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Mtodos cromatogrficos - Cromatografia em coluna - Profa. Neli K. Honda - 2008

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL

CENTRO DE CINCIAS EXATAS E TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE QUMICA

MTODOS CROMATOGRFICOS

CROMATOGRAFIA EM COLUNA
(Texto para fins didticos)

Profa. Dra. Neli Kika Honda

Campo Grande - MS, 2008

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CROMATOGRAFIA EM COLUNA

Cromatografia em coluna - foi o primeiro tipo de cromatografia desenvolvido por Tswett

e aperfeioado por outros pesquisadores. O mtodo cromatogrfico foi desenvolvido como uma
ferramenta visando atender processos de anlise, isolamento e purificao - especialmente de
pigmentos. Assim, o trabalho inicial de Tswett foi a separao de pigmentos de plantas usando
uma coluna de carbonato de clcio e eluda com ter de petrleo.

ter de petrleo
Mistura de
pigmentos

CaCO3 clorofilas

Xantofila

caroteno

Figura 1 Representao esquemtica do sistema cromatogrfico de Tswett.

As publicaes de Tswett relatando a separao dos pigmentos, portanto, descrevendo

um novo mtodo de separ-los, no receberam da comunidade cientfica da poca a ateno e
o respeito devido, at pelo contrrio foram motivos de crticas de alguns pesquisadores .
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Devido a isso, houve um perodo de dormncia que terminou em 1931, quando o grupo
de Richard Kuhn, em Heidelberg, demostrou a superioridade da cromatografia em relao a
outros mtodos utilizados at ento.
Nesse intervalo de 25 anos (entre as duas mais importantes publicaes de Tswett e o
incio dos trabalhos em Heidelberg), somente uns poucos cientistas reconheceram a
importncia da cromatografia como uma tcnica de separao e a utilizaram em suas
pesquisas. Entre esses, Charles Dhre, na Sua e Leroy Sheddon Palmer, nos Estados
Unidos.
Charles Dhre nasceu em Paris (05/03/1876) e estudou medicina, recebendo seu grau
de Doutor em 1898 e a tese teve como tema as investigaes relacionadas ao sistema
nervoso central. Dhre nunca exerceu a profisso de mdico. Atuou como professor assistente
no Departamento de Cincias Naturais da Universidade de Sorbone e em 1900 foi trabalhar
tambm como professor associado (colaborador) de fisiologia, qumica biolgica e
microbiologia na Universidade de Friburgo na Sua. Em 1908 tornou-se professor efetivo e em
1909 recebeu o grau de Doutor em Cincias pela Universidade de Sorbone, com uma tese
sobre a investigao de albuminas, protenas e seus derivados usando espectroscopia
ultravioleta. O interesse maior de Dhr foi a investigao de substncias biologicamente
importantes, particularmente por espectroscopia ultravioleta e de fluorescncia.
Naturalmente, o pr-requisito de qualquer investigao espectroscpica dispor de
substncias puras. Devido a isso, Dhr tornou-se interessando desde o incio de sua carreira
profissional em tcnicas fundamentais de laboratrio que pudessem ser usadas para esse
propsito. Uma delas foi a eletrodilise e Dhr contribuiu significantemente para o
desenvolvimento dessa tcnica. Seu interesse em mtodos permitiu a separao de
substncias biolgicamente importantes e a preparao dessas em forma pura, tambm o
conduziu cromatografia.
Dhr comeou a usar a cromatografia em torno de 1911 e o primeiro trabalho em que
isto documentado a tese de doutorado de Wladyslaw de Rogowski, um estudante de
Warsaw. Poucos anos depois, a tcnica cromatogrfica foi melhorada no trabalho de um outro
estudante de graduao, Guglielmo Vegezzi.
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O TRABALHO DE ROGOWSKI

O sistema cromatogrfico de Rogowski (diferente daquela elaborada por Tswett), uma

