar sobre as implicagées relacionadas com os seguros de vide, para as pessoas contatadas inesperada- mente. Algumas companbias sequradoras pelo menos aceitam 0 arqumento de que 0 contrato de seguro de vida Se baselie no fendtipo — onivel de colesterol presente no paciente tratado -, ndo em seu genétipo. Como o trata ‘mento com estatina éeficaz, so amplamente eliminadas as questOes de sequros. Os estudos atentos do programa hholandlés no mostraram nenhum dos efeitos adversos preditos, emibora seja possivel que iso reflta parcialmente as admitaveis qualidades da socledade holandesa e possa ndo ser tio fécil de replicar em outros paises 11.5 Referéncias See ET Ty) Tre) Conde-Agudlelo A and Kafury-Goeta AC (1990) Triple marker test as screening for Down syndrome: a meta-analysis. Obstet. Gynecol, Survey 53: 369-376, Hadfield SG and Humohries SE (2005) Implementation of cascade testing for the detection of familial hypercholesterolaemia. Curt. Opin. Lipidol. 16: 428-433. Hales CN and Barker DjP (2001) The thrifty phenotype hypothesis, Type 2 diabetes. Br: Med. Bull. 60: 5-20. Osilvie CM, Lashwood A, Chitty L, Waters J, Scriven PN and Flinter F (2005) ‘The future of prenatal diagnosis: rapid testing or full karyotype? An audit of chromosome abnormalities and pregnancy outcomes for women referred for Down syndrome testing. Br.J. Obstet. Gynae. 112: 1369-1375, Wilson JMG and Jungner G (1968) Principles and Practice of Screening for Disease. World Health Organization, Geneva, Websites uteis O website da Biblioteca Eletronica Nacional do Reino Uni (UK National Electro brary) tem uma boa secao sobre triagem: http:/www.library.nhs.uk/screening/. Veja também 0 Centro de Programas le Triagem Neonatal do Reino Unido (UK Newborn Screening Programme Centr Um exemplo de um servico de triagem pré-natal (um entre muitos, mas com boa wvww.newbotnscreening-bloodspot.org.uk/. documentacao sobre sindrome de Down ¢ fibrose cistia) é 0 Servigo de Triagem Pré-Natal de Leeds, Reino Unido (UK Leeds Antenatal Screening Service): httpuiwwwwleeds.acubllass/index. htm. 0 website do laborat6rio Brown-Goldstein, no Centro Médico Sul-Ocidental de Utah, EUA (UT Southwestern Medical Center) conta a fascinante histori vencedor do Prémio Nobel, sobre a regulagao do colesterol: hitpu/www4.utsouthwestern.edwmoleculargenetics/pages/brown/past.html de seu trabalho292. ANDREW READ & DIAN DONNA! 11.6 Questées de auto-avaliagao (1) Uma doenca hipotética é causada por mutagdes no gene IGNO, Uma pessoa em cada 100 contém uma mutacio. Vocé tem um protocolo de testagem genética que deteeta 80% de todas as mutagdes. Recebe 10,000 amostras de sangue de bebés recém-nascidos ~ mas 1% das amostras foi obtido em tubos contaminados que for- rnecem um resultado falso-positivo em seu teste, Qual ¢ 0 valor preditivo positive de seu teste? (2) Um cientista vem estudando as pessoas que sofrem de graves efeitos adversos ‘de uma deterininada droga. Na populacao geral, uma pessoa em cada 10.000 padece desses efeitos. O cientista identificou um polimorfismo de DNA que esta fortemente associado ao risco. Em testagem cega no laboratério, 9/100 pessoas ‘que haviam mostrado reagio adversa & droga foram positivas para a variante, En {quanto apenas 1/100 das pessoas que tomaram a droga sem efeitos prejudiciais foi positiva para a mesma variante. O pesquisador propde fazer a triagem de toda a populagao de sua cidade (1 milhao de pessoas) para essa variante, Calcule 0 valor preditivo positivo de seu teste. (3) Repita o calculo da questao anterior, considerando que a reacao adversa ocorreu fem 1 pessoa em cada 10, em vez de 1 em cada 10,000. 0 que isso nos diz sobre 0 potencial da triagem em geral? (4) Considerando uma incidéncia de defeitos do tubo neural de 1:100 gestagdes tes tadas, use as curvas da Figura 11.2 para estimar a sensibilidade ¢ o valor preditivo positivo do teste de MSAFP (alfa-fetoproteina sérica materna), usando os seguintes pontos de corte: {a) todos acima do valor normal médio (b) todos acima do valor anormal minimo (6) todos acima do valor normal maximo (6) Na triagem de portadores heterozigotos) para a fibrose cistica, alguns casais tera0 um dos cOnjuges com resultado positivo no teste ¢ o outro com resultado negati vo. Calcule a sensibilidade exigida de um teste de triagem, de modo a garantir que tais casais no estejam em risco maior de que ambos os cOnjuges realmente sejam portadores do que o risco em que estavam antes de ser realizada a triagem. Consi- dere que a freqiiéncia de portadores nessa populacao é 1/40. (6) Vocé & um administrador saudavel, encartegado de estabelecer um programa de triagem populacional para portadores (heterozigotos) para a fibrose cistica (que perfaz 1 pessoa em cada 25, em sua populacao). (a) Decida em que estigio de suas vidas e sob quais circunstancias as pessoas de- ‘vem ser testadas; redija uma breve justificativa de sua escolha. (b) Vocé tem propostas de duas empresas para a realizacao da genotipagem de alta resolugio. Uma oferece a testagem de um paine!limitado de mutagdes, abran- ‘gendo 70% de todas as mutagbes: a outta testa um painel maior, que abrange ‘90% de todas as mutagbes. Naturalmente, os respectivos custos sao diferentes, ras antes de vocé tomar decisdes precisa conhecer os resultados provaveis. Para cada opgio, calcule os resultados esperados da triagem de 1 milhio de pessoas, em funcao dos nascimentos evitados de bebés com fibrose cistica e dos nascimentos de bebés com fibrose cistica de casais em que ambos os cOn- juges nao foram portadores do gene no teste de triagem.Capitulo 12 O cancer é genético? Pontos de aprendizagem para este capitulo 12.1 Estudos de casos ‘Apés terminar de ler este capitulo, vocé deve ser capaz de: ‘+ Descrever a carcinogénese como um proceso evolutivo dentro de um indivduo ‘+ Definic oncogenes e genes supressores de turnar, fomecendo exernplos ‘+ Descrever 0s tipos de instabiidade gendmica encontrados nas células cancero- 5s, em como o papel dos pontos de controle do ciclo celular em evitélos, ‘star as capacidades essenciais dos tumores malignos e descrever os tipos de mu- dangas genéticas somaticas que levam 20 seu desenvolvimento, ncluindo a ativa ‘80 de oncogenes ou a intivaco de genes supressores de tumor por mutacdes somaticas, mudancas epigenéticas, delegdes que induzem a perda da heterazigo- s@ e rearranjos cromossomicos que induzem genes de fuséo (genes quiméricos) + Descrever.no minimo trés sindromes de cancer hereditari e discutr suas rela- «bes com os canceres espordidicos comuns * Descrever 0 papel da genética no diagndstico, no tratamento e na prevengéo do cancer ‘© Cancer de mama familar? Wendy Wilson viu um programa de televisio a respeito do carater familiar do cancer de mama, que aumentou suas preocupagdes com a propria historia familiar. Ha alguns anos, mencionara sua inquietagao ao médico de familia, mas esse a tranqiilizara. Sua mae, Wanda, desenvolveu a doenga aos 42 anos e pesarosamente faleceu quando esta- ‘ya com 44 anos. Amy, irma de sua mae que vivia na Nova Zelandia, também teve cincer ‘de mama aproximadamente aos 40 anos, mas, apés a cirurgia e a quimioterapia, estava bem, sete anos depois. No Natal anterior, Wendy recebeu um cartao de uma antiga av6, em que mencionava que um de seus netos também estava fazendo tratamen- to para cancer de mama e expressava seu abalo com o fato de um homem poder ser afetado por essa doenga. Wendy entrou em contato com seus irmaos William e Vero nica, € 0s trés decidiram examinar mais minuciosamente essa questao. Veronica era a sgencalogista da familia e, em pouco tempo, havia procurado varios parentes com os uais tinham perdido o contato. Descobriram que um dos primos de Wanda morreu, ainda jovem, de cancer de mama. O programa televisivo havia referido que os testes para o cancer de mama familiar encontravam-se disponiveis em clinicas genéticas, por isso Wendy marcou uma consulta com seu médico de familia, a fim de Ihe pedir seu encaminhamento a uma dessas clinicas. No consultério, Wendy informou o maximo294 ANDREW READ & DIAN DONNA de detalhes ao médico, que verificou as orientacbes online fornecidas pelo centro de ‘genética, A familia de Wendy preenchia os critérios quanto ao alto risco, portanto seu ‘encaminhamento foi providenciado. Antes da consulta, a consultora genética do centro eentrou em contato com a interessada para tracar seu heredograma. Também the pedit informagdes a respeito de sua mae ¢ do local em que essa fora tratada, a fim de obter 1 respectivos registros médicos, para confirmar alguns detalhes de sa doenca. Figura 12.1 (2) Heredograma da familia Wilson, mostrando 0s tipos de cancer €as idades ni poca dos diagnésticos.(b) Carcinoma de mama detectado em uma mulher de 40 a meio de imagean ‘tica, Essa senhora tinha uma mutagao no gene BRCAT. Foto gentilmente cedida pelo Dr. G ¥/s Hospital, Manc to de ressonancia ma CASO 24 Familia Xenakis, 294 | 315 ‘¢ Histia familar de proble Christos era um dos trés filhos nascidos em Chipre, na década de 1960, de Xavier € ireestnal Demi Xenakis. Xavier comeou a ter sintomas intestinais aos 41 anos, mas s6 procurou + Polipose adenomatosa familiar seu: médico quando se tomou realmente doente. No hospital, foi diagnosticado com en cncer intestinal, jé com metistases® no figado, sendo possivel apenas um tratamento paliativo. Faleceu um pouco mais tarde, naquele ano, e logo depois Christos mudou- se para Seattle, onde abriria seu proprio restaurante, juntamente com a esposa e com (5 seus filhos, um menino e uma menina, Demi, entao, foi morar com eles. A vida era ‘muito atribulada, mas o restaurante ia bem. Em um exame médico para uma apdlice de seguro, alguns anos depois, Christos mencionou que recentemente havia notado algum sangramento retal, que pensava ser devido as hemorrdidas. Em vista de sua histér familiar, o médico recomendou que Christos se submetesse a uma sigmoidoscopia, exa ‘me que revelou, para preocupacio de todos, que o paciente tinha plipos maitiplos. 0 cirurgiao explicou que esse exame confirmava que Christos tem polipose adenoma- tosa familiar (FAP) e que o tinico tratamento sensato seria extirpar 0 célon, uma vez ‘que, inevitavelmente, o cancer vria a se desenvolver em um ou mais pélipos. Enquanto CCiristos ainda estava hospitalizado, 0 cirurgiao recomendou que, quando estivesse re- cuperado, procurasse uma clinica genética para descobrir os riscos dessa doenea para seus filhos e também a existéncia de testes de triagem a que esses pudessem submeter se no seu devido tempo. Apds alguns meses, a familia compareceu a clinica genética, ‘A consultora explicou-Ihe a heranca autossOmica dominante da doenga e calculou que lho tinha um risco de 50% de ter herdado o gene mutante. A familia soube que cada TN: de Ts Metastases so expanses decéulas malign de um tumor que, por meio dos vaso sangineos ou linfticos, estabelecemn novas cols cluaresmalignas em outros tecidos,causando a desorgrizaca0 de drgios vias e,conseqlentemente, a morte do individuo. Fonte: Borges-Osrio, M.R; Robinson, WM. ‘Gendica humana. 2. e.-2eimpresio, Porto Alegre: Armed, 2006p. 280 e432,12.2. Contexto ce ICACLINICA 295 seria possivel fazer uma testagem genética se fosse encontrada uma mutagaio em Chris- tos, € que, para as criangas em risco ou que eram detectadas como portadoras da muta- G80, eram oferecidas sigmoidoscopias, regularmente, a partir dos 10 anos de idade. parentes | waren | Ob D mo Oo a3} @) ©) Figura 12.2 Polipose adenomatosa familiar do célon. {2} Heredograma da fata Xenakis. (b) Parte de um célon, remavido cirurgicamente, com pélipos. Foto gentiimente cedida pelo Medic llutration Department, Manchester Royal infrmary Aselecao natural e a evolucao do cancer Imagine uma floresta isolada em que vive uma populagao de ratazanas. Um desses animais sofre uma mutacao hereditaria que o torna capaz de se reproduzir mais rapi- damente do que as demais ratazanas. Quando vocé visitar a floresta, 100 geragdes de ratazanas depois, deve esperar que a maioria das ratazanas seja descendente daquela primeira mutante de reprodugio mais rida. € exatamente esse argumento darwi- niano simples que se aplica as células do seu corpo. A divisio celular encontra-se sob controle genético. Se uma das células sofrer uma mutagao que a faca se divdir mais rapidamente do que as outras, ndo havendo diferengas quanto ao resto, suas descen- dentes tomarao conta de seu organismo. Desse modo, o cancer nao é uma doenca especifica com uma s6 causa e uma cura aguardando ser descoberta. Se o restante permanecer igual, 0 cancer é simplesmente o ponto final da evolucao no interior do compo de qualquer organismo pluricelular. Felizmente, nem tudo permanece igual. Os organismos pluricelulares ndo poderiam sobreviver se nao tivessem mecanismos para controlar e reprimir a evolucao de suas cé- lulas somaticas, pelo menos até o fim de sua vida reprodutiva. Durante mais de um bi thao de anos em que estiveram evoluindo, os organismos pluricelulares desenvolveram defesas sofisticadas ¢ em muitos niveis contra as células atipicas. O crescimento celular € rigorosamente controlado. A maioria das células somaticas nao tem a capacidade de se dividir indefinidamente, Qualquer célula que se comporte inadequadamente e cujo ‘comportamento anti-social nao possa ser remediado é obrigada a se matar (apoptose; veja definicao no Glossario), Em um artigo importante, Hanahan e Weinberg (2000) lsta- ram seis capacidades funcionais que um tumor maligno precisa adquirir para se desen- volver e sobreviver (Quadro 12.1). A aquisigao de cada capacidade significa superar um mecanismo regulador separado, ou uma linha de defesa, do organismo. Compativeis, com esse aspecto, os estudos clissicos da incidéncia dos canceres epiteliais comuns, segundo a faixa etiria, sugeriam que eram necessarios de quatro a sete eventos inde- pendentes para gerar um tumor maligno,296 ANDREW RE 0 & DIAN DONNA ‘As seis capacidades essenciais de um tumor maligno De acordo com Hanahan e Weinberg (2000), um tumor maligno precisa obter as sequintes capacidades duran- te seu desenvolvimento: * capacidade das células para se dividir independentemente dos sinais externos de crescimento * capacidade das células para ignorar 0s sinals externos de anticrescimento * capacidade das células para evitar a apoptose * capacidade das células para se dividir indefinidamente, sem senescéncia + capacidade para estimular a angiogénese ininterupta * capacidade para invadi os tecidos ¢ estabelecer tumores secundirios distantes Os tumores contém uma diversidade de células, eessas capacidades provavelmente pertencem somente a uma pequena populacao de células-tronco cancerosas.£ provvel que a obtengio de cada uma dessas ca- pacidades exja uma mudanca genética ou epigenética especifica para burlar um mecanismo requlador. As possiveis excegbes so a capacidade de se dividir indefinidameente, quando a célula fundadora ja é uma célula- tronco, ea capacidade de formar metastases ~ existe controvérsia sobre se essa capacidade é acquirida especi ficamente ou se é apenas uma conseqUéncia frequente da consecucéo das outa cinco capacidades. Superando as defesas Segundo as taxas de mutacdes tipicas, a probabilidade de qualquer célula do corpo de ‘uma pessoa alcangar sucessivamente as seis mutagdes especificas pareceria desprezi vel. Considerando uma taxa de mutacdo de 10° por gene e por célula, a probabilidade de uma célula obter seis mutacdes especificas sucessivas é 10”. O ntimero de células do corpo humano é da ordem de 10, portanto, aparentemente, as defesas contra ‘6 cancer seriam invenciveis. Uma vez que sabemos que, apesar disso, em cada trés pessoas, uma delas desenvolverd um cancer, deve haver alguma coisa errada com as defesas, 0 estratagema & que, nesse processo, de algum modo as mutagdes inciais dever au- mentar muito a probabilidade de ocorréncia de mutacBes mais tarda. Podem fazer isso de duas maneiras, * As mutagdes podem dar a célula uma vantagem em crescimento, Se uma célula utante pode produzir 1,000 células-ilhas mutantes, a chance de que uma célula mutante obtenha a mutagao seguinte aumenta em 1,000 vezes. Os patologistas sabem, hi muito tempo, que os tumores se desenvolvem ao longo de estagios que sao marcados por um aumento do potencial de crescimento, e que os tecidos que se dividem rapidamente sao os mais provaveis de desenvolver tumores. Acredita-se que as células fundadoras de muitos tumores tenham propriedades semelhantes as das células-tronco, por isso ja tém um potencial de crescimento inusual (Pardal et al, 2003). * Podiem aumentar a taxa geral de mutacdes mediante desestabilizacao do genoma.. ‘Todas as células cancerosas mostram um de dois tipos de instabilidade gendmica: (i) instabilidade cromoss6mica ~ a maioria das células tumorais tem cariétipos estra- rnhos, com niimero excessivamente anormal de cromossomos e muitos rearranjos estruturais (Quadro 12.2) instabilidade dos microssatélites ~ alguns tumores so cromossomicamente nor- ‘mais, mas a testagem do DNA mostra que o controle normal sobre a preciso da replicagao do DNA foi perdido (veja pagina seguinte)..GENETICA CLINICA. 