Reaccin en cadena de la polimerasa

La reaccin en cadena de la polimerasa es una reaccin enzimtica in vitro que amplica millones
de veces una secuencia especca de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia
blanco es copiada elmente. Para ello, la reaccin aprovecha la actividad de la enzima ADN
polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las clulas. En la reaccin,
si usamos como sustrato ADN genmico, entonces tpicamente hablamos de una PCR, pero si
usamos ADN complementario (ADNc) proveniente del ARNm (cido ribonucleico mensajero) se le
conoce como RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, por sus siglas en ingls). Esta conversin se logra
mediante una reaccin conocida como transcripcin reversa y controlada por la enzima
transcriptasa reversa, capaz de convertir el ARNm en una molcula de ADNc. Este mtodo fue
copiado de los retro virus que usan una transcriptasa reversa para convertir su genoma de ARN en
ADN duplicarse en millones de partculas virales. El ADNc se utiliza cuando analizamos la expresin
del ARNm de algn gen de inters.

Cada ciclo de la PCR se lleva a cabo en tres etapas principales: desnaturalizacin, hibridacin y
extensin.

1. Desnaturalizacin. En esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y separadas a una
temperatura de 95 C durante 20-30 segundos; el tiempo depende de la secuencia del
templado, es decir, si la cantidad de G-C es alta, ser necesario ms tiempo para romper
sus uniones debido a que el apareamiento de estas bases est formado por tres enlaces,
uno ms que las bases de A-T. Adems, depende de la velocidad en la que el termociclador
aumenta la temperatura, esto vara de acuerdo al modelo del equipo. Al nal de esta etapa
tendremos las cadenas separadas que servirn como templado para el siguiente paso.
2. Hibridacin. En esta etapa, los primers se alinean al extremo 3 del templado previamente
separado e hibridan con su secuencia complementaria. Para que se forme el complejo
templado-primers, es importante que la temperatura de hibridacin o temperatura
melting (Tm) sea la ptima; sta generalmente oscila entre 50-60 C. Si el diseo de los
primers es el correcto y la temperatura es la adecuada, la estabilidad y especicidad del
complejo ser eciente.
3. Extensin. En esta etapa, la Taq polimerasa acta sobre el complejo templado-primers y
empieza su funcin cataltica a una velocidad muy rpida; agrega dNTPs complementarios
para crear las cadenas completas de ADN. La extensin de las cadenas es en direccin de la
sntesis del ADN, es decir, de 5 a 3. La temperatura ptima para la reaccin es de 72 C, ya
que a esa temperatura la enzima es funcional. Al nal del ciclo, se habrn formado los
amplicones con un tamao dictado por el nmero total de pares de bases (pb) que deber
ser conocido por el investigador.

Al nal de la PCR, para saber si la reaccin transcurri ecientemente, los amplicones son
visualizados a travs de una electroforesis en geles de agarosa. La electroforesis consiste en la
separacin de grandes molculas como los cidos nucleicos a travs de una matriz slida que
funciona como un ltro para separar las molculas en un campo elctrico de acuerdo a su tamao
y carga elctrica. Esta separacin se hace bajo un buffer o tampn que puede ser TAE o TBE. En el
caso de los cidos nucleicos, el grupo fosfato les proporciona la carga negativa, por lo que durante
la electroforesis migran hacia el polo positivo. Para ello, se prepara un gel diluyendo una cantidad
de agarosa en el buffer, se calienta hasta que la agarosa hierva lo suciente y posteriormente se
vaca a un recipiente que sirve de base para que solidique. Generalmente el porcentaje al que se
prepara el gel es al 1.2% aunque, dependiendo del tamao de las molculas, puede ser de hasta el
2%. Otro ingrediente que se agrega al gel es un compuesto conocido como bromuro de etidio, una
molcula intercalante capaz de unirse al ADN de doble cadena. Cuando es excitado con luz UV
emite una seal que permite la visualizacin de los amplicones en forma de bandas. Es importante
manipular con mucho cuidado este compuesto porque se sabe que es mutagnico y teratgeno.
Cuando los amplicones son corridos en el gel, stos deben ser cargados junto con un marcador
molecular que contenga un nmero determinado de segmentos de ADN conocidos, lo que facilita
la identicacin de los amplicones y si su tamao corresponde con el esperado. El tamao est
dado por el nmero de pares de pases del amplicn. Finalmente, la visualizacin de los amplicones
se lleva a cabo tomando una foto digital al gel de agarosa expuesto a luz UV.