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APLICACIN DE LA VOLTAMETRA EN EL
ANLISIS DEL CRECIMIENTO
MICROBIOLGICO

Article January 2007

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Houari Cobas Sonnia Pavoni

17 PUBLICATIONS 11 CITATIONS Universidad Tecnolgica de la Habana, Jos
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 VII Congreso de la Sociedad Cubana de Bioingeniera
Habana 2007

APLICACIN DE LA VOLTAMETRA EN EL ANLISIS DEL

CRECIMIENTO MICROBIOLGICO

H. Cobas, S. Pavoni, A. Zayas, F. Rodrguez, E. lvarez, R. Contreras

Centro de Investigaciones en Microelectrnica, Antigua Carretera de Vento, km 8 , Boyeros.

hcobas@electrica.cujae.edu.cu

RESUMEN ocurren en los electrodos. Entre ellas se encuentran la

En este trabajo se presenta el seguimiento del ciclo de
vida de la bacteria Escherichia coli mediante la utilizacin
de la tcnica de voltametra de barrido lineal empleando
microceldas planas de platino y microvolmenes de
muestras. La instrumentacin electroqumica utilizada se
compone de una computadora como instrumento virtual
sobre la que corre un programa diseado en LabVIEW,
una tarjeta de adquisicin de datos (NI-6014) y un
potenciostato. Como referencia se emplea el sistema
DIRAMIC. Se obtienen las curvas de crecimiento a partir
de determinar el valor del pico de corriente (Ip) para cada
voltamograma, el ancho del mismo (W) y la turbidez de la
muestra leda con el DIRAMIC. En las curvas de Ip y W
se diferencian claramente la fase de latencia del resto de
las fases del ciclo de vida. Se filtran los datos de las tres
curvas y se comparan los de Ip y W con los de turbidez.
De la comparacin de Ip y turbidez se obtuvo un
coeficiente de correlacin del 83,2 % cuando se
analizaron las cuatro zonas que componen el ciclo de
vida y 92,7 % al excluir la ltima zona. Para el caso de
la comparacin de W y turbidez la correlacin fue del
83,6 % al analizar todas las zonas y 91,08 % al excluir
la cuarta. Se aprecia una correspondencia general entre
la evolucin de los voltamogramas y las fases de
crecimiento microbiolgico, lo que evidencia la
potencialidad del empleo de esta tcnica en el estudio de
las mismas.
Palabras clave: crecimiento microbiolgico, Escherichia
coli, voltametra de barrido lineal, microelectrodos.
1. INTRODUCCIN
Como voltametra se denomina a un conjunto de
tcnicas de anlisis electroqumico que permiten la
deteccin de especies electroactivas contenidas en un
electrolito. Estas tcnicas consisten en aplicar una tensin
controlada entre los electrodos de una celda electroltica y
medir la corriente que se genera en la misma como
consecuencia de reacciones de oxidacin-reduccin que
voltametra cclica, donde la forma de onda es triangular y
la voltametra de barrido lineal, donde la tensin se vara
linealmente en el tiempo. Como resultado, se obtienen
curvas de corriente-tensin, conocidas como
voltamogramas. Desde el punto de vista analtico, estas
tcnicas de medicin han resultado de inters para el
desarrollo de muchos sensores electroqumicos.
El anlisis microbiolgico es importante para el
diagnstico de enfermedades, el control de la calidad del
agua y de los alimentos, etc. El empleo de la voltametra
cclica para el estudio de muestras microbiolgicas se
reporta desde la dcada de 1980 cuando Matsunaga [1, 2]
y sus colaboradores desarrollaron una celda de medicin
de 25 ml de volumen, constituida por un electrodo de
grafito y una membrana para filtrar y atrapar
microorganismos. La celda se conectaba a un sistema de
tres electrodos (alambre de platino como auxiliar y
electrodo saturado de calomel como referencia) y para
medir se insertaba en una cubeta con el cultivo bacteriano.
Al aplicar voltametra cclica de 0 a 1 V con diversas
especies bacterianas, se manifestaron picos de oxidacin
en 0,7 V con respecto al electrodo saturado de calomel.
Resultados similares se observaron por Subrahmanyam
[3] con muestras de hongo Aspergillus terreus. En ese
caso se emple un electrodo de trabajo de oro de 0,2 cm2
inmerso en 100 ml de medio de cultivo, igualmente
conectado en un sistema de tres electrodos con electrodo
saturado de calomel como referencia.
Recientemente se report la aplicacin de la
voltametra de barrido lineal de 0 a 1 V con microceldas
conformadas por dos microelectrodos planos de platino y
gotas 10 l de volumen de cultivos de Escherichia coli [4,
5, 6]. Independientemente de la velocidad de barrido, se
obtuvieron voltamogramas sin pico de corriente para las
muestras que se encontraban en fase de latencia y
voltamogramas con pico de corriente cuando la muestra se
encontraba en fase de crecimiento exponencial. De esta
forma poda determinarse la duracin de la fase de
latencia y relacionarlas con la concentracin inicial de las
clulas bacterianas en el cultivo. Sin embargo, la
investigacin se limit a las dos primeras fases del
crecimiento del microorganismo. El objetivo de este