297 Conseqiientemente a essasalteragdes, € provavel que os estigios iniciais da tumorigé- nese produzam uma populacao crescente de células com uma grande variedade de mu- tagdes aleatérias, preparando um terreno fértl para os desenvolvimentos subseqiien- tes. Os genes que sofiem mutacies nesses primeiros estigios sao classificados como oncogenes e genes supressores de tumor. Essa classificacao depende, principalmente, do tipo de mutacao necesséria ~ de ganho de fungao ou de perda de funcao -, mas isso, Dor sua vez, depencle da fungao normal do gene. De modo geral, os oncogenes si0 genes cujo papel normal é estimular a divisio celular, o passo que o papel normal dos enes supressores ce tumor & reprimir a divisio celular Instabilidade cromossémica nas células cancerosas Em geral, as células cancerosas tém cariétipos excessivamente anormais, com muitos ganhos, muitas perdos muitos rearanjos. As células de tumores s6lidos normalmente oferecem preparacdes cromossémicas t30 insatisfatorias que sao dfceis ou impossiveis de serem analisadas por meio das técnicascitogenéticas conven: cionals As técnicas MISH e SKY so versoes multicolordas da pintura cromossomica (veja Secdo 44, no Capi tulo 4) que fazem cada cromossomo orginal aparecer em uma cor diferent. Essas téicas permitem a andlise detalhada das ateracbes citogenéticas das células cancerosas, Como exemplo, aqui esto caritipo registrado peo Dr.T. Reid para linhagem celular HT29 de carcinoma de colon humano: 67-71,XX.del(X(p11.2)(19], del(3)(p21)11 1), der(3)ins(3;12N(p12;216}, der(3)del(3)(p25) {ns(3;12)(p12;25), der(3)t0X:3)(3qter)(11), (3)(q10)(211, del(4)(q31.3)120, +der(5)t(5:6Nq1 1;7)110), del(6)(q i219}, t(6;14)(q21;q13){151, der(6)t(6;14)(q21:91 315], ++del(7)(p15)(17], -81201, deri8N(8)(qter->q10:q10->q24:hsr:924->qter)(21], +1 1(20], ~13{8], der(13)i(13)(q O}del(q 411), der(13)t(5;13)(p13;p11.1)(12), (13g 018], ~141211, =14{4), +15{20), der(17)t(17;19)(p11;p11)121,i18)(p101(19, -19113}, i(19)(q10}dup(19(q13.1413.4)(19),+i(20)q10)(21), 21121, der(222)t(17;227;17)120) Foram analisadas 21 células, cujo ntimero de cromossomos variou entre 67 € 71. Os numeras no intetior dos colchetes correspondem ao ntimero de células que contém cada alteracao especificada. Esse caso e muitos ‘outros podem ser vistos como diagramas cariotipicos“Skygram’ no website do Instituto Nacional do Cancer (National Cancer Institute): http//www.ncbisnlm.nih.gov/sky, Vivendo para sempre: a importancia dos telémeros {As células cancerosas sao imortais: alcangaram a capacidade de se divi indefinida- mente, sem senescéncia (Quadro 12.1). As células HeLa", uma linhagem celular-padrao muito utilizada em laboratsrio, crescem em cultura ha mais de meio século, As eélulas humanas normais nao fazem isso. Crescem em cultura por algumas dezenas de divi- Ges, mas entdo param de crescer, entrando em um estigio denominado de senescé cia. As células com certas mutagdes relacionadas com o cancer (nos genes 7753 ¢ RBI, ‘veja adiante} escapam da senescéncia. Apés algumas divisoes adicionais, atingem um estigio chamado crise, que é marcado pela morte da grande maioria das células. As Poucas sobreviventes adquiriram grandes rearranjos cromossémicos e a imortalidade das células eancerosas "'N. de T Linhagem celular estabelecid que consste em uma linhagem aneuplbie de células do tipo epi {ela hmano, mantida em cultura desde 1951 eoriginada de wma amostra de tecido de carcinoma de colo lterino de uma pacientecujo nome era Henreta Lacks, do qual decorre a denominagao dessa inhagern celular Fonte: King & Stansfield op. city p. 153,298 ANDREW READ & DIAN DONNA Esses eventos relacionam-se com um problema na replicacio das extremidades cromos- sOmicas. Recorde que as duas fitas da dupla-hélice so antiparalelas e que as fitas de DNA somente podem crescer no sentido 5‘ 3' (Quadro 3.2, Capitulo). Uma das fitas da dupla- hétice tem uma extremidade 5' live. Quando essa fita & usada como mole paraa sintese de uma fita complementar, a polimerase move-se em diregao a extremidade da fia, € nao ha problema em estender a nova fita até a extremidade 5 da fta-molde (Figura 12.30). A ‘outra fita da dupla-hélice, com uma extremidade 3' livre, apresenta problemas. Quando essa fita & usada como molde, a polimerase move-se da extremidade para o interior do molde, em sentido contraio ao movimento da forquilha de replicacao. A nova fita, entdo, & formada descontinuamente, em segmentos de 100-200 nt (fragmentos de Okazaki). Cada fragmento comeca com um curto iniciador de RNA (10 nt). O iltimo iniciador nao parte, necessariamente, do iiltimo nucleotideo do cromossomo e, mesmo que 0 faca, os 10 nt correspondentes a0 iniciador s8o perdidos, quando 0 iniciador é removido, no momento fem que os fragmentos de Okazaki sao reunidos. Assim, uma dupla-hélice de DNA linear perde, inevitavelmente, alguma seqiiéncia de sua extremidade toda vez que é replicada {As bactérias resolvem esse problema possuindo cromossomos circulares; as células eu- ‘caridticas usam os telmeros. Os cromossomos humanos terminam com cerca de 10 kb de uma seqiiéncia repetitiva, (TTAGGG),, que compdem os telémeros. Em cada ciclo de divisoes celulares, 0 telometo encurta 50-100 nt. Dentro de limites, isso nao tem impor- tncia, porque as repeticdes teloméricas nao contém informacdes genéticas. No entan- to, divisoes repetidas poderio acarretar a perda completa dos telémeros. Uma funcd0 dessas estruturas é proteger as extremidades cromoss6micas contra os mecanismos de repato do DNA, que reconhecem as extremidades rompidas do DNA e tentam reuni-las (Figura 12.3b). Isso é 0 que acontece as células na crise pos-senescét (a) sequin porn Irogrentode Oars [ANA wb) (TAGES): 000 11 TTAGGG)990 1 rmmemeen(TTAGGG) 00 yg tomene — NNN TTAGGG)1000 ‘wore etd, exenso do enero estates Figura 12.3 (a) Os mecanismos de replicagao do DNA no podem replicaro final da extre- midade 3'de uma molécula, (b) Os telomeros dos cromossomos humanos contém unidades TTAGGG repetidas em tandem. Algumas repeticbes s80 perdidas toda vez que a célula replica seu DNA. Em células cultivadas, a perda continua dessas repeticdes leva a instabilidade cro- mossomica, Na linhagem germinativa e nas células cancerosas a enzima telomerase pode restabelecer a extensdo completa do telémero.GENETICACLINICA 299) ‘Todas as células do nosso corpo descendem, por uma sucesso de divisdes celulares, do évulo fertilizado original; por sua vez, também por uma sucessio de divisoes celula- res, esse 6vulo fertilizado ¢ descendente dos zigotos que originaram nossos genitores; portanto, através de uma sucessao ininterrupta de divisbes celulares ao longo das gera- ‘90e5, voltamos no momento exato ao verdadero inicio da vida. Sendo assim, como ain. dda temos telomeros? A resposta é que certas células possuem uma enzima, a telome- ase, que restabelece os telomeros até sua completa extensio. Essa enzima acrescenta unidades TTAGGG utilizando seu préprio molde intrinseco de RNA, sendo, portanto, independente de um molde externo. A telomerase restaura 0 comprimento telomérico normal na linhagem germinativa de cada geragdo. As células somiticas normais no contém telomerase (o gene correspondente existe nessas células, mas nao se expressa) ~ porém a maioria das células cancerosas a possui. A reativacao da telomerase é um importante passo para a obtengao da capacidade de se dividir indefinidamente. Do mesmo modo, é evidente que a telomerase parece um excelente alvo para uma droga anticancerigena ~ embora os resultados dos testes ainda sejam decepcionantes. Oncogenes historia dos oncogenes comega com as investigagbes sobre os virus eancerigenos, na década de 1970. Os virus jamais causam cancer da maneira como causam uma gripe ~ 0 ‘ncer nunca ¢ infeccioso, e nenhum virus causa cancer em cada pessoa infectada, No éentanto, alguns tipos de cancer, em humanos e animais, estao associados, de modo cat sal, & presenca de determinados virus — por exemplo, o cancer de colo uterino esti asso ciado a0 papilomavirus humano, Em laborat6rio, os retrovirus de transformacao aguda puderam ser recuperados de certos tumores animais, Esses vitus nao eram infecciosos, ‘mas eram capazes de transformar eficientemente as células cultivadas em células que, «quando transplantadas para animais receptores, formavam tumores. Os retiovirus tém uum genoma de RNA muito simples, consistindo em apenas trés unidadles de transcrigao (Figura 12.4), Quando os genomas dos retrovirus de transformagao aguda foram anaisa dos, percebeuse que eles contém um gene extra, 0 oncogene. Varios oncogenes foram idemtificados por meio de estudos desses virus, sendo denominados com os mesmos rnomes dos tumores animais dos quai os virus foram isolados(vejaTabela 12,1). Outros ‘oncogenes foram descobertos mediante identificacio de fragmentos de DNA de células tumorais, que podiam transformar as células normais de camundongo em cultura de tecidos, levando-as a crescer de maneira similar as células tumorais. (a) CGENOMA DE RNA COM 8.500 nt TR Gap Pol fw oR nus. O genoma de RNA abrange trés unidades de transcriao, pole env. Hérepeticdes terminals curtas (TR). (b) Um retrovirus de transformacao aquda, tum erro casual de processamento, parte do genoma viral fl substituida por um proto- ‘oncogene celular Sua superexpressao ou suas mutacbes aleatorias podem tornar oncogénico ese gene celular, quando o virus entrar em uma célula hospedeira, Os genes vitais serdo par: Imente deletados, eo vitus sera incapaz de se repicar.300 ANDREW READ & DIAN DONNA! ‘Tabela 12.1 Oncogenes virais e seus correspondentes celulares Proto-oncogene celular Gene _ Origem animal Localizagio _Funcéo ‘ABL——Leucernia murina qa Transdugao de sina (tiosinoquinase) (carmundongo} de Abelson Ro82 17921 Transdugio de sinal ‘ave (galinha) (trosinaquinase teceptora) FES Virusdosarcomatelino (gato) 15426 Transducio de sinal (trosinoauinase) FMS Leucemiarmurina 533 Trosinoquinase eceptora d (camundongo) de Friend Mcsr HAAS — Sarcomaderatode Harvey 11155 ___Transdugio de sinal(pequena GtPase)* KRAS Sarcoma de camundongo de 12p12 Transdugaa de snal(pequena Kirsten GTPase) MYB — Micloblastose de ave 6922 Controle da transcrigao (oroteina (galinha) nuclear MYC Mielomacitose de ave 8924 Controle da transcrigdo (orteina (galinha) nuclear) SiS Viusdosarcomasimiesco22q12 Cadela 8 do fator de crescimento (macaco) plaquetsrio SAC Sarcomade galinhade Rous 20q12 Transdugdo de sina tirosinoguinase) Fide MCSE fatorestmulador de colonia de macofagos GTPase, quanosinafosatase Essas descobertas provocaram um breve impeto de especulagao de que todo tipo de cancer poderia resultar de infeccao por virus portadores de oncogenes, portanto pode- ria ser evitavel por meio de vacinagao, Essa iia ilusoria perdu sua intensidade quam do se descobriu que as células normais continham homélogos dos oncogenes virais Na verdade, alguns virus complexos contém oncogenes especificos de virus, mas os retrovirus de transformagio aguda sao, de fato, vetores de transducdo: captam os genes aleatoriamente de uma célula infectada e os liberam na préxima célula que infectam. O gene transduzido substitui parte do genoma viral normal, de modo que esses vitus tém replicagao deficiente, Evidentemente, deve haver alguma diferenca entre o oncogene no virus, que transforma as células, ¢ a versio celular normal, que nao faz isso. Os oncogenes virais s20 versbes ativadas dos genes celulares (proto-oncogenes). Esse termo, muitas vezes, é ignorado ha literatura cientifica atual, e os genes so, em geral, simplesmente denominados on- ‘cogenes ~ porém a diferenca entre as formas ativadas (oncogenes) ¢ as nao-ativadas (proto-oncogenes) é crucial. Funcao e ativacao dos oncogenes ‘Uma grande revelacio para o conhecimento molecular da carcinogénese ocorreu quan- do as fungdes normais dos oncogenes celulares foram identificadas, a partir do inicio da década de 1980, Como a Tabela 12.1 mostra, as verses normais, nao-ativadas, dessesGENETICA CLINICA 301 genes tém papel no controle da protiferagao celular. Conhecida sua fungao normal, & inteiramente compreensivel que as versbes ativadas patogenicamente de tais genes devam ser oncogénicas.& ativagao envolve um ganho de fungao, que pode ser obtido de varias maneiras. ‘+ Mutacdes pontuais - como sempre, um ganho de funcao necessita de uma mutacao especifica, Por exemplo, o cancer de bexiga pode ter a mutacio p.Gli12Val no (pro- to-Joncogene HRAS, Os trés genes RAS humanos (KRAS, HRAS e NRAS) codificam pe- ‘quenas GTPases que ativam uma cascata de sinalizagao intracelular (RAS —> RAF > MEK — MAPK), provocando mucancas na expressio génica. As mutacoes de ganho de fungio produzem uma versao hiperativa da GTPase, que desencadeia a expres: sao excessiva dos genes-alvo, * Amplificagao ~ alguns tumores contém muitas c6pias repetidas em tandem de on- cogenes, as vezes na forma de pequenos cromossomos adicionais, outras vezes como duplicagoes dentro de um cromossomo. 0 oncogene MYC, por exemplo, esta freqiientemente amplificado em tumores. * Rearranjos cromossomicos — podem reunir éxons de dois genes distantes, formando uum novo gene quimérico (gene de fusd0). Como jé foi mencionado, as células cancerosas usualmente tém muitas alteragdes cromossomicas. Muitas pesquisas cuidadosas foram dedicadas a identificar as alteragdes que sao especificas de de- terminados tipos de tumores e diferencié-las da grande quantidade de alteragoes aleatérias. A maioria das alteragdes foi identficada em leucemia, que € mais Fcil de estudar do que os tumores s6lidos. A Tabela 12.2 fornece exemplos, ¢ 0 Quadro 12.3 ilustra um caso bem conhecido. Esses rearranjos sao excepcionalmente inte- ressantes, porque a clonagem dos pontos de quebra revela os genes quiméricos e foi um caminho para a descoberta de muitos oncogenes. Alguns genes estao en- volvidos em muitos rearranjos diferentes ~ 0 gene MLL, localizado no cromosso- ‘mo 11423, foi observado com mais de 30 parceiros de fusao diferentes em pacien- tes leucémicos. Os testes para os genes rearranjados especificos constituem uma Parte importante do diagndstico molecular do cancer. Muitas vezes, como no caso da familia Tierney (Caso 20), a definigao de um oncogene quimérico proporciona uma orientacao para o prognéstico e o tratamento. As pesquisas sobre a funcao do gene quimérico também fornecem um rumo importante para a compreensio 4a biologia dos tumores. * Um rearranjocromossémico pode influir na regulagdo da expressao de um oncogene, trans Portando-o para uma regido da cromatina com muita atividade transcricional, 0 «aso cléssico € o linfoma de Burkitt, um tumor infantil que afeta particularmente a mandibula e € encontrado com maior fregligncia na Africa, Sua incidéncia est associada a infecgao pelo protozoario Plasmodium falciparum (causador da mala) € pelo virus Epstein-Barr (causador da mononucleose infecciosa). As células tumorais tém uma translocagao reciproca balanceada caracterstica, adquirida somaticamen- te, t(8:14)(q24:932), que & mostrada na Figura 12.5. 0 efeito dessa translocacdo & mover 0 oncogene MYC do cromossomo 8 para as proximidades do gene IGH, da cadeia pesada da imunoglobulina, no cromossomo 14. Ao contrario da maioria dos Fearranjos especificos de tumores, essa mudanga nao cria um gene quimérico, No entanto, nos linfécitos, mas nao em outras células, 0 gene IGH mostra um nivel muito alto de expressio. Por iss0, 0s lnfcitos, porém ni as demais células com a translocagio, apresentam uma superexpressao do oncogene MYC, O resultado é um linfoma. As vezes, uma translocagao alternativa transporta 0 oncogene MYC para as regides dos genes das cadelas leves (kappa ¢ lambda) da imunoglobulina, ocaliz das nos cromossomos 2 ¢ 22, respectivamente.302 ANDREW READ & DIAN DONNA! Figura 12.5 Linfoma de Burkitt. {al Histologi:(b)Carotipo que mostra a translocacSo caracteristica 8:14 Também estdo presentes ~alteraces cromossbmicas adicionais, como ocore usualmente nas neoplasas. Reproduzido de ‘Molecular Cancer, 2: 20; ©2003 Duensing et al; com permissio de BioMed Central Lt. Tabela 12.2 Rearranjos cromossémicos balanceados especificos de tumores, que criam genes quiméricos 22n13913) BMSIMKL Leucemia megacarioblasts aguda FAB 12131935914 pacirR Falbdomiossarcoma aheolr 1@@(p21a12) PLAGY/CTINBS ‘Adenoma pleomorico de glands savares inw(q21426) seniyevt AN sem matuagio FAB-M!) a1 |qatia23) MUAFE ALLinfoma lnfobléstico v6 nI@e7.923) MULT ‘AML FAB-MA) 1,1 1)p22023) MUL/Aro ALLinlomalnfbiéstico a119N@23p13) user AlLMinfomalinoblstico wwANYpISPIS) NUPSEVHOXAT, HOXA13, HOXAD AML. com maturagdo (FAB-M2) 1@22¥e34010 scevagt Leucemia miléide crdnica wc 14yq13932) seven Leucemialinfoctia cronica linfoma de cul do rmanto eastmiqe2at2) PMUIRARA Leucemia promieocticaagude FAB-M3) w26xqt3p!1 Fusio003 Lipossarcoma inv(v6npt3422) caravan ‘ANIL FAB-MA) {0618Xp1191) ss18/S5H, 590, 5x4 sarcoma sinovial in4t8y@32920) sc8c12 Linfoma focular 111220013922) ETV6 (TEL/RUNOA 4) AALLAinfoma linfobstco @2mVq22022) BUNKYETO AML. com maturagSo (FABM2) ‘Joh ted/gannelnih.gov/Chromosoimes/Rec urentAberations para um grande banco de dados de rerranjos,estabelecdo peo Dr Fl Mitelman. Os reararos esto particulatmente defnidos em leucemiase lnfomas porque nessas conde as cAulas em gera so monoclonal e mei suscetvesbandlse Grogenética do que as dos tumoressldos AL, leer infoblasica aguda; AML eucemia melbiéstca aqua; AMML leucemi mielomenoctca aque.0 cromossomo Philadelphia e o gene quimérico BCR-ABL Os linfocitos de 90% dos pacientes com leuceria mielside cténica (CML) contém um pequeno cromossomo anormal, 0 cromossomo Philadelphia (Ph ) (Figura 1). um aspecto sufi- cientemente constante da doenga, para tornar questiondvel 0 diagnéstico de CML em sua auséncia, Mostrou-se que 0 cromos- somo Ph’ é um produto de uma translocago reciproca balan cceada 922: (9:22)(q34.1;q1 1.2) juncéo da translocagao cria tum novo gene quimeérico no cromossomo Ph’, mediante uniao dda parte 5'do gene BCR, do cromossomo 22, com a parte 3'do {gene ABL, do cromossomo 9, O gene BCR-ABL resultante contém sempre 0 éxon 1 do BCR e, usual mente, os prdximos 10 éxons, Unidos aos éxons 2-11 do ABL (Figura 2) © ABL é um conhecido oncogene que foi identificado,inicial mente, em um retrovirus de transformacao aguda, isolado do sarcoma de rato de Abelson (Tabela 12.1), Seu produto ¢ uma tirosinoquinase que faz parte de um sistema de sinalizacao que ccontrola 0 crescimento celular, A atividade da quinase é forte- mente controlada, talvez, em parte, pelo dominio codificado, pelo éxon 1. O gene quimérico é transcrito e traduzido; seu produto é uma tirosinoquinase que é naturalmente ativa. Esse GENETICACLINICA 303) eeeeke | ub ii #8 8348 83 ‘ $8 5k ab a8 BU aR seas $6 Figura 1 Cariétipo de metafase com 119;22). (Os cromossomos anormais 9 e 2 (cromassomo Phiiadelphia) estio no lado esquerdo de cada par cortespondente. Foto gentlmente cedida pela De, Christine Harison, Unversity of South ampton, ‘ganho de fungo.em um importante controle do crescimento poderia, evidentemente, desviar uma célula para ‘um crescimento descontrolado, 4ty I Yt rin i | ce 934 (cROMOSSOMOPH) Figura2_Formagio do gene quimérico BCR-Aal nil (0s genes BCR e ABl se unem, formando 0 gene quimérico BCR: ABI. lacaizado no cromossomo Philadelphia (Ph').0 ponto cde quebra em 8CR pode situar-se em qualquer um dos vétios introns. Conforme mencionado no Capitulo 8, devido a essa tirosinoquinase anormal ser to caracteristica da leuceria rmielide crénica (CML, uma droga que a tem especificarnente como alvo tem-se mostrado extremamente eficaz para induzir a remisso em pacientes com CML. Genes supressores de tumor ‘As raras formas de cancer hereditirio foram imensamente importantes para aumen- tar nossa compreensao da carcinogénese. Em 1971, Alfted Knudson formulou uma hipotese sobre a relagao entre as versbes hereditiria e esporidica de um cancer. Em304 ANDREW READ & DIAN DONNAI sua hipétese, dizia que os estigios iniciais determinantes do ritmo da carcinogenese cexigiam que a célula fundadora de um tumor softesse dois “hits”, golpes ou eventos ~ que poderiam ser simples mutacdes ou alguma outra alteracio