coluna de vidro fechada em seu extremo inferior com uma rolha de cortia tendo vrias
perfuraes; a coluna era apoiada em um disco de porcelana perfurado e mantido por uma luva
de vidro (Figura 2). CaCO3 a 150oC por 10 horas foi usado como adsorvente; a altura da coluna
empacotada no tubo era 60-80 mm.
Aps a separao - aparecimento de anis coloridos - a coluna empacotada foi lentamente
removida para fora do tubo e os anis foram cuidadosamente separados um do outro e do
restante do material da coluna. Isso representou um grande avano, pois por muito tempo era
um problema isolar e coletar os anis separados sem que ocorresse perdas e contaminao
pelos compostos presentes nos outros anis.
Rogowski, aps seu doutorado no se envolveu mais em nenhum trabalho cientfico. Foi
um educador na Polnia e no Brasil (trabalhou em escolas para filhos de imigrantes
poloneses); foi escritor e poeta; poltico e um pioneiro em mtodos de agricultura moderna ;
quando necessrio servia seu pas contra aqueles que desejavam destru-lo. Sobreviveu a
guerra e poucos dias aps a libertao de Warsaw, Rogowski foi arrastado pelo Exrcito
Vermelho. Morreu em 1945 em um campo de concentrao russo.
O outro aluno - Guglielmo Vegezzi - desenvolveu sua tese de doutorado sob orientao de
Dhr em 1913 e aps interrupo para cumprir o servio militar, terminou seu trabalho em
1916. O objetivo da tese foi a investigao espectroscpica de vrios pigmentos presentes em
invertebrados, tais como aqueles da bile e fgado de Helix pomatia (escargot). Essas
investigaes foram muito importantes porque representaram a primeira aplicao da
cromatografia na preparao desses pigmentos na forma pura, permitindo a medida de suas
bandas de absoro na luz UV e suas fluorescncias.
O sistema cromatogrfico de Vegezzi diferiu um pouco daquele de Rogowski. A luva externa
de vidro se estendeu em todo o comprimento da coluna cromatogrfica. Dhr implicou que no
sistema de Rogowski, a parte superior da coluna no poderia ser vista adequadamente devido
a rolha de borracha superior bloquear a viso e isto foi a razo da mudana (Figura 3).
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Figura 2 Sistema cromatogrfico de Figura 3 Sistema cromatogrfico de Vegezzi.

Rogowski.

A partir desses modelos, outros foram propostos e atualmente a cromatografia em

coluna uma das tcnicas mais versteis e usada para a separao de substncias. Para a
realizao das separaes em coluna so disponveis diversos tipos de suportes.
A cromatografia em coluna aberta convencional universalmente utilizada como um
resultado de sua simplicidade de operao. Usando slica possvel separar, por exemplo, 30
mg de amostra por grama de um suporte 50-200 m; porm, isto possvel quando as
substncias diferem grandemente em seus valores de Rf. Propores de 50 mg ou 100 mg por
grama de slica, so as mais comuns. Em algumas situaes, quando se pensa em filtrao, a
slica gel pode ser usada na proporo de 1 grama por 10 gramas de slica gel. Definida a
escolha do suporte com base na natureza das substncias a separar e a proporo amostra :
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adsorvente, escolhe-se a coluna e os solventes que sero utilizados para o processo

cromatogrfico.

TIPOS DE SUPORTES PARA CROMATOGRAFIA EM COLUNA

CELULOSE
AMIDO AUMENTA A FORA
SACAROSE DE INTERAO
SULFATO DE CLCIO FRENTE A COMPOSTOS POLARES
CIDO SILCICO
SLICA GEL
FLORISIL
XIDO DE MAGNSIO
XIDO DE ALUMNIO (ALUMINA)
CARVO ATIVO

A alumina pode ser preparada com diferentes graus de atividade. A alumina atividade grau I
o
a mais ativa preparada pelo aquecimento a 400 C por 4 horas ou at no ocorrer mais dessoro
de gua); Alumina atividade grau II tem 2-3% de gua (adicionada a de grau I); Alumina atividade
grau III tem 5-7% de gua; Alumina atividade grau IV 9-11% de gua; Alumina atividade grau V
15% de gua (menos ativa).

ESCOLHA DO ELUENTE

A escolha do eluente depende da natureza das substncias a separar. A eluio dos

compostos pode ser esquematizada como na pgina seguinte (TIPOS DE COMPOSTOS E
SEQNCIA DE ELUIO). Os eluentes mais utilizados em cromatografia em coluna esto
relacionados tambm na pgina seguinte.
A seleo de eluentes para o desenvolvimento da coluna cromatogrfica pode ser feita
mediante uma avaliao preliminar do comportamento da amostra em uma srie de solventes.
A partir do resultado seleciona-se de preferncia dois solventes que em propores diferentes
(gradiente de polaridade) possam favorecer a eluio das substncias contidas na amostra em
anlise.
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TIPOS DE COMPOSTOS E SEQNCIA DE ELUIO

HIDROCARBONETOS Eluiro mais rapidamente com solventes menos polares

OLEFINAS
TERES
HIDROCARBONETOS HALOGENADOS
AROMTICOS
CETONAS ORDEM DE ELUIO
ALDEDOS
STERES
ALCOIS Eluiro mais lentamente
AMINAS necessrio um solvente mais polar
CIDOS E BASES FORTES