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trabajo es extender el anlisis voltamtrico al resto de las
fases de crecimiento de la Escherichia coli para discutir las
potencialidades de las voltametras de barrido lineal en el
estudio de las fases de crecimiento microbiolgico, con el
empleo de microceldas planas de platino y
microvolmenes de muestras.
2. METODOLOGA
Crecimiento microbiolgico
El crecimiento microbiolgico est dado por el
incremento en el nmero de clulas en una poblacin de
microorganismos [7]. Una curva tpica de crecimiento en
un medio de cultivo se presenta en la Fig. 1. En ella
pueden identificarse cuatro fases principales. Inicialmente
se transita por una etapa de latencia en la que los
microorganismos se adaptan al nuevo ambiente y no hay
crecimiento celular aparente. A continuacin ocurre la
fase de crecimiento exponencial, donde la masa bacteriana
crece hasta que se agotan los nutrientes y se acumulan
sustancias txicas que inhiben el crecimiento. Luego se
alcanza la fase estacionaria que se caracteriza por un cese
del crecimiento poblacional debido a la compensacin de
la formacin y muerte de clulas. Finalmente se llega a la
fase de muerte.
Fig.1. Curva tpica de crecimiento de una poblacin
microorganismos.
Preparacin de las muestras microbiolgicas
En el trabajo experimental se utilizaron colonias de la
cepa estndar de laboratorio Escherichia coli ATCC
25922 y el medio de cultivo lquido DIRAMIC Kit
Diagnstico (DKD) [8]. Como sistema de medicin de
referencia para la determinacin de la concentracin
celular se utiliz el equipo para el Diagnstico Rpido
Microbiolgico DIRAMIC [9]. Este instrumento permite
detectar los cambios de turbidez debido al crecimiento
microbiano en muestras contenidas en un frasco de vidrio
de 4,5 ml e indica los valores de turbidez en la escala
estndar de McFarland (1 McFarland 3x108 cl/ml).
Se prepararon 40 muestras en frascos de vidrio de
4,5 ml, cada una con concentracin inicial del orden de
1x106 cl/ml de E. coli en el medio de cultivo. Para
favorecer el crecimiento, las muestras se pusieron a
incubar a 37C con excepcin de la que se midi en
tiempo de incubacin igual cero. Durante un perodo de
crecimiento de 11 horas, aproximadamente cada 15
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minutos se sac un frasco de la incubadora, se midi la
turbidez de la muestra y con una micropioeta se tomaron
10 l de la misma para realizar la evaluacin
electroqumica.
Instrumentacin electroqumica
Los experimentos electroqumicos se realizaron segn
el esquema de medicin presentado en la Fig. 2. Se basa
en la instrumentacin virtual e incluye una computadora
personal, LabView como lenguaje de programacin, una
tarjeta de adquisicin de datos National Instruments NI-
DAQ 6014 de 16 bits con un mdulo de expansin CB-
68LP y un potenciostato. El sistema est diseado para
medir corriente con resolucin menor de 10 nA y generar
una tensin de entre 10 V con resolucin menor de
5 mV.
Fig. 2. Esquema del sistema de medicin.
La interfaz grfica del instrumento virtual consta de un
panel de configuracin donde el operador pueda
configurar los parmetros de cada experimento (tcnica
de electroqumica, caractersticas de la seal para excitar a la
celda electroqumica, direccin de almacenamiento de los
datos en el disco duro, protocolo del experimento, etc.).
Presenta tambin un panel de medicin donde se
representan grficamente en tiempo real las seales
generadas y los resultados de las mediciones.
La adquisicin de seales se efecta a travs la tarjeta
de adquisicin de datos NI 6014 - National Instrument [6].
Se emplean entradas y salidas analgicas de este
dispositivo para interactuar con un potenciostato, circuito
electrnico mediante el cual se le aplica la polarizacin a
la celda electroqumica y se sensa la corriente circulante
por la misma.
El elemento sensor del sistema de medicin lo
constituye una microcelda electroqumica fabricada en
tecnologa de pelculas delgadas. La microcelda est
constituida de dos electrodos de platino en configuracin
disco-anillo [4, 5]. El denominado electrodo de trabajo
tiene la forma de un disco de 1 mm de dimetro y el anillo
de aproximadamente 2 mm2 de rea se utiliz como
pseudorreferencia [4, 5]. La muestra que se va a analizar
constituye el electrolito de la celda y se deposita en forma
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de gota sobre los electrodos con el empleo de una
micropipeta.
Los anlisis se efectuaron mediante la tcnica de
voltametra de barrido lineal de 0 a 1 V a 20 mV/s.
3. RESULTADOS Y DISCUSIN
Para cada muestra medida se obtuvo la caracterstica
corriente-diferencia de potencial aplicado. Como se
esperaba segn los reportes anteriores [4-6], en los
experimentos se observaron dos tipos de comportamientos
bien diferenciados (Fig. 3): voltamogramas sin pico de
corriente (A) y voltamogramas con pico (B). En la misma
figura se indican los parmetros corriente pico (Ip) y
ancho del voltamograma (W) que se utilizarn en el
anlisis de los resultados.
2.5
2.0
Ip/2
1.5
W
I [A]
1.0
0.5 Ip/2
0.0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
V [V]
Fig. 3. Clasificacin de los voltamogramas obtenidos:
Voltamograma sin pico. B) Voltamograma con pico de corriente.
En la Fig. 4 se presentan con respecto al tiempo de
incubacin, los valores de turbidez medidos con el sistema
DIRAMIC, as como los parmetros Ip y W extrados de
cada voltamograma. En cada curva se han indicado cuatro
zonas (I, II, III y IV) para analizar cmo se detectaron las
etapas de crecimiento del microorganismo con cada
sistema de medicin. De un total de 40 mediciones se
obtuvieron siete voltamogramas sin pico de corriente con
cada una de las muestras medidas en las primeras dos
horas (zona I en la Fig. 4). A partir de la octava muestra,
incubada durante 122 minutos y con turbidez de
1,03 McFarland, se manifest el pico de corriente en todos
los voltamogramas realizados. Este resultado confirma los
reportes anteriores [4, 5] en cuanto a la clara
diferenciacin de las fases de latencia y la de crecimiento
exponencial.
En las tres primeras muestras correspondientes a la
fase de crecimiento exponencial (zona II de la Fig. 4b), la
intensidad de corriente pico aument con el incremento
del tiempo de incubacin. Para tiempos de incubacin
mayores de tres horas, la dispersin en los valores de
intensidad de corriente de los picos fue grande (valor
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6.0
III
[McFarland]
3.0 II IV
I
(a)
0.0
3.0
I p [A]
1.5 II III IV
I
(b)
0.0
0.8
II
W [V]
0.4 III
IV
I
(c)
0.0
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo de incubacin [h]
Fig. 4. Crecimiento de Escherichia coli durante 11 horas de
incubacin. (a) Turbidez de cada muestra antes de la medicin
voltamtrica. (b) Intensidad de la corriente pico en voltamogramas
A realizados a 20 mV/s con cada muestra. (c) Ancho del voltamograma
B determinado segn la Fig. 3. En cada curva la lnea continua gris
corresponde a un filtrado de las fluctuaciones mediante transformada
rpida de Fourier.
medio de 1,55 A con desviacin estndar de 0,53 A en
la zona III)y en comparacin con la curva de crecimiento
descrita por los valores de turbidez (Fig. 4a), la
separacin entre las fases de crecimiento exponencial y
estacionaria qued menos definida. En la parte
identificada como IV en la Fig. 4a, aument la
dispersin en los valores de turbidez. Este fenmeno
1.0
pudiera estar relacionado con el comienzo de la fase de
muerte en algunas de las muestras. En esta misma zona,
aunque se mantuvo la dispersin de los valores de
A) intensidad de corriente de los picos, el valor medio
disminuy a 1,09 A con una desviacin estndar de
0,51 A. Los datos representados en las curvas de la
figura 4 se filtraron mediante la transformada rpida de
Fourier. Con las curvas filtradas, se obtuvo entre la
turbidez y la corriente pico una correlacin de 83,2% al
considerar todas las zonas y de 92,7% al excluir la zona
IV. Como se observa en la Fig. 4c, el ancho de los
voltamogramas (W) se modific con el avance del
tiempo de incubacin. Se puede ver como a partir de la
zona II aumenta el ancho del voltamograma. Se alcanza
en la zona III un valor medio de 0,61 V con una
desviacin estndar de 0,48 V. En la zona IV el valor
medio disminuy a 0,485 V con una desviacin estndar
de 0,046 V. El incremento del ancho de los
voltamogramas se manifest en mayor medida en el
final de las zonas II y principio de la III. Este
comportamiento probablemente estuvo ocasionado por
el aumento de la variedad de especies electroactivas que
podan oxidarse, lo que daba lugar a un solapamiento de
picos individuales que se manifiesta como un pico ms
ancho. En este caso, la correlacin con la turbidez fue
de 83,6% para todo el intervalo y de 91,08% al excluir
la zona IV. Los resultados anteriores muestran una
correspondencia general entre la evolucin de los
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Habana 2007