genética. Nos can cetes esporaidicos, esses eventos eram aleatérios, cada um com baixa probabilidade de ocorténcia, Na versio familiar, um dos eventos era hereditaria, Todas as células de tuma pessoa suscetivel continham um evento, de modo que s6 era necessatio que uma célula do tecido-alvo sofresse um segundo evento, para que o tumor se desenvolvesse. A suscetibilidade familiar era herdada de um genitor como uma caracteristica domi- ante. O fenotipo celular que possibilita a uma célula iniciar um tumor € recessivo, necessitando de dois eventos para isso (esse é um lembrete itl de que a dominancia ea recessividade sio propriedades dos fenétipos, nao dos genes e das mutagdes; veia Figura 1.13, no Capitulo 1) Knudson formulou sua hipétese em relagao ao retinoblastoma (RB), um tumor infantil rato da retina, © RB pode ser unilateral ou bilateral, e uma observagao persuasiva adi ional era que, enquanto a forma familiar fregiientemente ¢ bilateral, a esporddica é ‘sempre unilateral. Uma abservacao semelhante pode ser feita a respeito do cancer de ‘mama, No RB familiar, as vezes existem tumores miltiplos independentes em um dos olhos. Evidentemente, nas pessoas com RB familiar, oS retinoblastos tém uma forte tendéncia a se tornar tumorig@nicos ~ embora considerando o tamanho da populacao, de células-alvo, a probabilidade de tal transformagao é compativel com as freqiiéncias de mutagées tipicas (Figura 12.6). HeReOTARIOS eee zB OA E eos ae ue todas as clas contémuma mutacio gy ndadora de tumor ‘segunda mutacae: rutagbo somstica ‘t robablidade probabildade na Figura 12.6 Relagao entre as formas hereditaria e esporédica do mesmo tumor. CO tecido-alvo contémn células, a probabildade de uma célula softer uma mutago de perde de funcao no gene supressor de tumar € Comprovando a hipotese de dois eventos Em 1983, um artigo inovador de Cavenee et al. mostrou como a hipétese de Knudson para o RB poderia ser confirmada, e estabeleceu, para os 20 anos subseqtientes, a agenda de pesquisas sobre os canceres familiares. Havia uma suspeita de que, no RB, 0s eventos poderiam ocorrer no cromossomo 13, em vista de uma familia cujo RB hereditario co-segregava com uma alteragao nesse cromossomo. Cavenee ¢ seus colaboradores coletaram células e DNA de tumores de pacientes com RB esporadico,GENETICA CLINICA 305 Usando uma combinacao de anélise citogenética e transferéncia de Southern com sondas do cromossomo 13, procuraram diferencas entre as células normais e as tu- ‘morais dos mesmos pacientes. A analise citogenética mostrou que alguns tumores tinham cépias extras ot ausentes do cromossomo 13. As transferéncias de Southern ‘mostraram que, em alguns casos, onde o DNA normal (extraido do sangue) de um paciente era heterozigoto, para um determinado polimorfismo o tumor era homo- zigoto. Correlacionando as observacdes citogenéticas e a ocorréncia de perda da heterozigose em tumores individuais, os pesquisadores foram capazes de elaborar ‘uma descricao convincente dos mecanismos cromossomicos que produzem um dos eventos de Knudson (Figura 12.7). Um trabalho posterior acrescentou-se a essa descrigdo, mostrando que, nos casos he- reditarios, a fungao do segundo evento era sempre para eliminar a seqligncia normal. As células tumorais conservavam apenas a seqliéncia que o paciente havia herdado do lado afetado de sua familia, Alguns anos mais tarde, quando 0 gene RBI foi clona: doe a PCR tornou possivel sua varredura para evidenciar mutagdes, foram identifica- ddas diversas mutacdes de perda de funcao no alelo de suscetibilidade hereditaria ao RB. As mutagdes somiticas adquiridas também puderam ser demonstradas no gene tipo selvagem (gene normal), em tumores que nao continham alteragdes cromoss6- micas relevantes. a 8 . PERDA Dc DELEGKO MUTAGAQ PONTUA FECOMBINACAO (CROMOSSOMO NORMAL MTOTICA Figura 12.7 Mecanismos genéticos no retinoblastoma. AA mutacao inical pode ser hereditria ou somstica, Os mecanismos A, 8 D resultam em perda da heterozigose (em 8, somente para marcadores préwimos ao lacus #8; em D, apenas para marcadore: 1g-0¥er) No estudo original de Cavenee etal, alguns tumotes du ynescente do cromossomo 13, pds a perda do cromossomo normal pelo306 ANDREW READ & DIAN DONNAI 0 trabalho sobre o RB confirmou a existéncia de genes supressores de tumor (genes TS)" e mostrou que a hipétese de dois hits ou eventos explicava a base das sindromes de cancer familiar. Sugeriu dois caminhos para a identificagao dos genes * identificacao das regides cromossOmicas de perda da heterozigose em tumores es- Poraidicos, comparando-se o DNA tumoral e constitucional(sangtiineo) do mesmo paciente ‘+ mapeamento e clonagem posicional dos genes mutados nos canceres familiares Aanalise da perda da heterozigose produziu resultados desapontadores aps exaus tivo trabalho. O problema € que os tumores inteiramente desenvolvidos contém tuma colegio heterogénea de células com tantas alteracdes cromossOmicas, que € dificil obter padroes nitidos da perda especifica de uma pequena regiao cromos- sémica, A introdugao da hibridizagao gendmica comparativa de microarranjo (CGH de microarranjo: veja Figura 4.7, no Capitulo 4) promete tornar mais produtiva essa linha de investigagao, pois pela primeira vez sera fornecida uma visdo genomica am pla das alteragdes de um tumor. Por enquanto, a abordagem de ligacao em familias tem permitido a identificagao da suscetibilidade hereditaria em muitas sindromes de cancer familiar. Os tumores esporddicos também podem ser investigados quanto 4 mutagBes no gene responsivel por essa suscetiilidade, tao logo esse gene seja conhecido, Desse modo, jé foi identificado um niimero significativo de genes TS (Tabela 12.3) Tabela 123. Sindromes de cancer familiar com mutacoes hereditérias em genes supressores de tumor NameroOMIM Gene __Localizasao inoblastoma 180200 Ra Taq Poliose adenomatosa familiar 175100 aC 5921 Cancer colorretalhereditaro sem palipose 120435 Ms 22 120436, Mu 321 Cancer de mama familar 113708 BRAT 2 00185 BREAD qi? Sindrome Lifreumeni 151623 133 7p13 Sindrome de Gorin 109400 pic 9922 Ataxia-telangiectasia 208600 am 11q93 Neurofibromatose tipo | Net v7qtt Neurofbromatose tipo 2 101000 2 22qt2 Doenga de von HippelLindau 193300 vit 3 Neoplasia endécrina mip tipo 1 131100 MENT igi Neoplasia endéctina miitipl tipo 2 171400 fer oq Melanoma familiar 155601 op2 N.de T. Do inglés, tumor suppressor genes.Figura 12.8 O ciclo celular e seus pontos de controle. GENETICACLINICA 307 Fungoes normais dos genes supressores de tumor Os genes TS agem reprimindo o crescimento celular e esto envolvidos em uma varie- dade de pontos de controle e outros tipos de regulacao, Duas das principais dreas sao 0 pontos de controle do ciclo celular ¢ o controle da apoptose. Em um conjunto de células em crescimento continuo, o ciclo celular pode ser dividido ‘em quatro fases (Figura 12.8). A progressao ao longo do ciclo é controlada por uma série de verificagdes, que incluem: * 0 ponto de controle G1-5 — as células nao podem iniciar a replicagao do seu DNA até que todo o dano desse tenha sido reparado; as células cujo dano € irreparavel sa0 estimuladas a cometer suicidio por apoptose * os pontos de controle da fase S~ operam enquanto a replicagao do DNA esta em anda- ‘mento; 0s diferentes pontos de origem de replicacdo tornam-se ativos em tempos diversos, durante a fase S, e os pontos de controle impedem o inicio da replicagao ‘em novos pontos de origem, enquanto houver dano no DNA * 0 ponto de controle G2/M ~impede que a célula inicie a mitose enquanto houver dano ngo-teparado no DNA * 0 ponto de controle do fuso ~ impede a separacao das cromatides-irmas na anéfase, até que cada centrSmero cromoss6mico esteja ligado as fibras do fuso 0s tr8s primeitos pontos de controle representam diferentes respostas a jusante downstream), do maquinatio que detecta 0 dano no DNA, especialmente as quebras «da duplahélice. Esse maquinério envolve varios genes TS. Os mecanismos dos pontos de controle sio fortemente conservados ao longo da evolucao. Grande parte de nos sa compreensio sobre os controles do ciclo celular humano origina-se de estudos de organismos-modelo, especialmente leveduras. O Prémio Nobel de Medicina de 2001 foi concedido a Leland Hartwell, Tim Hunt e Paul Nurse por seu trabalho em desvendar es- ses controles”. 0 avanco ao longo do ciclo € particularmente controlado pelas ciclinas, ‘uma familia de proteinas cujo nivel na célula flutua de acordo com a fase do ciclo. As MTOSE ase t < eee es ponto de ‘controle GM FASE Pe Ponto de contiole controle GIS fase FEPLICAGAO DONA *N-deT. Voce pode ler seus relatos de como ofizeram em: itpsnabelrize.orgmcinglaeates2001,308 ANDREW READ & DIAN DONNA’ ciclinas funcionam ativando uma série de proteinoquinases, as quinases dependentes de ciclinas (CDKs)*, Por outro lado, inibidores especificos de CDKs, conhecides como CKis™, contrapdem-se as ciclinas. (0 ponto de controle GI-S envolve, em particular, um elenco impressionante de genes TS ¢ seus produtos (Quadro 12.4). * A proteina RB (pRB) liga-se a E2F, um fator de transcrigao que ativa a expressao de muitos genes necessiiios para a passagem da fase G1 para a fase S, inibindo-o, No centanto, a fosfarilagao da pRB, pelas CDKs, inativava e libera E2F ativo. A proteina 53 (p53), 0 produto do gene TP53, normalmente ¢ restringida e degradada pela proteina MDM2. A p53 estimula a transcrigio do gene MDM2, regulando dessa forma sua propria atividade em um nivel muito baixo. Varios sinais inativam MDM2, permitindo que o nivel de p53 aumente. Dependendo das circunstancias, isso pode fazer 0 ciclo celular parar, por meio da acao da proteina 21 (p21), ou marcara célula para apoptose. A p53 € inativada por mutagoes somiaticas, em uma alta proporgio de todas as células cancerosas; mutagdes hereditarias causam a sindrome de cdncer familiar Li-Fraumeni Oponto de controle G1-S [A progressio ao longo do ciclo celular é governada essencialmente pela cisponibilidade de proteinas ciclinas lespecifcas, ssas proteinas ativam as CDKs, As quinases atuam como efetoras,fosforilando uma série de alvos situados ajusante; S30 requladas pela disponibilidade de suas ciclinas afins e por varios inibidores. A progress3o dda fase G1 para a fase S é comandada pelas ciclinas De E, com suas quinases. Uma rede complexa de controles camo Le} ‘a montante modula sua atividade. A figura abaixo mostra somente parte dessa rede; mais detalhes podem ser | encontrados em qualquer manual de biologia celular. won) | sea ee) 1 ey cy ; za ‘lguns dos controlese algumas das interagdes que comandam 0 progresso GI-S. Os genes TS identifiados por meio de cénceres familiares s40 meostrados em vermelho. = mostra uma ac3o inbidora, —P mostra uma acéo estimuladora, TN. de To inglés independent kinases © N. de. Do inglés, vin dependent kissinGENETICACLINICA 309) EXON 20E pl6nNKaa GT CAT GAT GAT GGG CAG CGC CCG AGT GEC GGA GcT GCT GcT Gc ON 2DE pIa/AnF GIC ATG ATG ATG GGC AGC GCC CGA GTG GCG GAG CTG CTG CTG CTC Val Met Met Met Gi Ser Ala Ag Val Alb Gh leu Leu Leu Lew Figura 12.9 0 gene CDKN2A codifica duas proteinas completamente diferentes, p16 p14”, ambas funcionando no controle do ciclo celular O gene CDKNZA & com muita freqliéncia, deletado nas céulas tumors, ARF, de alter Shame, fase de letra aternativa, * pl6ep14™ sao produtos do mesmo gene, CDKN2A (Figura 12.9). 0 uso de promo- tores e primeitos éxons altemativos leva a seqiiéncia codificadora do éxon 2 a ser lida em diferentes fases de leitura para os dois produtos, que terminam nao com- partilhando aminoacidos homologos. E notavel que ambas as proteinas funcionam hho controle do ciclo celular. A delegao do gene correspondente é um meio muito cficiente de perturbar esse controle, sendo uma ocorréncia comum nas células tu- morais. A p16 € uma inibidora de quinase dependente de ciclina; suas mutagées hereditatias sao encontradas em alguns melanomas familiares, afetando somente © produto p16 do gene. As mutagies hereditarias que afetam somente p14” sao ‘muito raras, mas 0 promotor de p14 freqiientemente é silenciado epigeneticamen: te nos tumores. * A proteina ATM pode ser o primeiro sensor das quebras da dupla-hélice de DNA. A ATM ativada fosforila varias proteinas, inclusive MDM2 (inativando-a), p53, CHK2, BRCAI e as proteinas MREI1/RADSOINBS do complexo de reparo do DNA (sendo. todas ativadas por fosforilagao). E digno de nota que diversos genes TS codificam proteinas extremamente grandes. Os exemplos incluem as proteinas codificadas pelos genes APC (2,843 residuos de aminodcidos), ATM (3.056 residuos), BRCAI (1.863 residuos), BRCA2 (3.418 residuos) € NF (2.839 residuos). Nem todos os genes TS codificam proteinas grandes (os dois produtos do gene CDKN2A tém apenas 156 e 173 residuos de extensio, respectiva- mente), como nem todas as proteinas grandes tém algum papel no cancer (algumas das maiores proteinas conhecidas sao as proteinas estruturais musculares, como a distrofina, com 3.685 res{duos, e a titina, com 19.946 residuos). Todavia, a lista da Tabela 12.3 sugere que a perda de fungao de genes que codificam proteinas nao- estruturais muito grandes & um evento inicial freqiiente na tumorigénese. Essas pro- teinas seguidamente tém, de fato, um papel estrutural em nivel molecular, embora hao em nivel microsc6pico. Interagem com outras numerosas proteinas ¢ servem como andaimes para formar as grandes maquinas de multiproteinas que desempe- inham muitas fungdes celulares. A perda de funcdo, em tais pontos centrais das redes de interagdes intracelulares, pode ser um meio poderoso de perturbar as fungoes: celulares normais.310 ANDREW READ & DIAN DONNA Um solugao desesperada: a apoptose A apoptose, também conhecida como morte celular programada, é um processo ativo ‘especifico que é iniciado por varios estados celulares anormais, constituindo tam- }bém uma parte importante do desenvolvimento normal (por exemplo, para separar ‘os dedos da mao em um embrido em desenvolvimento). Esse mecanismo envolve a ativagdo de uma cascata de enzimas proteoliticas, denominadas caspases. Tais enzimas sao ativadas por meio de perturbagdes das mitocdndrias, com liberacio, do citocromo C, ou de acdes da proteina FAS associada aos chamados receptores da morte. Essas potentes maquinas suicidas naturalmente precisam ser mantidas sob controle rigoroso, no qual ¢ intensamente envolvido o circuito regulador da apoptose, Entre as condigdes que podem desencadear a apoptose estdo 0 dano irreparvel no DNA eo excesso de sinaizacio mitogénica. A proteina p53 é um elo central nesses processos. Eativada pela fosforilagio de residuos especiicos e/ou inaivacdo de seu inibidor, MDM2, Como & apresentado no Quadro 12.4, a p53 estimula a expressao da protena p21, caja fungao€ indir a suspensio do cil celular A p53 também estimula 2 transcrigio de virias proteinas que esto envolvidas nas rotas da apoptose medidas pelas mitocondriase pela proteina FAS. Devdo a seu papelchave em todos esses pro- ‘cessos, a p53 recebeu a denominagao de “guard do genoma".O gene 7P53 é um dos mais mutados em todos 0s tipos de cincer. 12.3 Investigagées de pacientes + Jason, menino de 4 anos ‘A leucemia linfoblistica aguda infantil (cALL)* & uma neoplasia de células precursoras ‘= Palidez com equimosesextensas | dos linfécitos B, ou células-tronco. Cerca de 25% dos casos tém uma translocacao reci- etaquicardia roca 12:21, com pontos de quebra em 12p13 € 2142.3. Na jungao da translocacio, 0 ' Leucemia linfoctica aguda? segmento 5° do gene TEL (ETV6) e quase toda a seqiiéncia codificadora do gene AML # Bxame de medula éssea einves- (RUNX1 ou CBFA2) s20 reunidos, criando um gene de fusao (gene quimérico). Os expe- tigagao diagndstica rimentos de perda de funcdo em camundongos mostram que tanto o gene TEL quanto + Analise da enzima TPMT pre (0 AML sao criticos para a hematopoiese. Cada gene codifica um fator de transcrigao, femedtena EPA AD (0 gene AML! codifica a subunidade alfa do fator de ligacio central, um regulador da SUSAR formacao das células-tronco hematopoiéticas. A fusdo inibe a atividade transcricional normal mediada por esse fator, resultando em alteragio da capacidade das células-tron- co hematopoiéticas para auto-renovagio e diferenciacao. Os genes TEL ¢ AML sao en- contrados como parceiros de fuso com uma variedade de outros genes que codificam quinases ou fatores de transcricao, nas leucemias infoide e miele. A fusio TELAML? parece ser exclusiva da ALL de células progenitoras de células B. {As posigdes dos pontos de quebra ce TEL/AML, nas regides cromoss®micas subtelo- méicas de coloracio clara, licultam a deteccio da translocagao 12:21 por melo de agem convencional, por isso, para seu diagnéstico, a técnica uilizada é a FISH. As células interfisicas de Jason foram hibridizadas com diferentes sondas coloridas de FISH para os genes TEL € AMLI. Um dos sinais ou pontos coloridos que marcam os ‘genes TEL situot-se sempre adjacentemente a um dos pontos de AML!, confirmando a presenca do gene de fusio TEL/AML! (Figura 12.10). Essa era uma boa noticia, pois 09 individuos com rearranjos de TEL geralmente mostram uma excelente resposta a SN. de, Do inglés, childhood acute ymphoblestic leaemioFigura 12.10 Metafase como. gene de fusdo TEL-AML. an quimioterapia. Como deserito no Capit 9 8, 0s tratamentos de inducao e consolidacao foram bem-sucedidos, apesar dos problemas iniciais com o tratamento de manutencao de longo prazo. Jason tinha deficiéncia de tiopurina metiltransferase, o que o tornava hipersensivel a uma das drogas usadas, a 6-mercaptopurina, Com uma close satisfatoria mente baixa dessa droga, o menino continuou livre da doenga e sadio. g AsO 23 Familia Wilson an . Uma ver que, nos EUA ou no Reino Unido, uma em cada oito mulheres provavelmente desenvolverd cancer de mama, em algum momento de sua vida, nao € surpreendente {que muitas familias t snham mais de um caso dessa doenga. Entre as mulheres afetadas, 5-10% tém mae ou ima com cancer de mama e, aproximadamente, o dobro de afetados entre os parentes em primeiro ou segundo graus. Muitos desses casos representam coincidéncia casuais, mas a anélise estatistica sugere que, em 5-10% das familias, essa condigao é verdadeiramente familiar. Em 1990, a andlise de ligacdo em uma grande colegao de familias com casos miltiplos indicou um possivel locus de suscetibilidade cancer de mama de inicio precoce, no cromossomo 17. Apés quatro anos de tra balho intenso, foi identificado o gene 8 de analise das familias negativas para 0 BRCA1 conduziu a identificacao do gene BRCA2, no cromossomo 13, Os genes BRCAI ¢ BRCA2 sto extensos (Figura 12.11). 