ELUENTES POLARIDADE RELATIVA

n-HEXANO 0,00 ETANOL 5,20
TRIMETILAMINA 1,80 PIRIDINA 5,30
TOLUENO 2,30 ACETONA 5,40
TER DIETLICO 2,90 METOXIETANOL 5,70
BENZENO 3,00 METILFORMAMIDA 6,20
DICLOROMETANO 3,40 CIDO ACTICO 6,20
t-BUTANOL 3,90 ACETONITRILA 6,20
TETRAIDROFURANO 4,20 DIMETILFORMAMIDA 6,40
ACETATO DE ETILA 4,30 DIMETILSULFXIDO 6,50
CLOROFRMIO 4,40 METANOL 6,60
DIOXANO 4,80 FORMAMIDA 7,30
GUA 9,00
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PREPARO DA COLUNA

O preenchimento da coluna pode ser feito com o suporte (adsorvente) seco, ou,
umedecido no solvente apropriado. Para evitar o escoamento do adsorvente fora da coluna,
deve-se colocar um pequeno pedao de algodo; algumas colunas so dotadas de um disco
de vidro sinterizado. Se o preenchimento da coluna feito com o adsorvente umedecido,
necessrio manter a coluna com uma certa quantidade de solvente e o adsorvente umedecido
adicionado gradativamente. Aps adicionar o adsorvente coluna, deve-se passar o eluente
(ou o solvente puro) at empacotamento adequado. A amostra pode ser aplicada coluna sob
a forma de soluo ou de pastilha. A pastilha preparada pela dissoluo da amostra no
solvente adequado e a soluo misturada com uma pequena quantidade do adsorvente.
Aps evaporao total do solvente, a mistura slida aplicada no topo da coluna.
Dependendo do tamanho da amostra ( em conseqncia o tamanho da coluna) define-se
tambm o volume de cada frao a ser coletado. A eluio em geral monitorada pela
cromatografia em camada delgada.

Um outro tipo de cromatografia a COLUNA SECA. A coluna preenchida com o adsorvente

seco na proporo de 1:70 at 1: 300. A coluna um tubo de vidro ou tubo de nailon malevel
e resistente aos solventes e transparente luz UV. A amostra aplicada no topo da coluna e
utiliza-se um nico eluente que pode ser o mesmo usado em CCD. A adio do eluente feita
at que o mesmo alcance a parte inferior da coluna. As bandas separadas so removidas pelo
corte da coluna ou pela retirada cuidadosa do adsorvente da coluna. As substncias (bandas
separadas) so removidas do adsorvente pela extrao com solvente adequado. A vantagem
dessa tcnica a reduo do tempo de operao e a reduo no consumo de solventes.

A cromatografia em coluna aberta convencional universalmente praticada nos

laboratrios como um resultado de sua simplicidade de operao. Entretanto, apresenta
algumas limitaes, tais como: separaes lentas; adsoro irreversvel de solutos e
incompatibilidade com partculas de pequena granulometria. Visando superar algumas dessas
desvantagens, tem sido propostos meios alternativos para cromatografia preparativa. Uma das
tcnicas a filtrao sobre slica e usada para o fracionamento preliminar de extratos (figura
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A slica pode ser a de camada fina e os solventes em geral so passados puros, no em

misturas, como por exemplo, n-hexano, diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol.
Cada extrato concentrado e novamente fracionado por cromatografia em coluna no modo
convencional, ou utilizando uma das tcnicas seguintes.

eluente

adsorvente

vcuo

Figura 4 Representao esquemtica do sistema para cromatografia sob vcuo.

CROMATOGRAFIA LQUIDA SOB PRESSO

O tamanho de partculas, ou seja, a granulometria do suporte um dos fatores que

interfere na eficincia da separao dos componentes de uma mistura. Dependendo do
tamanho de partcula da fase estacionria, pode ser necessrio o uso de presso para
promover a eluio da coluna. Os primeiros registros desse tipo de cromatografia relatam o uso
de slicagel G (usada em CCD) em colunas curtas de 3-10 cm de dimetro e 7-15 cm de
comprimento. As separaes eram conduzidas pela aplicao de presso de um cilindro de
nitrognio.

CROMATOGRAFIA FLASH - A cromatografia flash foi elaborada visando reduzir o tempo de

eluio em relao cromatografia em coluna convencional. O sistema relativamente simples
e separaes preparativas so relativamente fceis de executar usando o material de vidro
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disponvel no laboratrio. Por essa razo, a cromatografia flash bastante usada nos
laboratrios de pesquisa para a separao de substncias.