voltamogramas y las fases de crecimiento [6] S. Pavoni, H. Cobas, A. Zayas, Influence of potential scan
rate on voltammetric detection of Escherichia coli, 14
microbiolgico. Congreso Cientfico Internacional CNIC, Habana 2005.
[7] M. Madigan, J. M. Martinko, J. Parker. Biologa de los
Microorganismos. 8va Ed., Prentice Hall, 2001.
[8] R. Contreras, G. Roura, F. Travieso, A. Zayas, C. Romay,
4. CONCLUSIONES Juego para el diagnstico microbiolgico. Oficina Cubana de
la Propiedad Industrial, Certificado de Autor de Invencin CU
22708 A1, Cuba, 14 pginas, 1997.
Se efectu el seguimiento del ciclo de vida de la [9] R. Contreras, G. Roura, F. Novo, S. Hernndez, N. Ramrez, I.
bacteria Escherichia coli durante un perodo de 11 Ramrez, Equipo y mtodo para el diagnstico rpido
horas. Se tomaron un total de 40 muestras espaciadas microbiolgico. Oficina Cubana de la Propiedad Industrial,
cada 15 minutos que fueron analizadas Certificado de Autor de Invencin CU 22549 A1, Cuba, 32
pginas, 1999.
electroqumicamente utilizando la tcnica de [10] H. Cobas, E. Valds, E., S. Pavoni, Sistema basado en la
voltametra de barrido lineal. instrumentacin virtual para mediciones voltamtricas. Proc.
Se diferenciaron claramente la fase de latencia, XI Workshop International Iberchip, Salvador de Baha, pp.
donde los voltamogramas no manifestaron picos, del 358-359, 2005.
resto de las fases de crecimiento de la bacteria, donde si
mostraron picos.
Los datos de las curvas de turbidez, corriente pico y
ancho del voltamograma, una vez filtrados, arrojaron
una correlacin de 83,2 % cuando se analizaron las
cuatro zonas y 92,7 % al excluir la ltima para el caso
de las curvas (a) y (b) de la Fig. 4; para el caso de las
curvas (a) y (b) de la misma figura se obtuvo una
correlacin de 83,6 % al analizar todas las zonas y
91,08 % al excluir la cuarta.
Con los resultados obtenidos se ha puesto en
evidencia la potencialidad de la tcnica de voltametra
de barrido lineal en el estudio de las fases de
crecimiento microbiolgico dada la correspondencia
general entre la evolucin de los voltamogramas y las
fases de crecimiento microbiolgico.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Instituto para la Qumica y