0 BRCAI tem 24 éxons, que codificam uma proteina com 1,863 aminodcidos, 0 BRCA2 tem 28 éxons, e sua pro- teina, 3.418 amin sacidos. Conforme mencionado anteriormente, proteinas tao gran- des provavelmente tém fungdes multiplas e muitos parceiros interativos. Nossa com: preensao sobre os papéis dessas proteinas na célula ainda € bastante incompleta, Entretanto, uma de suas principais fungdes é a deteccaio do dano do DNA ¢ a sinali zagio de sua presenca aos pontos de controle, Existe evidéncia, também, quanto ao nscrigdo. Os genes BRCAI e BRCA2 comportam-se como genes TS, nos casos familiares que freqiientemente envolvem seu papel no controle da tr uutacdes hereditarias de perda de fungao e tumores com perda ou inativagao do alelo normal remanescen: . No entanto, curiosamente, é mui tenham mutagdes nos genes BRCA1/2, em (0-15% desses tumores silenciem epi: geneticamente 0 gene BRCAI. Pode ser que, embora as células com duas mutacoes de BRCA1/2 tenham um potencial tumorigénico significativo, as que possem apenas uma mutagdo nao tenham aumento desse potencial em relacao as células normais, Nesse caso, podem existir rotas alternativas, com probabilidade mais elevada de caw312 ANDREW READ & DIAN DONNAI sarem um tumor esporadico. Sustentando essa hipotese, os estudos de expressio, por meio de microarranjos, mostram diferentes padroes de expressio génica nos tumores de mamas esporddicos sem envolvimento de BRCA1, comparados aos que tém a mutacdo ou o silenciamento de BRCAT. INI tt NIT IA II Figura 12.11 Estrutura dos éxons dos genes BRCAT e BRCA2. Nenhum dos genes, coma nenfuma de suas proteinas, compartha qualquer homologia;0 est {de expressio por meio de microarranjos, mostrade na Figua 12.16, sugere que estejam envolvidos fem diferentes rotasintracelulares. Ambos 0s genes tém um éxon central muito grande (com 3426 24932 pb, respectivamente) (0 Centro de Informagdes sobre 0 Cancer de Mama do Instituto Nacional de Pesqui- sas sobre o Genoma Humano (Breast Cancer Information Core of the National Human Genome Research Institute; https/research.nhgri.nih,gowbic) lista aproximadamente 1,500 alteracdes de seqiiéncia do gene BRCA! e 1.800 do gene BRCA2, Um nimero desconhecido dessas alteragdes [de seqiiéncia| ¢ descoberto, coincidentemente, em va- riantes nao-patogénicas. A maioria das alteragoes definidamente patogénicas consiste tem pequenas delecdes ou insergdes com mudanca na fase de leitura, mutagdes no sitio de encadeamento ou delegdes de um ou mais éxons inteiros, Tais alteragdes podem ser identificadas mediante seqiienciamento ou algum dos métodos padronizados para a varredura de um gene (Copitulo 5), porém a deteccio das delegdes de éxons inteiros € melhor quando se usa a amplificacao multiplice de sondas dependentes de ligacio (MLPA; Figura 5.8, Capitulo 5). Como na maioria das mutagdes de finalizacao prematura, 6 esperado que essas alteragbes desencadeiem o decaimento do mRNA mediado por mutacdes sem sentido, de modo que as mutagdes funcionam como alelos nulos, nao prodzindo ou produzindo pouca proteina truncada. 0s judeus asquenazes constituem um caso especial. Nessa popullagdo, so comuns tres mutagdes especificas com mudanga na fase de leitura(c.185deIAG e c.5382insC no gene BRCAI, ¢ €.6174deIT no BRCA2), presumivelmente devido aos efeitos do fundador (Ce: pitulo 10), Um levantamento de 5.318 mulheres asquenazes sadias encontrou 120 (2, portadoras de alguma dessas trés mutacdes. Essa freqiléncia contrasta com a freqiiéncia de 0,2% de todas as mutacoes de BRCAT/2, em mulheres caucasdices nao-asquenazes dos EUA ou do Reino Unido. A alta prevaléncia de tais mutagdes especificas torna rele: vante e relativamente facil de compreender a testagem genética entre as populacdes as- ‘quenazes, Naturalmente, a exclusio das trés mutagdes nao elimina a probabilidade de {que alguma outra mutagao de BRCAI/2, ou uma mutagdo em outro gene, possa colocar as pessoas em alto risco. Outras populagdes, como, por exemplo, os franco-canaden: ses, islandeses e paquistaneses, também tém suas mutacoes particulares, decorrentes de efeitos do fundador. ‘A estimativa do risco vitalicio para uma portadora de uma mutagao varia entre 30 € 85%, ilustrando um aspecto interessante dos testes de suscetibilidade. As estimativas iniciais foram feitas nas grandes familias com casos miltiplos, nas quais foram encon-GENETICACLINICA 313 tradas essas mutagdes primeiramente. Todavia, tas familias foram selecionadas por tetem maior niimero de casos afetados, portant as estimativas inicais de risco provém dle um conjunto tendencioso de familias. Os levantamentos populacionais mostram uum risco menor. No entanto, o isco ainda é substancial, comparado ao risco para as pessoas que ndo contém as referidas mutagdes e possivelmente para as mulheres que particularmente tém uma forte historia familiar de cancer de mama. Por isso, ha uma consideravel demanda de varreduras de mutagdes. Em razao do grande tamanho desses genes e do encontro de mutagdes de perda de fungio em qualquer local, no interior dos genes, a vartedura de mutages toma-se laboriosae de alto custo, Desse modo, 0s «linicos precisam priorizar as familias que necessitam realizé-la,e isso & feito principal ‘mente com base na historia familiar. Os marcadores de mutagdes de BRCAI/2 incluem: * casos com inicio precoce inusual * casos bilaterais (compare com o exemplo do RB) * casos de homens com cancer de mama (particularmente casos com mutagbes de BRCA2) * familias com céncer de mama e cincer ovariano (particularmente casos com muta bes de BRCAT) Nenhum desses aspectos & completamente especifico de cancer de mama devido a mi tagdes dos genes BRCAI/2, mas os indices de rsco foram caleulados com base nesses fatores. A Tabela 12.4 mostra um desses indices (Evans eta, 2004), Os indices possibi- litam que os médicos avaliem a probabilidade de que algum caso determinado tenha uma mutagio de BRCAT/2 Tabela 12.4 Sistema de escores para avaliar a probabilidade de encontro de uma mutago de BRCA1 ou BRCA2 em uma familia Cancer, idade anos) nodiagnéstico _PontosparaBRCA? —_Pontos para BRCA2 Cancer de mama femining,< 30 6 5 (Cancer de mama feminino, 30:39 4 4 Cancer de mama feminino, 40-49 3 3 Cancer de mama feminino, 50-59 2 2 ‘Cancer ce mama feminino,>5¢ 1 1 Cancer de mama mascuino,<60 StéeexcuirBACA 8 Cancer de mama masculina,>58 5 (se excluir BROAD 8 5 (seexclur BROAN Cancer oveiano,>59 s 5 (se excl Cncer pancretico ° Cncer de préstata,< 60 ° 2 Cancer de préstata,> 59 scores S30 Somados para ado 0 casos familiares compatves coma susceigode Sra, Oescore total pretence epresentar a probabidade (8) de encontto de uma mutaca0. os com permissio de BMI Publishing Gro314 ANDREW READ & DIAN DONNA 'Na familia Wilson, a aplicagao do sistema de escores da Tabela 12.4 a0 heredograma (Figura 12,12) sugeriu a probabilidade de 18% para a existéncia de uma mutacao de BRCA2 e de 15% para a de uma mutagdo de BRCAI, se a pesquisa fosse negativa para RCA, Note-se que nenhum escore é fornecido para o cancer de préstata do avo pater: ro de Wendy, porque, se problema familiar é causado por uma mutagao hereditéria de BRCAI/2, 0 heredograma mostra que esse problema se encontra no lado materno da familia de Wendy. A presenga de cancer de mama e a auséncia de cancer ovariano refor: ‘garam a suspeita dle que essa fosse uma familia de BRCA2. O escore era suficientemente alto para priorizar essa familia para a andlise do DNA. Um corte do tumor extirpado de Wanda foi recuperado dos arquivos do laboratorio de patologia, sendo extraido seu DNA. A testagem finalmente revelou a delegao de um ini co nucleotideo, no éxon 18 do gene BRCA2, no tumor. A delecio do nucleotideo 8.525, no e6don 2.766, criou uma mudanga de fase, levando 0 cédon 2.776 a ser lido como ‘um cédon finalizador. Nesse tumor, nenhuma mutagdo adicional foi identificada, embo- ra no se tenha investigado a perda da heterozigose, uma vez. que nao havia amostra disponivel do DNA normal (sangitineo) de Wanda para comparagao. A presenca dessa ‘mutagao no tumor sugeriu fortemente que essa era realmente uma familia de BRCA2, pois os tumores esporaidicos raramente tém mutagdes de BRCA2. Antes de ser oferecida a testagem de mutagdes aos membros da familia, era necessério descobrir se a mutagao encontrada no tumor era o primeiro ou o segundo evento ~ se fosse o segundo, entio a muta¢ao da familia ainda continiava nao-identificada. Na Nova Zelandia, contatou-se Amy, que, em combinagao com Wendy, concordou em fornecer ‘uma amostra de sangue para os testes. Amy conseguiui que o servico de genética local cextraisse o DNA de sua amostra, uma vez que, ao contratio do sangue, 0 DNA é estivel ‘e pode ser facilmente enviado para todas as partes do mundo pelo correio normal. Para ‘0 centro de genética de Wendy, foi ficil testar a amostra de Amy especificamente para ‘a mutagao €.8525delC, cujo resultado foi positive. Agora que a mutagao familiar havia sido identificada, Wendy, William e Verdnica forneceram amostras de DNA para sua testagem. Nesse caso, novamente, as amostras foram testadas apenas para a mutacao familiar identificada, Os testes mostraram que Verdnica e William sao portadores dessa mutagao, mas Wendy nao 0 é, Wendy naturalmente ficou aliviada com a noticia, mas era importante, em seu acon selhamento, assegurar que ela compreendia que ainda se encontrava na populagio de risco de desenvolver cancer de mama esporidico, e seria sensato participar do progra- ‘ma de triagem por mamografia-padrao quando alcancasse a idade apropriada. Essa era também a oportunidade de salientar-Ihe que o risco de cancer dle mama é fortemente influenciado pelo estilo de vida e que as mulheres (inclusive as portadoras de mutacies de BRCAI/2) podem reducir seu risco em, aproximadamente, 40%, mediante perda de peso e realizacdo de exercicios moderados. Verdnica continha a mutagao, portanto es- tava em alto risco. Suas opcdes incluiam: nada fazer; mudar seu estilo de vida ingressar ‘em um programa de vigiléncia aumentada com realizagao de mamografia anual; ingerir tamoxifeno na esperanga de que essa droga reduzisse seu risco ~ ou, © passo mais Fa- dical - fazer a mastectomia profilatica. Wiliam nao estava em alto risco de desenvolver cancer de mama pelo fato de esse ser raro em homens (seu risco relativo era muito alto, mas 0 risco absoluto ainda era baixo). Por outro lado, ainda que o risco relative de cancer de préstata nos portadores de mutagdes de BRCA2 seja apenas moderado, seu risco absoluto é alto, por isso Ihe foi recomendado fazer regularmente os exames ade- quados. Qualquer filha que ele tivesse também necessitaria de aconselhamento sobre seu risco substancial de cancer de mama,* Histéra familar de problemas intestnais * Polipose adenomatosa familar eno? GENETICA CLINICA 315) © gene APC (OMIM 175100), localizado no cromossomo 5q21-22, foi identificado como a causa de FAP, por clonagem posicional, orientada por desctigdes de um pa- ciente afetado portador de uma delecao intersticial de 5q. Esse gene funciona como tum clissico gene TS. Os casos familiares herdam uma mutagao de APC e somaticamen- te inativam 0 alelo normal em seu tumor. Além disso, diferentemente da situagao dos genes BRCAT/2 no cancer de mama, a mutagao ou a perda de ambos os alelos de APC € uum evento comum inicial no desenvolvimento de canceres colorretais esporddicos comuns (veja adiante}. Aproteina APC é outra proteina grande (2.843 aminoacids) multfuncional. Aparente- mente est envolvida em diversos processos celulares diferentes, incluindo transducao de sinal na rota das proteinas Wnt’, adesao celular e interagdes com o citoesqueleto. A fincao mais claramente relacionada com 0 cancer é seu papel no controle dos niveis de Becatenina (Figura 12.12). A Brcatenina é um co-ativador transcricional que, no niicleo Celular, se associa ao fator de transcricao TCF4 e promove a transcrigao de varios genes- alvo, inclusive o gene da ciclina D1 e o oncogene MYC. Esse oncogene é controlado pelo sistema de sinalizagao da Wnt. Na auséncia do sinal de Wat, a proteina APC forma tum complexo com a axina e a GSK3B, o qual degrada a B-catenina. A sinalizacdo da Wht inibe a formagao desse complexo,liberando a B-catenina para entrar no niicleo. AS amutagdes de APC possibilitam que o nivel da -catenina aumente, independentemente do sinal de Wnt. Os tumores colorretais que nao apresentam mutagdes de APC podem ter mutagdes de ganho de funcao na B-catenina ou de perda de fungao na axina, que presumivelimente tem um resultado final semelhante. ‘As mutagies hereditérias sao quase exclusivamente mutagdes sem sentido (30%) ou de mudanga na fase de leitura (68%). Podem ocorrer em qualquer local na primeira meta- de da seqiiéncia codificadora, mas com sitios quentes mutacionais muito marcantes nos cédons 1061 e 1309. O segundo evento somitico pode ser por perda do alelo out mmutagdo pontual. As mutagoes pontuais somaticas, tanto no cancer colortetal heredi- trio quanto no somitico, agrupam-se na chamada regido de grupamento mutacional, que abrange os cédons 1286-1513 do gene APC. Ha uma relagio muito interessante entre as mutagBes germinativas e as somiticas. A posi¢ao e o tipo do segundo evento dependem da posigdo da mutacao germinativa, Nada similar & observado em outras sindromes de cancer familiar. A proteina APC tem trés médulos de ligagdo com a f-catenina e sete médulos seme- Ihantes de 20 aminodcidos que reduzem os niveis dessa tiltima proteina. A relacio entre © primeito e 0 segundo evento pode ser resumida a seguir (Albuquerque et al., 2002}: * sea mutagdo germinativa produzir uma proteina sem as sete seqliéneias regulado- ras da B-catenina, 0 segundo evento somiitico produz uma proteina que tem um ou, ocasionalmente, dois desses médulos * se a mutagao germinativa produzir uma proteina com um médulo, a mutagao somé- tica geralmente os remove, por truncagao ou perda alélica * em um paciente cuja mutacdo germinativa deixou dois médulos, 0 segundo even- to, na maioria dos seus tumores, foi uma mutacdo pontual que removeu todos os ‘médulos N. de. As protenas Wat regulam muitos processos do desenvolvimento, através da tansducio de s- nas. Uma desss protenas, Wnt-0,aparentemente ajuda a prevent excess de gorda, silenckndo das rmokéculas conhecidas por estimular os comandos genético para a formagao de gordura,conhecida como adipogénese. Fonte: Science, 1 1082000, acesso em 3006/2007316 ANDREW READ & DIAN DONNA ner © secutncis regard eater rho debate da eaten © code ga ina Figura 12.12 A proteina APC e seu papel na regulacao dos niveis da fs-catenina, A proteina APC tem 2.843 residuos de aminodcidos Tes médulos de 15 aminoscidos ligarse 8 Becatenina sete médulos de 20 aminodcdas reduzer o seu nivel APC funciona em um complexo ma axina ea GSKA As mutacbes somaticas agrupamse na reqao de grupamento mutaciona {MCR}. Devido a estrutura 6xor-intron incomum do gene APC, apenas runcacBes na parte verde-cla ro da proteina devem ser eliminadas pelo decaimenta mediado por mutacdes sem sentido, A mairia das mutac6es produz proteinas APC truncadas que so incapazes de se liga avina, mas ainda conse ‘quem se bgara B-catenna e ter alguma capacidade lmitada parareduzHa. Asugestdo evidente é que existe selecdo para um nivel “admissivel” da fungio regulado- ra da f-catenina, Talvez a perda completa deva produzir niveis de B-catenina suficiente- mente anormais para desencadear a apoptose nessas células relativamente normais.. Fssa complexidade depende da estrutura incomum do gene APC (Tabela 12.5), 0 éxon 3 extremamente grande inclui 6.580 pb dos 8.538 pb da seqiiéncia codificadora. Normal- mente, as mutagdes sem sentido e de mudanga na fase de leitura no produiziriam ne- ‘nhuma das proteinas truncadas preditas, devido ao decaimento mediado por mutacoes sem sentido (Capitulo 6). No entanto, os cédons de finalizacdo prematuros no iiltimo &xon de um gene ow no interior dos 50 nt do ailtimo sitio de encadeamento em geral estio livres do decaimento (Figura 6.3, Capitulo 6). A regido de grupamento mutacional ¢ todos os médulos reguladores e de ligacao da B-catenina sao codificados pelo gran- de éxon terminal Espera-se que somente os c6dons finalizadores anteriores a0 ¢édon 640 do gene APC desencadeiem o decaimento mediado por mutagdes sem sentido. As mutagées na extremidade 5° do gene esto associadas a um fenétipo atenuado, com relativamente poucos pélipos. presumivel que sejam verdadeiras mutacoes nulas. Em outros locais, parece provavel que no minimo alguma proteina truncada seja produzida, e suas propriedades determinam a vantagem seletiva do segundo evento Christos Xenakis forneceu uma amostra de sangue, da qual foi extraido 0 DNA para 0s testes de mutacdes do gene APC. Os resultados desses testes mostraram que Christos ¢ heterozigoto para uma mutagdo sem sentido no cédon 1309 do gene APC (p.Glu1309X), Essa € uma mutagao fregiiente da FAP. Tem grande penetrancia, de modo que seus portadores apresentam um risco de quase 100% de desenvolverem cancer colorretal se nao forem tratados. Sua identificagao permitit que os familiares em risco fossem também testados. Demi, mae de Christos, contatou varios parentes de seu tiltimo marido, em Chipre, para thes dar conhecimento do recém-descoberto alto risco da familia. Forecetrthes, também, um niimero para contato com a gene- ticista de Seattle, caso 0 servigo de genética local precisasse usélo, se alguns dos parentes optassem por fazer os testes. Enquanto isso, existiam os dois filhos jovens de Christos para considerar. Cada um tem um risco de 50% e precisaria de exames anuais de sigmoidoscopia, a partir dos 10 anos, para investigar o desenvolvimento de Pélipos. Tudo isso poderia ser evitado se tum exame de DNA mostrasse que as criangas no tinham herdado a mutacao. Surgiu a diivida quanto a testé-las imediatamente ou adiar a testagem. Testé-las agora significaria que uma crianca em risco cresceria sabendo que deveria se submeter a exames proctolégicos anuais, ¢ nao teria essa revelacio repentinamente mais tarde; adiar a testagem significaria que a crianca, em toro dos 10 anos, seria mais capaz de entender e consentir esses procedimentos. {N.deT Do inglés, mutton cster region.GENETICA CLINICA 317 Tabela 12.5 _Aestrutura incomum do gene APC Exon ‘Tamanho (pb) intron ‘Tamanho (pb) 1 39 12 16947 2 153 23 1300 85 Be 78 4 202 45 8238 5 109 5052 6 M4 67 11542 7 & 78 8749 8 105 39 win 9 9 910 3372 10 2551 " 96 112 5116 12 140 213 eat 13 78 1344 “4 W 1415 15 25 5-16 2387 16 8686 Total 10.701 ‘fae de letra aberta (ORF & de 8538 nt, cocicando ura proeina com 2843 aminodcidos Na poipo ‘denomatosa do clan, a malaria das muragdes de mudanga na fase de letra ou sem seni, mas apenas asencontradas nos éxons 1-15 desencadeiam o deaimento meclado por mutagBes sem sentido, Dados de ENSEMBL (inode 2005, Essa familia ilustra alguns dos argumentos éticos relacionados com a testagem de DNA em criangas. Normalmente, ¢ inadequado testarcriangas quanto a suscetibilidade ge- nética ~ por exemplo, no Caso 21, familia Ulmer, os pais de Hannah foram dissuadidos de submeter seus outros filhos a testagem para verificar o status de portadores (hete- rozigotos) para Tay-Sachs. No presente caso, existem beneficios para uma crianga que € testada aos 10 anos, Para as criangas com um risco de 50% de terem FAP, a vigilancia da sigmoicoscopia anual precisa comecar por volta dessa idade. Evidentemente, é van- tajoso que a crianga evite esse procedimento desagradavel se puder ser verificado que nao € portadora da mutacao familiar. Apenas 0 consentimento dos pais deve ser exigido formalmente para a testagem, mas a boa pratica incluiria também a discussao dessa questo com a crianga e a obtencao de seu consentimento até onde fosse possivel. 