O sistema constitudo de uma coluna de vidro de comprimento apropriado a qual

preenchida com o adsorvente (seco ou mido). O empacotamento a seco melhor mas exige o
consumo de grande quantidade de solvente at que o suporte se torne totalmente mido.
necessrio deixar um espao adequado acima do suporte para alimentar a coluna com eluente.
A amostra introduzida e a coluna fechada com uma vlvula capaz de controlar a presso do
ar comprimido aplicado. Dessa maneira, podem ser aplicadas presses de cerca de 2 bar
acima da presso atmosfrica - suficiente para eluir a amostra. Dependendo do tamanho da
coluna, amostras de 0,01 a 10,0 gramas podem ser separadas em apenas 15 minutos.

Slica LiChroprep 60 (25-40 m - Merck); Slica gel 60 ( 40-63 m ou 63-200 m Merck) so os

suportes mais usados. Com a slica 63-200 m (70-230 mesh) podem ser obtidas velocidades
de fluxo de 50 mL.min-1. A purificao final de produtos naturais algumas vezes conduzida
por cromatografia flash, entretanto, mais freqentemente a tcnica usada como pr-
purificao de extratos brutos ou misturas, antes do uso de outras tcnicas de maior resoluo.

Figura 5 Representao de um modelo de coluna cromatogrfica para

desenvolvimento sob presso
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COLUNAS LOBAR Alm das colunas preparadas no laboratrio, o sistema de colunas

LOBAR o mais popular da cromatografia lquida preparativa de baixa presso. As colunas
so de vidro e o material empacotado fechado e o sistema conectado uma bomba. As
colunas so comercializadas com diferentes fases estacionrias e so recuperadas aps o uso.
Nos sistemas de fase reversa, o tamanho de partcula grande (40 60 m) e devido a isso,
se obtm alta velocidade de fluxo com baixas presses. As colunas de slica so preparadas
com o material de granulometria para cromatografia em camada delgada.
A amostra (quantidade mxima de 5,0 gramas) aplicada coluna atravs de uma seringa e
as presses usadas esto na faixa de 5 a 6 bar.
A simplicidade do conjunto a razo do amplo uso dessas colunas.

Figura 6 Representao de um tipo de Coluna Lobar

CROMATOGRAFIA LQUIDA DE MDIA PRESSO (MPLC)

Com o advento das colunas pr-empacotadas em 1971, teve incio uma importante fase
no desenvolvimento de metodologias de cromatografia lquida preparativa. A limitao das
colunas LOBAR a separao de amostras maiores que 5,0 gramas. Para acomodar amostras
dessa ordem de grandeza, ou maiores, foi introduzida a CROMATOGRAFIA LQUIDA DE
MDIA PRESSO. Esse tipo de cromatografia envolve o uso de colunas mais longas com
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grandes dimetros internos (as quais podem ser facilmente preenchidas) e requer presses
mais altas que a cromatografia lquida de baixa presso para favorecer alta velocidade de fluxo
do eluente. A tcnica de MPLC considerada uma complementao ao mtodo de
Cromatografia lquida de coluna aberta (convencional) e a cromatografia flash com melhor
resoluo e tempo de separao mais curto.
As colunas podem ser preenchidas com suporte seco ou umedecido no solvente
apropriado. O mtodo de preenchimento seco d uma densidade de empacotamento 20% mais
alta que a tcnica de suporte mido e conduzida manualmente. Aps enchimento da coluna
e a pr-coluna (10% da coluna), o conjunto conectado a um cilindro de nitrognio. Nitrognio
passado na coluna com presso de 10 bar .

Figura 7 Representao esquemtica de um sistema cromatogrfico de mdia presso

(MPLC)

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS:

ABBOTT D., & ANDREWS, R.S. - Introduccin a la cromatografia, 3ed. Editorial Alhambra S., 1973.

HOSTETTMANN, K., HOSTETTMANN, M., MARSTON, A. Preparative Chromatography Techniques -

Applications in Natural Products Isolation - Springer-Verlag, Heidelberg-Berlin, 1986.

MEYER, V.R., & ETTRE, L.S. Early evolution of chromatography : the activities of Charles Dhre. J.
Chromatogr. 600 : 3-15, 1992.

a
COLLINS, C.H., BRAGA, G.L., BONATO, P.S. Introduo a mtodos cromatogrficos. 7 ed. Editora
Unicamp, 1997.