Biosensores (ICB) de Mnster, Alemania por la
fabricacin del dispositivo sensor.

REFERENCIAS

[1] T. Matsunaga, T. Nakajima, Electrochemical Classification of

Gram-Negative and Gram-Positive Bacteria, Applied and
Environmental Microbiology, vol. 50, no 2, pp. 238-242, 1985.
[2] N. Nakamura, A. Shigematsu,A, T. Matsunaga,
Electrochemical detection of viable bacteria in urine and
antibiotic selection, Biosensors and Bioelectronics, vol. 6, no.
7, pp. 575-580, 1991.
[3] S. Subrahmanyam, N. Kodandapani, K. Shamugan, K.
Moovarkumuthalvan, D. Jeyakumar, T. V. Subramanian,
Cyclic Voltammetric Measurements of Growth of Aspergillus
terreus, Analytical Sciences, vol. 17, no. 3, pp. 481-484, 2001.
[4] S. Pavoni, H. Cobas, Electrochemical Detection of Growth of
Escherichia coli with sensors based on platinum electrodes. V
Congreso Iberoamericano de Sensores Ibersensor, Montevideo,
2006. ISBN: 9974-0-0337-7.
[5] S. Pavoni, H. Cobas, A. Zayas, E. lvarez, R. Contreras, F.
Rodrguez Evaluacin de un sensor de capas delgadas para la
deteccin voltamtrica del crecimiento de Escherichia coli,
Universidad, Ciencia y Tecnologa, vol. 10, no. 40, pp. 211-
215, Sept. 2006.

ISBN 978-959-212-236-9 (c) Sociedad Cubana de Bioingeniera, artculo T061

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