12.4 Resumoe extenséo Cancer colorretal heredi ‘rio sem polipose A condigao da Familia Xenakis (Caso 24), polipose adenomatosa familiar, nao & a tinica forma de suscetibilidade hereditaria para 0 cancer colorretal. Algumas familias apre- sentam uma hist6ria clara de cancer colorretal de inicio precoce, herdado de modo FN.deT, Do inglés open reading frame318 ANDREW READ & DIAN DONNA! dominante, mas nao tém pélipos. Essa suscetiblidade mapeia no cromossomo 2p22 tem algumas familias e no 3p21.3, em outras. Um estudo de perda da heterozigose nos tumores forneceu a primeira pista dos eventos moleculares. A genotipagem com mar- cadores de microssatélites mostrou um efeito bastante inesperado: em lugar da perda da heterozigose em locais cromossémicos especificos, os investigadores encontraram freqtientemente novos alelos adicionais do marcador nos tumores. Além disso, esse feito nao era especifico de algum local cromoss6mico particular, sendo observado com os microssatélites de todo o genoma, Os microssatéites so segmentos curtos de seqiiéncias de DNA repetitivo, freqiiente- mente (CA\,(veja Capitulo 9). Quando a DNA-polimerase replica essas seqiiéncias, muitas vezes comete eros, colocando uma unidade de repetisao extra ou deixando alguma de fora. Esse deslizamento da replicacao ocorre durante a amplifcacio por PCR e éa causa das bandas adicionais (“bandas gagas”) observadas quando 0s microssatélites io co locados em géis (veja Figura 7.15, Capitulo 7), A mesma coisa pode acontecer durante a replicagao do DNA celular, mas a vivo os mecanismos de revisio de letura detectam os mauss pareamentos entre o molde e a fita recém-sintetizada e cortigem os erros. A ins- tabilidade dos microssatéltes observada no cancer colorretal hereditario sem polipose (LINPCC)’ resulta de falha desse mecanismo de reparo clo mau pareamento (MMR). (© mecanismo de MMR é muito conservado, desde E, coli até os hurmanos, ¢ um caminho pelo qual os genes do MMR humano foram clonados foi pela procura dos homélogos hhumanos dos chamados genes mutator em levedura. Esto envolvidos seis genes no processo humano (Tabela 12.6). Desses, as mutagdes em MSH2 e MLHT sao as causas suais de HNPCC. Funcionam como genes TS: uma mutacao de perda de fungao pode ser hereditiria, ¢ 0 alelo funcional remanescente ¢ inativado no tumor, epigenetica- ‘mente ou por uma mutacao somitica (veja adiante). Os casos esporiiicos tém ambas as cépias g@nicas silenciadas somaticamente, por mutagdo ou metilagao do promotor. Por que um defeito em um mecanismo geral como o MMR causaria, especificamen- te, cancer colorretal? A resposta, em parte, & que esse defeito pode, de fato, causar outros tipos de cancer, A instablidade dos microssatelites ¢, as vezes, percebida em outros tumores, especialmente nos tumores gistricos e ce endomeétrio, A outra parte da resposta pode ser encontrada na procuta das proviveis conseaiigncias de uma falha no MMR. fator de crescimento transformante f (TGFB) é um forte inibidor da proli- feracao celular no eélon e no reto. Age por meio de um receptor de superficie celular, do qual faz parte a proteina TGFBR2 (receptor 2 de TGFB}. O gene TGFHR2 contém uma Tabela 12.6 Genes envalvides no reparo do mau pareamento Porcentagem de Gene Numero OMIM — Localizagao HNPCC Ms 609309 2p22p21 60% mun 609310 39213 30% MsH6 600678 2p16 5% atipico) mus 604395, 1a4a243 Raro ouausente SI 600258 2931933 Rao ouausente PMs2 600259 7p22 faro ou ausente ‘Ae magbes em SHG (TBP orm desziasprincpalmenteem mulheres com cancer deendométa, nda com cancer coloet EN. de Do inglés, eedtry non polyposis colon cancer © Nede'T Do ingles, mismatch epicGENETICACLINICA 319 série consecutiva de 10 adeninas (A) no éxon 3 da seqiiéncia codificadora (Figura 12.13). As células deficientes em MMR sio passiveis cle inserir ou omitir uma ou mais adeninas. Isso cria uma mudanca de fase e torna ndo-funcional a nova cépia. Um levantamento ‘encontrou mutagdes somiiticas do gene TGFBR2 nos tumores de 100/111 casos de cin- cer colorretal com instabilidade dos microssatélites. Outros diversos alvos relevantes foram notados, isto é 0s genes com fungdes importantes que contém seqiiéncias seme- Inantes as dos microssatélites. 743 TGC ATT ATG AAG GAA AAA AAA AAG CCT GGT GAG ACT TTC 120 Cis Tle Met Lis Glu Lis Ie Lis Pro Gli Glu Tre Fen Figura 12.13 Parte da sequin (Uma série de 10 adeninas (A) co aro do mau pareamer ‘do éxon 3 do gene TGFBR2. utivas torn areplicacao da gene vulnerdvel a defitos nore Um efeito muito semelhante foi sugerido para o gene APC, Uma variante com senti do errado, p.lle1307Lis, ¢ encontrada em cerca de 6% dos judeus asquenazes e em proporgao muito menor em outras populagdes. Essa variante parece ser um alelo de suscetibilidade de baixa penetrancia para cancer colorretal, mal duplicando o risco normal. A alteracao da seqiiéncia de DNA cria uma série inseparavel de adeninas (Fi- GCA GAA AAA AAA GAA AAG Ala Glu Tle Lis Glu Lis Ala Glu Lis Lie Glu Lis Figura 12.14 Oalelo p.lle1307Lis, de suscetibilidade ao cancer colorrretal, do ‘gene APC. (Observe a Série de 8 adeninas (A), criada pela mutacao. O desenvolvimento do cancer em multiplos estagios Os patologistas ja sabiam, hé muito tempo, que os tumores malignos se desenvolvem ao longo de estagios marcados pelo aumento de crescimento e pela desdiferenciacao. AFAP oferece oportunidades excepcionais para o estudo desse processo, Quando 0 élon é removido cirurgicamente de um paciente com FAP, freqiientemente contém lesdes que mostram cada estagio do desenvolvimento do tumor. Vogelstein e colabo- radores (resummido em Kinzler e Vogelstein, 1996) analisaram essas amostras, junta- ‘mente com tumores colorretais esporidicos, quanto a mutagdes em genes candida- tos © a perda da heterozigose. Encontraram algumas alteragdes que freqiientemente estavam presentes nos estéigios iniciais e outras que somente apareciam em estagios posteriores. Reunindo suas observagoes, propuseram 0 esquema de desenvolvimento mostrado na Figura 12.15. Os estagios mais precoces s30 0s mais criticos, porque essas mutacdes devem causar instabilidade ou uma vantagem multiplicativa em uma célula relativamente normal que ainda tem intacta a maioria de suas defesas. Provavelmente, existe apenas um pequeno rndimero de meios de alcangar esse objetivo, mas hé um maior ndimero de maneiras de o desenvolver, uma ver. que 0s estigios iniciais estejam superados. As células com mutacoes: de HNPCC podem ter uma variedade mais ampla de possiveis rotas evolutivas em diregao, 20 cancer, mas muitos dos mesmos participantes estao envolvidos nesses diferentes ca- minhos, Os tumores que nao contém mutagdes de APC muitas vezes tém mutages em320 ANDREW READ & DIAN DONNAI Hererozicose ($4 cENE we (eas ea sunoais 1s Figura 12.15 Uma possivel rota comum para o desenvolvimento do cancer colorretal. (esquema veja Kinzer e Vogelstein, 1996) resume o mado em que alguns genes séo frequent ‘mente inativados nas lesbes ical, enquanto outros so inativados somente nas lesGes dos ut ‘mas estgias Surgiualguma controvérsia Sobre a aplicabiidade geval desse esquema, além de ndo existrsugestao de que todos os canceres colortetals se deserwolvam exatamente dessa maneira ‘outros componentes da mesma rota, por exemplo, a P-catenina ou a axina, Os tumores {que nao contém mutacoes de RAS em geral tém mutagdes no gene BRAF, que exerce fuungdes semelhantes. Como ja mencionado, a sinalizagao de TGFB é um regulador ne- «gativo importante do crescimento celular no célon, No interior da célula,o receptor de ‘TGFB sinaliza fosforilando os residuos de serina ow treonina das proteinas SMAD (fami lia de fatores de transcricao que penetram no niicleo ¢ induzem a expressio de genes- alvo). Essa via se apresenta alterada, comumente, no cancer colorretal, por mutacbes ddo gene TGFBR2 nos canceres com defeitos no MMR, ou em canceres colorretais sem polipose, por perda do cromossomo 18, onde esta localizado o gene SMAD4. Ampliando essa abordagem, Vogelstein considerou o equilibrio entre 0 nascimento e a morte celular, Uma vez que 0s tecidos e éngios mantém seu tamanho constante, deve existir algum mecanismo para regular esse balango. 0 referido autor sugeriu que, em cada tecido, ha um gene decisivo que comancla esse equilibrio, denominando tais ge- ines de “porteiros. As mutacdes nos genes porteiros tecido-espeeificos clevem ser os eventos iniciais dos canceres tecido-especficos, Uma vez iniciado o tumor, sua progres- sto dependeri da capacidade da célula para manter suas defesas contra o crescimento desordenad. Vogelstein denominou os genes responsaveis por essas defesas de ladores", Dessa maneira, os tumores iniciam com mutages nos genes porteitos ¢ pro sridem com mutagdes nos genes zeladores. Essa concepeao adapta-se claramente a0 cancer colorretal, mas sua aplicabilidade geral 6 discuivel, No minimo, éum argumento refinado para ponsderar sobre a carcinogénese. Aepigenética no cancer Como foi observado no Capitulo 7, ndo ¢ clara a amplitude do papel dos mecanismos epigenéticos nas doencas hereditarias. Entretanto, ¢ indiscutivel sua importancia no cincer, Os estudos sobre a metilaglo do DNA em células tumorais mostram um panora ‘ma um tanto paradoxal. Por um lado, o nivel geral de metilagao & reduzido em muitas élulas tumorais, comparadas a suas contrapartes normais. Pelo outro, muitasilhas CpG sto hipermetiladas. Cerca de 50's ce todos os genes tém uma ilha CpG associada a seu promotor {veja Capitulo 7), Nas células normals, essas ilhas nao so metiladas, inde pendentemente de serem ativos ou silenciosos os genes relacionados. A metilacio do promotor (ou de dinucleotideos CpG isolados) controla a expressao dos genes que nao posstiem ilhas CpG, mas nao a expressio dos genes que as contém. No entanto, nas células cancerosas, os promotores dos genes que tém uma ilha CpG freqiientemente savo silenciados pela metilagio. Existe alguma evidéncia de que os tumores podem serGENETICA CLINICA 321 divididos em dois tipos: aqueles em que muitas ilhas so metiladas e aqueles em que isso nao ocorre, implicando a existéncia de algum mecanismo geral que favorece a me- tilagao anormal das ilhas. Afirma-se que os tumores com ampla metilagio de ilhas s30 clinica e etiologicamente diferentes dos que carecem desse aspecto. Os genes TS sao silenciados pela metilacdo do promotor, no minimo tao freqliente- ‘mente quanto o sao pelas mutagdes. A importancia relativa desses dois caminhos varia de gene para gene. Sabe-se que varios genes sao sempre silenciados epigenet camente, jamais por mutagdes, enquanto para outros o inverso é verdadeiro, e para outros, ainda, ambos os processos so comuns. Por exemplo, o gene MLH! é, muitas vezes, silenciado epigeneticamente, mas o MSH2 nunca o é, Jones e Baylin (2003) fornecem uma revisdo desse tépico, com muitos exemplos ¢ alguma especulacio sobre os respectivos mecanismos. Uma das idéias é de que a hipometilacao dos centromeros poderia predispor as células cancerosas a instabilidade eromossomica. Isso se baseia, em parte, na observagao de que, na sindrome ICF (OMIM 242860; veja Quadro de doencas 2, no Capitulo 2), a deficiéncia de DNA-metiltransferase, cau- sada por mutagao no gene DNMT3B, resulta na compactacao anormal da heterocro- matina centromérica, Os canceres familiares de mama e colorretal sao realmente condi¢6es multifatoriais? No caso da familia Wilson (Caso 24) 0 resultado do rastreamento das mutacoes expli- cou a forte historia familiar. No entanto, muitas familias com casos miiltiplos de cancer de mama nao tém mutacdo alguma nos genes BRCAI/2. As mutacdes em BRCAT ou BRCA2 sao responsiveis apenas por 25%, aproximadamente, da tendéncia familiar to- tal ao cancer de mama, As continuas pesquisas ainda nao revelaram um suposto gene BRCA3 que pudesse explicar alguma proporao significativa dos casos remanescentes. Parece provavel que a tendéncia familiar restante seja poligénica, composta dos efeitos combinados de varios locus de baixa penetrancia (Antoniou et al, 2002) Foi criado lum consércio para testar os genes candidatos para esses efeitos de baixa penetrancia sobre a suscetibilidade ao cancer (National Cancer Institute Breast and Prostate Cancer Cohort Consortium, 2005), Um desses lécus foi definitivamente identificado. © gene CHEK2 (OMIM 604373) esta envolvido na detecgao e sinalizacao do dano do DNA. Uma delegao com mudanga na fase de leitura, c.1100deIC, foi encontrada no referido gene, em 201/10.860 (1,95) pa- ientes com cincer de mama, ndo-selecionados, mas apenas em 649.065 (0,7%) con- roles. Isso forneceu um risco relativo de 2,34. Os dads sugeriram que essa variante duplicava qualquer risco que uma mulher tivesse em decorréncia de outros fatores. No total, uma mulher portadora da mutacao c.1100deIC tinha um risco vitalicio de vir ater cancer de mama de 13,7%, comparado ao risco de 6,1% para uma nao-portadora. Todavia, a variante propriamente dita era responsavel por apenas 0,7% da incidéncia de cancer de mama na populagao total, porcentagem inferior a de muitos fatores re- lacionados ao estilo de vida, como paridade, peso e atividade fisica. Desse modo, nao esta claro sob que circunstancias teria valor fazer o rastreamento dessa variante. Ou- tuos possiveis fatores de baixa penetrancia sao as variantes dos genes STKIS e PTPR] (Lesueur et al., 2005). A pesquisa dos fatores de suscetibilidade de baixa penetrancia e a tomada de decisao quanto ao que deve ser feito quando esses sao encontrados nos conduzem a area da suscetibilidade a doenga multifatorial comum, que é 0 assunto do proximo capitulo.322 ANDREW READ & DIAN DONNA ‘Uma situagao um tanto similar, porém menos surpreendente, é observada no cancer colorretal. 0 risco vitalicio nos EUA é de 5-6%. Em torno de 20% de todos os pacientes com cincer colorretal tém dois ou mais parentes em primeiro ou segundo graus tam bbém com esse tipo de cincer; 5-10% dos casos mostram heranca aproximadamente mendeliana. A FAP e o HNPCC sao responsavels por cerca de 4's de todos os canceres colorretais;o restante da tendéncia familiar é, provavelmente, 0 efeito de varios alelos de suscetiblidade de baixa penetrancia Perfil da expressao génica nos tumores Cada tumor € geneticamente tinico. Como Hanahan e Weinberg (2000) mostraram, hi muitos meios diferentes para a obtencao das seis capacidades listadas no Quadro 12.1. Os diferentes genes de uma rota podem ser ativados ou inativados por mutagdes pon tuais, mudancas epigenéticas ou eventos cromossomicos. Muitos produtos xénicos sto multifuncionais, portanto, além do efeito que é o alvo da selecao natural, pode haver toda espécie de outros efeitos eventuais. Os tumores evoluem em um mar de células geneticamente instaveis que abrigam uma diversidade de mutagoes relevan tes ¢ esporidicas. O verdadeiro alvo para a terapia deve ser uma minoria de células cancerosas de um tumor, com propriedades semelhantes as das células-tronco. Para ‘0 médico que esta tentando decidir 0 melhor manejo e progndstico de um paciente, ha uma grande necessidade de definir uma pequena lista de alteracoes importantes. Para Jason Tierney (Caso 20), a identificagao do gene de fustio TEL-AML! forneceu essa informacdo, Para pacientes com cancer de mama, a procura da amplificagao do recep tor produzido pelo gene HER é um ponto de pattida, pois define a responsividade a Herceptina. Todavia, ainda ha um longo percurso para 0 uso de todas as informagoes ‘genéticas de um tumor. 0 perfil da expressio génica nos tumores fortalece a esperanca de se alcancar isso. A grande quantidade de mRNA ou de cDNA de um tumor é marcada com um corante e hibridizada com um microarranjo, provavelmente em um afranjo competitivo, para comparésla com o repertério de mRNA do tecido normal respectivo. Esse microarranjo contém oligonucleotideos correspondentes as regides tinicas do cDNA de cada gene do genoma e, esperamos, todas as principais variantes de encadeamento. O University of Utah Genetic Science Learning Center (veja Referencias) possui tm website animado muito bom, que explica, em um nivel basico, os principios da anise de microarranjos de expresso no cincer. Esses experimentos geram enormes quantidades de dados. 0 investigador deve tentar extrair uma “assinatura", ou seja, um padrao de expressio cde um niimero limitado de genes, que defina 0 prognéstico ou a resposta do tumor as drogas anticancerigenas. A Figura 12.16 mostra um exemplo de assinaturas de expres io. Encontra-se disponivel um editorial que situa esse trabalho em um contexto mais amplo (Hedenfalk, 2002). A anilise estatistica por agrupamento hierérquico, como na Figura 12.16, permite a lextracao de assinaturas que, em alguns casos, se mostraram preditivas da resposta as {drogas e do prognéstico (veja, por exemplo, Glinsky et al., 2005). Permanece irrevelado se essas assinaturas podem ser transformadas em instrumentos clinicos titels. Ha dois problemas a superar. O primeiro é que um {nico experimento de microarranjos produ tum vasto volume de dados, que pode ser analisado de muitas maneiras, dificultando conhecer a significincia de qualquer assinatura relatada, O segundo problema é muito comum na transferéncia de pesquisas para a pratica clinica. Um teste pode diferenciar dois grupos eficientemente, mas isso nao significa que pode incluir exatamente um individuo no grupo adequado. Algumas assinaturas de expressao possibilitam uma pre- digio estatistica e podem diferenciar os grupos de tumores com bom progndstico dos324 ANDREW READ & DIAN DONNA\ ‘grupos com mau progndstico ~ a questao € se essas assinaturas sao suficientemente ‘especificas para fornecer uma predicio stil a um paciente individual. Alguns pesquisa- ores consideram mais proveitoso estudar o repert6rio total de proteinas ce um tumor, usando a tecnologia protedmica (eletroforese em gel bidimensional ou eletroforese-2D, espectromettia de massa, etc), Doenca de von Hippel-Lindau (Os pacientes cam a doenga de van Hippel-Lindau (OMIM 193300) apresentam o risco de desenvolver uma variedade de tumores (Tabela J). As causas mais frequentes de marte soo carcinoma de células renais ou os hemangioblastomas no sistema nervoso central, Essa doenca é autoss6mica dominante, com uma incidéncia de | em 35.000-45.000 individuos. Entre os portadores do gene em questo, 95% desenvolveram um ou mais tumores caracteristicos em torno dos 65 anos. Uma vez que as diferentes manifestacdes da doenca podem set tratadas por clinicos diferentes, a conexdo entre as mesmas nem sempre éfeita imediatamente, acarretando 70mmoVitro Qu aticemia anormalem jejum __Glicase em jejum 6,1-7,0 mmoltro Cutolerancia anormal glicose Qu esisténcia& insulina Hiperinsulinemia MAIS 2 ou mais de: Obesidade BBM > 30 ou razd0 cintura-quadrl > 0.9 (homens) (04 > 085 (mulheres) (valores diferentes podem se adequados &s pessoas nio-caucasdides) Tiglicerideos = 1,7 mmol/itro ou Dislipideria CColestesol HDL (homens) <09/ou (mulheres) <1.0 mmole Hipertensao >140/90 mmHg Microalbuminiria Excregio de alburina >20 g/min FA SUPERS De Sis sete ats eeanip eames ‘Outrasentidadeselaboraram defngdes um pouco diferentes, mas que se superptem Esa sta mosta ‘©.compleno de carateristicasintragentes que nica a suscetibiade 20 dabete tipo 2e doenca jovascua. prevaléncia da sindtome aumenta coma dade, entre adultos dos FUA, de 79 aos 20-29 anos ata 4205 60-69 anos A prevacid 50% entejovensobesos graves dos EUA,€estéaumentando em tedasasidades ena mara dos pales do mun Dois modelos de determinacgao genética ‘Tradicionalmente, as caracteristicas genéticas foram divididas em mendelianas e poli sénicas. As condicdes poligénicas dependem da acio combinada de um niimero muito grande de fatores genéticos, cada um dos quais faz apenas uma contribuigao muito pe- ATA_Distibuicdo da suscetblidade @ doencas, com mir) Na populasso gerat ® supa (b)em parentes de probands. Se vac tiver um patente afetado, essa pessoa deve ter uma alta suscetibilidade genética por ter um punhado de genes de ata suscetiblidade. Vocé compartilha seus genes com seus parentes (veja Quadro 103, n0 Capitu- Jo 10), Pode ter sorte, compartilhando somente alguns genes de alta suscetibilidade com seu parente, ou pode ter azar, compartihando muitos. Em geral, havera uma ampla dstibuicSo de suscetibilidade entre os parentes das pessoas afetadas, mas a curva seré desiocada em citecdo 4 extremidade da alta suscetibilidade, em com paracio a distibuigdo na populacio geral (veja item [b] da figura). € mais provavel que os parentes consangui- rneos de individuos afetados terminem ultrapassando o limiar, situando-se no grupo de alta suscetibilidade, do {que os individuos ndo-consanglineos. Quanto mais préximo seu parentesco com alguém afetado, mais provi- vel serS que isso ocorra, Prtanto, as doencas complexas tendem a segregar em familias, mas sua propensdo é muito mais fraca do que para as doencas mendelianas (Tabela 13.2 Essa concepao pode ser ampliada de vérias maneiras «Para abranger os fatores amibientais, poderlamos supor que, ern vez.de um tinicolimiarfxo, houvesse um tisco aumentado de desenvolver a doenca a0 longo de um espectro de alta suscetbilidades. + Os limiares podem ser sexo-especificos (ou diferenciais para 0s sexos), 0 exemplo classico conhecido 6 0 da estenose pilérica (malformagao congénita que consiste no estreitamento.do officio de comunicagao entre © estémago ¢ o duodeno}, que é muito mais comum em meninos do que er meninas (5M: 1F).C limiar deve ser mais bao nos meninos do que nas meninas, pr alguma razBo fisiolégica. Para serafeteda, urna menina deve ter uma suscetibilidade particularmente alta, Em média, as meninas afetadas t€m mais genes para alta suscetibilidade do que os meninos afetados. Portanto, os parentes de meninas afetadas esto em risco mais alto de estenose pilérica do que os parentes de meninos afetados.GENETICA.CLINICA 335) Embora esses modelos possam ser desenvolvidos matematicamente, s80 mais uteis como instrumentos qual- {ativos para se ponderar sobre os riscos de recorréncia, Assim, conduzem & seguinte regra geral Nas doencas complexas, quanto pior 0 que ocorreu no passado.a uma familia (muitas pessoas afetadas; afetados pertencentes ao sexo menos suscetivel), maior serd ovisco de recorréncia. Observe 0 contraste completo entre as doencas complexas (ou multifatoriais) eas mendelianas (ou monogéni- Cas) aesse respeito, Se, por um azar, seus ts filhos tm fibrase cistica (mendeliana),o risco de que seu pr6ximo filho venha a ser afetado ainda continua 1 em 4, Contudo, se voc® teve dois bebés com um defeito do tubo ‘neural (complexa), em vez de um 36, 0 risco para o proximo bebé ser afetado passa de | em 25 para 1 em 12. A {geracao de um segundo filho afetadio ndo mudou seu risco, mas modificou nossa compreenséo do risco que voce sempre teve. Tabela 13.2 _Exemplos de iscos de recorréncia para doengas mendelianas e multifatoriais Doenga as Riscovitalicio em 9saté 80 anos) Fibrosecstica 500 05 Doenca de Huntington ‘5000 001 Doenca celaca © 3 Esclevose milla 25 1 Diabete tipo 1 15 6 Diabere tipo 2 46 735 Cncer testicular 8 2 DDoenca de Alzheimer 4 35 Cancer de mama 2 “4 3, € oso relator um ima de um proband, comparado a uma pessoa nio-cansangines,Comoare ‘95 rscospaa.a5condigdes mendeianas fina sombreadas com os isos para as candies comple (Ou mulifatrias ses timos so seas emplieos,orkgiados de levantamentos de familias. naa clvlos 'edrcos Pode varia entre as populages também ao longa do tema (presumivelmente devido as mudangas ambient). Quando se sam esesscos para o aconselhament, € importante que os mesos Sejam provenents de estudosadequados ao cntexto do consulente, Dados gentimente cedktos po Ot Alson Stewart, Cambridge * Estudos de gémeos ~ examinam as pessoas afetadas que tém um co-gémeo, Com- param os gémeos monozigéticos (MZ) e os dizigéticos (DZ) para estimar com que freqiiencia o co-gémeo também ¢ afetado. Os gémeos MZ compartilham todos os ‘seus genes, enquanto os gémeos DZ compartilham 50% de seus genes, em média; os _gmeos em geral devem compartilhar de seu ambiente em um mesmo grau, inde- pendentemente de sua zigosidade. Assim, uma maior concordincia entre os gémeos MZ6é evidéncia de fatores genéticos". Os gemeos MZ separados ao nascer e criados em ambientes diferentes constituem o estudo perfeito, mas o mimero de casos é demasiadamente pequeno para fornecer algo mais do que histérias fascinantes. (0 resultado final dos estuclos de familias, de adocao ou de gémeos é uma estimativa da herdabilidade de uma dada condigao (veja Figura 13.4). *'N- de T Quando ambos os membros do par gemelar (MZ ou DZ) tém ou nao tém a dena, di-se que s80 ‘concordantes; quando apenas um dos co-sémeos¢afetalo,da-e que os gémeos si dscordates, Quando ak ‘aracevisticas so determinadas por ftores gendtcos,a taxa de eoncrdincia ser mis ala par os gémeos MZ ‘do que para os meos DZ: quanto maior fora diferenga entre as taxas de concord de MZ e DZ. maior deve ‘seo condcionamento gendtco da caracterstica considerada Fonte Borges Osirio& Robinson, op cit, p-327336 ANDREW READ & DIAN DONNAI {a) SEGREGAEM FAMILIAS? (lb) CONCORDANCIAGEMELAR-—_(€) ADOCAO 10 @ ee co oo eo ae een Mz>b2 rave begs > ado "se popdaconal dees sexo? ‘dogie 0 nscer? mbit far Mzpodem se vatados Celocgio sata? “Compania? eee ae nis raters? Figura 13.4 Métodos de demonstracao dos efeitos genéticos nas doensas complexes (rnultifatoriais) eraz6es para cautela na interpretacao dos resultados. Estudos de ligacao para identificar os fatores de suscetibilidade Tendlo-se estabelecido que os fatores genéticos desempenham um papel na suscetibili- dade & doenga escolhida, a proxima etapa 6 identificar esses fatores. Essa é uma grande tarefa, muito mais fcil de dizer do que fazer. Igualmente ao que ¢ feito com as doencas rmendelianas, a primeira abordagem usual é por anilise de igagao (Capitulo 9). 0 méto- do laboratorial é 0 mesmo: os membros apropriados da familia sio tipificados para um grande painel de marcadores genéticos e esses dados sio analisados para se descobri- tem os marcadores que segregam juntamente com a doenga. Entretanto, essa anilise é diferente. A anilise-padrao de escore lod requer que 0 pesquisador informe ao com- putador a penetrancia de cada genétipo, as freqiiéncias génicas e a taxa de mutagao. Para as doengas mendelianas, geralmente é possivel obter-se uma estimativa plausivel sobre esses parimetros, mas nao ha meio de se fazer isso para as doencas complexas. Portanto, é necessério usar a analise de ligacdo nao-paramétrica, ‘A analise nao-paramétrica usa familias com mais de uma pessoa afetada e considera a extensio em que os membros afetados da familia compartilham seus genes. Ao con- tritio das caracteristicas, os genes sio sempre mendelianos, sendo facil caleular a par- ticipagao esperada entre qualquer conjunto de parentes. Os parentes afetados devem ‘mostrar compartilhamento excessivo de algum gene ou marcador que esteja envolvido na etiologia da doenga, quase completamente independente de seu modo de heranga. Aabordagem mais comum utiliza pares de irmaos afetados. Andlise de pares de irmdos afetados 0 principio da analise de pares de irmaos afetados (ASP) é formar uma colegao de pares: de irmaos afetados (uma colecao tipica seria de 100-500 pares) e tipificé-los para um painel gendmico amplo, com muitos marcadores. Consideremos um par de irmaos com ‘uma condicao mendeliana recessiva. A Figura 13.5 mostra como deveriam compartilhar ‘ alelos de um lécus marcador que fosse, ou ndo, muito ligado ao lécus de sua doenca. ‘A Tabela 13.3 generaliza esse aspecto. Independentemente do modo de heranca, os marcadores que estao ligados a um locus de suscetibilidade devem ser compartilhados pelos irmaos afetados em uma freqiiéncia maior do que a aleatéria, ‘A anilise ASP é um método de analise nao-paramétrico extremamente eficiente, Nesse ‘método nao existem pressuposicdes incorporadas que possam estar comprovadamente erraclas, No entanto, as regides cromoss6micas por ele delimitadas sao muito grandes. Node, Do inglés, ated sb pacGENETICACLINICA 337) (a) +9 es AC AC:AD:8C:60 Triase Figura 13.5 Compartithamento de alelos de marcadores por um par de irmaos em que ambos sao afetados por uma doenca mendeliana recessiva, (@) Um marcador que se localiza em um cromossomo diferente daquele do lécus da doenca.(b) Um marcador que ¢ muito ligado a0 locus da doenga. A, 8, C,D representam diferentes alelos em tm ldcus marcador, Tabela 133 Compartilhamento esperado de alelos de marcadores por um par de irmaos afetados limaosn3o—_rmaos Irmios ‘compartitham — compartilham compartiham Marcador alelos talelo 2alelos 'Nio-ligado ao lécus da doenca 4 Wa wa Muito ligado ao gene mendeliano 0 Ww wa dominante raro ‘Muito ligado a0 gene mendeliano 0 0 1 4 >in >a “Asestimatives pare as doengas mendeanaspressupdem que ambos os mos tém os mesma lelos no lcus da doenga,o que normalmente sera verdadeia, Contato que esses aes sei aos na popula. Pra tum cus de suscetibiidade a uma doenca comum, rio e podem predize as proporyoes exatas somente 2 1éncia em ques proportes se dewar30 do esperado aleatramente Com uma doenca monogénica, como vimos no Capitulo 9, voce pode acompanhar a analise de ligagao em familias grandes até @ recombinacao mais recente e pode esperar delimitar uma regido cromoss6mica candidata que contenha apenas um punhado de 1enes. Todavia, os fatores de suscetbilidade a doenca complexa nio so necessitios, nem suficientes, para a doenca se desenvolver. Conseqiientemente, mesmo quando & obtido um resultado significativo, provavelmente a rexiao candlidata tem a extensio de 20-50 Mb, Uma regido tao grande deve ser restringida, de algum modo, para pos tara testagem de mutagdes. Os estudos de associagio sao ideais para isso. Detectando os fatores de suscetibilidade por associagéo Segmentos cromossémicos ancestrais Durante a préfase da meiose I, hd em média 60 crossing-overs por célula, nos homens, € ‘90, nas mulheres. Um cromossomo médio poderia ser dividido em dois ow trés segmen- tos. Assim, quando os irmaos compartilham segmentos cromoss6micos, esses tendem ser grandes. Quando passamos dos irmaos para parentes cada vez mais distantes, 0 provavel tamanho de qualquer segmento ancestral compartilhado sera menor. Conside- ‘remos um segmento cromossOmico que dois parentes distantes, Bob ¢ Carol, herdaram338 ANDREW READ & DIAN DONNA “ oJ Q O a ee Figura 13.6 Bob e Carol herdaram um segmento cramossbmico de sua tetrav6, Alice, Os eventos de recom- binacdo em 10 meioses reduziram 0 tamanho do segmento que é com: partithado por essa dupla dde um ancestral comum (Figura 13.6). Um segmento de 10 eM de extensdo teté somente 1's de probabilidade de nao ter sido rompido por recombinacao em uma ou mais das 10 meioses que separam Bob e Carol. Provavelmente, Bob e Carol nao sabiam que eram consangtiineos. Cada um tem 32 an- tepassados (16 tetravés e 16 tetravés), mas, mesmo que ambos fossem entusiasmados historiadores da familia, é praticamente improvavel que conhecessem a histéria de todos os 32 antepassados e identificassem todos os seus numerosos descendentes. ‘Argumento idéntico aplica-se a cada segmento de todos 0s cromossomos da totalida- de dos individuos. As pessoas que pensavam nao ser reciprocamente consangilineas compartilham pequenos segmentos cromossOmicos, herdados de um distante ances- tral comum. Quanto mais distante estiver esse ancestral, menor sera o segmento cto: mossdmico compartilhado, porém maior sera o mimero de pessoas que 0 possuem. Ha N geragdes, vocé tinha 2" ancestrais (Figura 13.7). Cada ancestral, por sta vez, teria em média 2° descendentes se o tamanho populacional permanecesse constante. Recuando até 20 geracdes (digamos 500 anos, aproximadamente no ano de 1500), 2°” € superior a 1 milhio de descendentes. Definitivamente, somos todos consangiiine- 05. 0 termo “nao-consangiiineos” serd usado aqui, como em qualquer outro tépico de genética, para significar pessoas que nao compartilham mutuamente os genes de qualquer um de seus bisavés. 0 antepassado compartilhado importante € o ancestral comum mais recente. Esse an- cestral comum provavelmente sera mais recente em uma pequena populagao isolada do que em uma grande populacao exocruzada, ¢ 0 segmentos compartilhados serio ‘ortespondentemente maiores (para um ancestral recente) ou menores (para um ances- tral distante), Para diferentes segmentos eromossOmicos, o ancestral comum também co ee HCHO EE = MH a ie Aare 1960 Figura 13.7 _Hé,N geragdes, uma pessoa tem 2’ ancestras. Essa estimativa ultrapassa rap) 5.4) + evidencia significativa de ligagao (escore lod > 3) * evidencia sugestiva de ligagao (escore lod > 22) Esses limiares so escolhidos para fornecer probabilidades de 0,001, 0,05 e 1, respectivamente, de obter um es: core lod t8o alto, de uma vez 56, em uma varredura de igago gendmica ampla, contra a hipdtese nula de ndo exist ligacdo verdadeira. Os escores das categorias inferiores detém pequeno valor até que sejam reproduzi- dos, em estudos independentes.344 ANDREW READ & DIAN DONNA! Tabela 13.5 As variantes comuns da apolipoproteina E e suas freqiiéncias géri possiveis razdes disso sao discutidas na Seedo 13.4. No entanto, existe alguim apoio para diversas localizacdes possiveis. A revisdo feita por Bertram e Tanzi (2004) relaciona 12, regides cromossémicas com evidéncia de ligacao, em mais de um estudo, e discute os jos que a sustentam. Em suma, esse trabalho sugeriu diversas regides cromoss6mi- cas que merecem investigagio posterior, mas ndo mapeou outros fatores de susc dade definidos além da regido 19q13, onde se localiza 0 gene APOE. Aproximadamente 100 genes, no total, foram examinados para variantes associadas 8 doenca de Alzheimer. Esses genes incluem candidatos posicionais sugeridos pelos studs de ligacao, bem como genes candidatos sugeridos pela patologia da propria doenga. Foram descritas muitas associagdes, mas nenhuma, além de APOE", foi con- vincentemente confirmada. Novamente, Bertram e Tanzi (2004) revisam as evidéncias. Alem da referida associagao, os resultados de muitos estudos fornecem indicadores i teressantes para futuras pesquisas, mas nao identificam fator algum de suscetibilidade a doenca de Alzheimer. Entretanto, a importancia do alelo APOE"4 é indiscutivel pois, foi confirmada em muitos estudos. © gene APOE, localizado no cromossomo 19413, codifica a apolipoproteina E. Muitas va riantes desse gene ja foram descritas (veja OMIM 107741), das quais somente trés cons- tituem polimorfismos comuns. As variantes ApoE2, ApoE3 e ApoE‘ sao variantes da se- «liencia codificadora, produzindo proteinas ApoE com cisteina ou arginina nas posigdes 112 € 158 (Tabela 13.5). Essas diferencas produzem diferengas funcionais no metabolis- ‘mo lipidico. A variante E4 esta associada a niveis mais elevados de colesterol plasmatico total e de LDL do que nos homozigotos para E3. As freqiiéncias genicas dessas variantes tm sido estudadas em muitas populagoes. APOE"4 € o alelo ancestral, encontrado em primatas nio-humanos e em populages que ainda se utilizam, de maneira importante, do forrageio (procura de recursos alimentares pelos seres vivos, por meio de estratégias ‘especializadas). Em populacdes tipicamente agricolas, a freqiléncia de E4 € baixa. 1s em virias populacoes Residue —_‘Residuo Reino ‘América Variante 112 158 Espana Unido China Japao (ratvos) 2 cseia cist. 0089 one pas 09 5 7 mmollitro em jejum, ou >11 mmol litro sem jejum prévio, ou por um teste de tolerancia a glicose, é uma condigao hetero. xgénea, Além de muitos tipos menores, os dois principais sao: * Tipo 1 (T1D) ~inicio siibito da doenga em pessoas jovens, resultando de um ataque auto-imune as células f§ pancredticas e nao estando associado a obesidade * Tipo 2 (T2D) - geralmente com inicio no adulto, associado & obesidade e a inativi dade fisica, sem aspectos auto-imunes ¢ resultando de uma combinagao de secre- io inadequada de insulina e resistencia a seus efeitos Essas duas doencas separadas envolvem fatores dle suscetibilidade genética e ambien- tal, Para a T2D, as evidéncias dos fatores ambientais provém clos recentes aumentos alarmantes em sua prevaléncia (nos EUA, um aumento de 40’ entre os adultos, durante © periodo de 1990-1999, com outros acréscimos a partir de 1999) e dos estudos de intervencao, que mostram a eficicia do controle de peso e dos exercicios fisicos. As evidéncias dos fatores genéticos originam-se de estudos familiares e gemelares, bem ‘como de variagdes étnicas em sua prevaléncia. A razao de risco para irmaos, A, é de 4-6, € muitos estudos relataram concordancia mais alta em gémeos monozigéticos, quando comparados aos gémeos dizigéticos. Uma histéria familiar positiva acarreta lum aumento de 2,4 vezes no risco; 15-25% dos parentes em primeiro grau de pacien- tes com T2D desenvolvem tolerancia reduzida a glicose ou diabete diagnosticavel. A prevaléncia varia imensamente entre os diversos grupos étnicos, mesmo quando seus membros convivem em comunidades multiétnicas. Algumas variantes de T2D (MODY ¢ ‘T2D mitocondriak; veja adiante) so herdadas como condigbes monogénicas, compon- do menos de 10% do total. Com respeito as informagdes genéticas, a familia Zuabi € bastante tipica. Um conjunto, de problemas superpostos ~ T2D, doenca cardiovascular, doenca cardiaca coronariana — tende a se concentrarlivremente nas familias. A sindrome metablica é um claro preditor de risco, como o sao seus componentes individuais. Enquanto uma forte histéria familiar prediz um risco aumentado, ha pouco alcance para uma recomendacio especificamente346 ANDREW READ & DIAN DONNAI genética: 0 conselho geral para todas as pessoas com sobrepeso e que sao inatvas,inde- pendentemente de sta hist6ria familiar, fazer exercicios e reduzir 0 peso. As intimeras drogas possiveis sao prescrtas de acordo com a fsiologia, ndo com a genética. (0s auumentos epidémicos recentes na freqiiéncia de T2D, em muitos paises, estimula- ram intensivos esforcos para a compreensdo de suas causas. Com relacio 3 etiologia ge- nética, foram realizados mais de 50 estudos de ligagao em familias ou pares de irmaos (ASP) e nuumerosos estudos de associagdo, cujos resultados para T2D foram os tipicos de muitas doencas complexas. Estudos de ligasao: ilizando os critérios de Lander-kruglyak (Quadro 13.3), nenhu- ma investigagao obteve resultados altamente significativos. Somente algumas regides cromossémicas forneceram evidéncia significativa em uma tinica andlise ou foram repe- tidas compativelmente em outros estudos. A maioria das pesquisas obteve escores lod ue, na melhor das hipdteses, eram sugestivos e ndo coincidiam com as localizacdes stigeridas por outras investigagaes. Quase todas as regides cromossOmicas mostraram evidencia sugestiva de ligagao em um ou outro estudo, e quase nenhuma das ligacoes sugestivas foram contfirmadas. A Tabela 13.6 resume os resultados mais favoraveis dessa enorme quantidade de trabalhos. Estudos de associacdo: seguindo a estratégia de duas etapas, esbocada na segio an terior, foi identificado somente um suposto fator de suscetibilidade. A clonagem posicio- nal de um pico de ligagdo em 2437 indicou, finalmente, o ene CAPNI0, da calpaina-10. ssa protease, que atua em diversos tecidos, inclusive nas células pancreéticas que pro- dduzem insulina, nao havia constado em lista alguma dos provaveis fatores de suscetibi- Tidade, mostrando o poder da clonagem posicional para produzir novos insights quanto Tabela 13.6 Possivels localizagdes dos lécus de suscetit anilises de ligagao idade 2020, sugeridos por rude ial sees [pets Nea name Wile Pope TT Tas Caucasbides doR. Unido 15 México-americanos 29373 41 Caucassides americanos 22 Chineses 21 IMexico-americanos 3p24.1 39 México-americanos 13 México-americanos 2 p CCaucasbidesfinlandeses Caucasbides franceses 3028 47 Japoneses la Aborigenes austraianos 1.8 México-americanos 109261338 Caucassides doR, Unido 20 Caucascides fnlandeses 124243136 Caucasbides americanos 15 lréus do Pacifico 37 Caucasbides filandeses 1.9 Caucasbidesfinlandeses 18112242. Caucasbides americanos 24 [ses estudos foram seleconados de um nimero muito mats amplo de estudos que mostraram excors fod Insigncartes ness calactes Reprodusido de Florez et (2003), com permissio.© 2003 Annual Reviews wuwannuareviews oo.GENETICACLINICA 347 4 patogénese. No estudo original, a suscetibilidade foi atribuiida a uma combinacao de trés SNPs niio-codificadores, cujo significado funcional era completamente obscuro. No eentanto, muitos estudos subseqiientes nao conseguiram esclarecer a natureza do dete ‘minante da suscetibilidade, e nem todos confirmaram sua existéncia, Em um segundo exemplo possivel, os SNPs do gene CASQI, da calseqiiestrina’, em um pico de ligacao em 1925, foram associados, tentativamente, a um risco aumentado de T2D. ‘A maioria dos estudos de associagao selecionou genes que se supde estarem prova velmente envolvidos na patogénese, e nio as regides cromossémicas sugeridas pelos estudos de ligagdo. A Figura 13.94 mostra a cascata patogénica auto-reguladora que produz.a hiperglicemia e o aumento dos dcidos graxos lives do T2D, enquanto a Figura 13.9 mostra os complicados eventos que controlam a sinalizacio da insulina, Eviden- temente, a lista de possiveis genes candidatos é muito extensa, Esses estudos relataram mais de 30 outros genes que acolheriam variantes de suscetibi- lidade, mas, assim como nos estudos de ligacao, pouquissimas associacdes foram reite- radas. Uma enorme metanalise que incluiu mais de 25.000 casos confirmou o papel de ‘uma variante com sentido errado (p-Pro12Ala) no gene PPARG, que codlifica um receptor hormonal nuclear. 0 alelo comum Pro (com freqiiéncia de 85% entre os europeus) con- tribui para um risco modestamente aumentado (razao de risco: 1,27), porém, devido a0 fato de ser tao comum, esse polimorfismo explica cerca de 25% do risco populacional atribuivel (veja Capitulo 11) para 0 T2D. Variantes em dois dos alvos (ABCC8 e KCNJ11) das drogas geralmente usadas no tratamento de T2D também foram convincentemente implicadas na suscetibilidade a essa doenca, Arelacdo entre as formas monogénicas e as complexas: uma concepgao comum. da suscetibilidade as doencas complexas é a de que os genes das rotas principais sofrem grandes mutagdes, que causardo doenga mendeliana, ¢ as variantes menores atuarao como fatores de suscetibilidade na doenca complexa. As formas mendelianas de T2D sdo bem-conhecidas. 0 MODY™ (diabete da maturidade no jovem) é uma condigao au- tossémica dominante de inicio precoce, Nao mostra associagio a obesidade ou ao es- de vida, mas sob outros aspectos se assemelha muito a forma de inicio no adulto. As abordagens de ligacao, clonagem posicional ¢ genes candidatos identificaram sete genes diferentes, cujas mutagdes podem causar 0 MODY (veja OMIM 606391). A identi ficagao desses genes esclareceu os mecanismos que controlam a homeostasia da glicose © a resposta da insulina. Isso também nos ajudou a entender a suscetibilidade a0 T2D? A presente resposta deve ser “muito pouco”. Somente um dos genes do MODY (HNF4A, MODY 1) inclui-se em um pico de ligagio repetido de T2D (em 20413, demasiado fraco para ser incluido na Tabela 13.3, mas sustentado por escores lod dle 2,2 ¢ 2,9, em fin- landeses e chineses, respectivamente). Os estudos iniciais nao encontraram associagao alguma na doenga de inicio no adulto, mas algumas pesquisas recentes concedem um auteloso apoio ao papel dos SNPs do gene HNF#A na suscetibilidade a0 T2D. Muitas mutagoes diferentes no DNA mitocondrial foram relacionadas ao diabete, vezes complicadas por outros aspectos, como a surdez. Existe alguma evidéncia de mau funcionamento das mitocdndrias no T2D tipico (veja Stumvoll et al., 2005), mas znenhuma variante no DNA mitocondrial foi associada significativamente ao tipo comum de 72D. “Ni deT. A calseailesrina € uma proteins de Iga que e¥t presente no miscues cada € sequesta © ‘cio contra um gradiente de concentra. Fonte: Dicondrio de bilgi cellar, ile dos ides eprocssos Ptligices gers Disponivel em: wwf. cu brinstpubintrypatgedticaz hm. Acesado em 0617/2007 “ NedeT Do inglés, maturiy-nset diets inthe yours."348 ANDREW READ & DIAN DONNAI ‘genes para dabete, ‘alipocnas, inamas, Fiperghicemia, ‘cos ras ives, outros fatores aot aaa deaicse (t) DESENCADEANTES ——_-MEQADORES ROS OE raasoe Roms pe 'NIBOORES DESMA ceaNncto nah MNO igura 13.9 Patofisiologia do diabete tipo 2(T2D).. {@) A redugSo da secregio de insulina ea resisténcia organic final 3 insulina causa o aumento dos niveis de glicase ede acidos graxos no sangue, podendo tornar-se auto-eforcadores (b) “Mecanismo pelo qual a nsulina controla a homeostasia da glicose, bem como os fatores que oin- fluenciam, NEFA, dcidos graxos ndo-esterificados; TNFay fator de necrose tumoral a PTP1B,fosfot- rosinofosfatase 1B; PKC, proteinaquinase C: IKKB, lkappa-8-quinase B, quinase da unidade inibidora {de NFkB (um ativador dofator de transcrig8o nuclear NFxB); SOCS-3, supressor de sinalizagSo de cocina 3;PTEN, proteinatisnofosfatase IRS, substrato receptor de insulina Pl, fosfoinosito: Pi ‘quinase, fosfatidilinositol-3-quinase. Ambas as figuras s80reproduzidas de Sturwoll etal. (2005), ‘com permissao de Elsevier.GENETICA CLINICA 349, ‘Na sua totalidade, as pesquisas genéticas em T2D de inicio no adulto foram marcadas or investimentos macigos de tempo e recursos, para retornos muito escassos. Algu- ‘mas pessoas afirmam que isso decorre da hipétese errénea que esta sendo obstinada- ‘mente pesquisada e que 0 T2D é, de fato, um transtorno da programacio epigenética, como descrita no Capitulo 7. No entanto, dados os numerosos participantes possiveis em sua patogénese (veja Figura 13.9), ¢ inteiramente provavel que 0 problema seja uma heterogeneidade genética extensa, sem variantes génicas de efeito maior: Recomenda- se a leitura da revisio de Florez etal. (2003), nao pelos seus detalhes reais, mas porque oferece um bom panorama da extrema dificuldade de serem alcangadas conclusoes definitivas nessa area, 13.4 Resumoe extensao Os exemplos da doenca de Alzheimer e do diabete tipo 2 sao bastante tipicos da na- tureza frustrante das pesquisas em genética das doencas complexas. Toda essa area tem-se revelado muito mais dificil do que a maioria das pessoas esperava. Quando 4 comunidade genética comecou os estudos de pares de irmios afetados (ASP) em doencas comuns, no inicio da década de 1990, muitas pessoas acreditavam que a maior parte dos seus fatores seria identificavel pela testagem de algumas centenas de pares de irmaos afetados. Em conclusao, os escores lod em geral eram fracos, & os estudos de cada doenga foram atribulados pela incapacidade de se repetirem os resultados positivos. 0 fracasso na replicagao de um resultado nao significa, necessariamente, que esse re- sultado estava errado. Um estudo inicial do genoma inteiro descreveri alguma regio ue oferece um interessante escore lod. Um estudo de repetigao tem de encontrar um bom escore para essa regiso particular ~ evidentemente, & uma tarefa mais dificil. Esses cestudlos estao apenas no limite minimo da eficigncia necesséria para detectarem algum feito dos locus de suscetibilidade. Se houver mais de uma dezena de lécus de susce- tibilidade, é bastante improvavel que um estudo reproduza os resultados de outro. Por ‘mais compreensivel que tal aspecto possa ser, ndo auxilia os pesquisadores a identifica- rem as verdadeiras ligagdes, em meio a um mar de resultados nao muito significativos, Apesar da robustez do método ASP, cilculos efetuados por Risch ¢ Merikangas (1996) ‘mostraram que esse método € apenas capaz de detectar os fatores de suscetibilidade extremamente potentes (Tabela 13.7). A conclusao de 15 anos de esforcos & de que a suscetibilidade as doencas mais comuns € o resultado cumulativo de muitos fatores fracos, em vez de poucos fatores fortes. artigo de Risch e Merikangas foi de enorme influéncia, porque nao somente iden- tificou um problema, mas propds uma solugo. Esses autores mostraram que os es- tudos de associagao poderiam detectar muito mais fatores fracos de suscetibilidade do que a anilise de ligagao, utilizando um niimero viavel de sujeitos. Seus clculos ajudaram a estimular uma importante mudanga dos estudos de ligacdo para os de associacao. Geralmente, os estudos de associacdo tomaram a forma dos estudos de caso-controle de polimorfismos em genes candidatos sugeridos pela conhecida bi quimica ou fisiologia da doenca em questo. Todavia, os estudos de associacao en- frentam numerosos problemas.350 ANDREW READ & DIAN DONNAl ‘Tabela 13.7 Nameros de pares de irmaos afetados necessérios para a detecgao de um fator de suscetibilidade a doenga Risco relative da doenca devida aeste locus Bea BK 2ae Probabllidade do compartihamentode 063405560536, alelos pelos irméos afetados Numeros de pares de irmios afetados 04 5591366 necesséri para detectar 0 efeito ‘handle de pares de imios aftados&efiiete para detecta os fatores que aumentam orscoelativoem mals ees vezes.O escasto reqisto ca aera da andi de pares de nos afetados suger que a maior Gos ators de isco tem um eft menor do que o mencionado, Dados de Risch e Merkangas (1996) Problemas dos estudos de associagao Testagem multipla Os estudos de associagao produziram, mais de uma vez, uma abundancia de descrighes de resultados positives, dos quais pouquissimos foram confirmados. A revisio feita por Florez etal. (2003) proporciona uma boa esséncia dos dados de uma drea. Um dos problemas ¢ a testagem miiltipla. Quando um grande niimero de SNPs é testado par associagio a uma doenca, é necessario ponderar sobre olimiar ce significincia estatis- tica. Consideremos os dois limiares possiveis: + uma probabilidade (P) de 0,05 de que este SNP especifico mostre um grande desvio do que seria esperado aleatoriamente = uma probabilidade de 0,05 de que qualquer um dos 1.000 SNPs testados mostre um grande desvio do que seria esperado aleatoriamente Evidentemente, o resultado que é significativo, usando o limiar mais estrito, mostra maior credibilidade. Esse aspecto é andlogo ao dos limiares de ligacio, mostrados no Quadro 13.3. A correcio mais rigorosa para a testagem miiltipla (corregao de Bonferro- ni) & multiplicar o valor de P para cada comparacao pelo ntimero de comparagdes feitas. ‘Assim, com 1,000 testes de SNP, é necessario um valor individual de P de 0.00005 para fornecer tm valor total de P de 0,05. Naturalmente os pesquisadores estarao pouco inclinados a relatar uma associacao a um valor de P de 0,0001 se esse for o melhor re~ sultado de muitos meses de trabalho arduo. Repetindo um resultado positivo Se houver 20 associacbes verdadeiras a doenca, mas somente uma for detectada em um estudo, essa associacao provavelmente ultrapassou o limiar de significincia devido 4 uma feliz combinagdo de genotipos nas amostras especifcas utilizadas. £ provavel {que um estudo de repeticio nao a encontre, mesmo que seja verdadeira, a menos que ‘o estudo de tepeticao seja estatisticamente mais poderoso do que o original. Um meio de conseguir alto poder estatistico ¢ limitar o nimero de comparagdes feitas ~ mas naturalmente é frustrante passar por todo o trabalho de coletar a amostra da repeti- io e depois tipificé-la apenas para alguns marcadores, quando seu laborat6rio esta bem equipado para fazer outra triagem gendmica ampla. Entretanto, a metandlise dos cestudos de associagao em diversas doencas (Lohmueller et al., 2003) forneceu algum ‘espaco para um otimismo cauteloso. Todos os estudos descritos de associagao de T2D, transtorno bipolar e esquizofrenia, foram considerados, além de todos os estudos deFigura 13.10 Teste de desequilt- brio de transmissio (TDT). Aestatstica do teste tem uma distribu ciodey GENETICA CLINICA 351) outras vito associagdes relatadas, escolhidas aleatoriamente. Em conjunto, todos os estudos publicados de 25 associagdes de um gendtipo especifico com uma doenga par- ticular foram analisados. Para oito dessas 25, a metandlise sustentou uma associagdo verdadeira, a passo que para as restantes 17 a associagao foi inconclusiva ou negativa As razdes de risco para as oito associagdes confirmadas variaram de 1,07 a 2,28, A con- clusdo geral foi de que as associagoes descrias inicialmente podiam, muitas vezes, ser verdadeiras, mas sua confirmacao necessitaria de estudos muito mais amplos do que os que sao usualmente realizados, e que as razdes de risco relatadas no inicio eram quase sempre altas demais, pelo motivo acima explicado. Pareando casos e controles Um aspecto dificil, nos estudos de associacdo, é 0 pareamento de casos ¢ controles. pareamento de sexo e idade nao deve ser importante — a freqiiéncia de um alelo marca- dor nao deve depender de nenhuma dessas variaveis, mas sera suficiente usar pessoas de mesmos grupo étnico e pais como controles, ou devem ser da mesma localidade? Muitas populacoes mostram estrutura em fina escala, como & esperado, uma vez que & mais provavel que as pessoas locais fagam parte da mesma familia ampliada. As associa- «des fortes nao devem ser sensiveis as pequenas variagoes locais nas freqliéncias dos alelos dos marcadores, porém os grandes estudos atuais procuram efeitos muito sutis €, portanto, precisam de um pareamento de controles mais cuidadoso. Uma solucao usar controles internos, em que 0 cromossomo naio-transmitido de um genitor & usado como um controle (é 0 teste de desequilibrio de transmissao, TDT), Teste de desequilibrio de transmissdo: 0 TDT evita qualquer risco de um mau Pareamento entre casos ¢ controles mediante uso dos cromossomos parentais ndo- transmitidos no papel de controles. A amostra de estudo constitui-se dos casos e de seus dois genitores, sendo irrelevante se esses tltimos sao afetados, ot nao. Para testar ‘a associagao a um alelo particular de um marcador, somente os genitores heterozigotos para esse alelo sao informativos. 0 teste compara simplesmente a freqiiéncia com que © genitor heterozigoto transmitiu o alelo em questao, nao seu outro alelo, a0 individuo afetado (Figura 13.10). A significancia ¢ avaliada por meio de um simples teste de © TDT € muito adequado para as doencas infantis, mas deve ser dificil para a doenca de Alzheimer de inicio tardio, uma vez que os genitores das pessoas afetadas jé devem ter morrido ha muito tempo. As variantes do TDT usam os irmaos para contornar esse problema. Encontrando a real variante causadora Se uma associagio & repetidae os controles parecem satisfatsrios, a proxima questao é identidade do verdadeiro fator de suscetibilidade. Como ja mencionado, a verdadeira variante causadora pode nao ser o SNP usado para estabelecer a associacao, mas algo que estd em desequibrio de ligagio com ele. Nas condigdes mendelianas, 0 seqlen- ciamento de genes candidatos geralmente revelaré as mutagoes convincentes. Para a doengas complexas, os fatores de suscetbilidade podem ser variantes muito menos

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  4.5/5 (24586)
• Never Split the Difference: Negotiating As If Your Life Depended On It

  

  No Everand

  Never Split the Difference: Negotiating As If Your Life Depended On It

  Chris Voss

  Nota: 4.5 de 5 estrelas

  4.5/5 (3278)
• Pride and Prejudice: Bestsellers and famous Books

  

  No Everand

  Pride and Prejudice: Bestsellers and famous Books

  Jane Austen

  Nota: 4.5 de 5 estrelas

  4.5/5 (19653)
• The Art of War: A New Translation

  

  No Everand

  The Art of War: A New Translation

  Sun Tzu

  Nota: 4 de 5 estrelas

  4/5 (3044)
• The 7 Habits of Highly Effective People

  

  No Everand

  The 7 Habits of Highly Effective People

  Stephen R. Covey

  Nota: 4 de 5 estrelas

  4/5 (353)
• Habit 6 Synergize: The Habit of Creative Cooperation

  

  No Everand

  Habit 6 Synergize: The Habit of Creative Cooperation

  Stephen R. Covey

  Nota: 4 de 5 estrelas

  4/5 (2499)
• Habit 3 Put First Things First: The Habit of Integrity and Execution

  

  No Everand

  Habit 3 Put First Things First: The Habit of Integrity and Execution

  Stephen R. Covey

  Nota: 4 de 5 estrelas

  4/5 (2507)
• The 7 Habits of Highly Effective People

  

  No Everand

  The 7 Habits of Highly Effective People

  Stephen R. Covey

  Nota: 4 de 5 estrelas

  4/5 (2567)
• How To Win Friends And Influence People

  

  No Everand

  How To Win Friends And Influence People

  Dale Carnegie

  Nota: 4.5 de 5 estrelas

  4.5/5 (6521)
• Good Omens

  

  No Everand

  Good Omens

  Neil Gaiman

  Nota: 4.5 de 5 estrelas

  4.5/5 (12010)
• Good Omens: A Full Cast Production

  

  No Everand

  Good Omens: A Full Cast Production

  Neil Gaiman

  Nota: 4.5 de 5 estrelas

  4.5/5 (10907)
• Remarkably Bright Creatures: A Novel

  

  No Everand

  Remarkably Bright Creatures: A Novel

  Shelby Van Pelt

  Nota: 4.5 de 5 estrelas

  4.5/5 (5511)
• The Perfect Marriage: A Completely Gripping Psychological Suspense

  

  No Everand

  The Perfect Marriage: A Completely Gripping Psychological Suspense

  Jeneva Rose

  Nota: 4 de 5 estrelas

  4/5 (1108)
• And Then There Were None

  

  No Everand

  And Then There Were None

  Agatha Christie

  Nota: 4.5 de 5 estrelas

  4.5/5 (8934)
• Wuthering Heights (Seasons Edition -- Winter)

  

  No Everand

  Wuthering Heights (Seasons Edition -- Winter)

  Emily Bronte

  Nota: 4 de 5 estrelas

  4/5 (9486)
• The Iliad: A New Translation by Caroline Alexander

  

  No Everand

  The Iliad: A New Translation by Caroline Alexander

  Homer

  Nota: 4 de 5 estrelas

  4/5 (5718)