Aplicacin de la transformada de Fourier-segunda-generacin armnica

formacin de imgenes en el cuello uterino de la rata

Presentamos la aplicacin de la transformada de Fourier-secondharmonic
la generacin (FT-SHG) de formacin de imgenes para evaluar la disposicin
de fibras de colgeno en cinco cuellos uterinos de rata no embarazadas.
Rodajas de tejido de la mitad del cuello del tero y cerca de la externa
orificio del cuello del tero se analizaron tanto en dos dimensiones-
(2D) y tres dimensiones (3D). Validamos que el cuello uterino
microestructura se puede evaluar cuantitativamente en tres de
dimensiones utilizando imgenes FT-SHG y observar colgeno
fibras orientadas tanto dentro como fuera del plano en el exterior y
las capas ms internas, que no pueden ser observados usando 2D
Anlisis FT-SHG solo. Este enfoque tiene el potencial de
ser un mtodo clnicamente aplicable para la medicin progresiva
cambios en la organizacin de colgeno durante la remodelacin cervical
en humanos. Quince millones de nios en todo el mundo nacen antes de tiempo, o antes
37 semanas completas de gestacin, cada ao (marzo de
Dimes et al., 2012). En los Estados Unidos, el nacimiento prematuro es
la segunda causa de mortalidad infantil y el lder
causa de mortalidad infantil para los afroamericanos (marzo de
Dimes, 2009). Mientras que se ha avanzado en los ltimos
dcadas incaring para los bebs prematuros, ha habido muy poco
cambiar en la incidencia de parto prematuro en los ltimos 40 aos
(Martin et al., 2009) .Mainstream intervenciones clnicas como objetivo
a detener el tero se contraiga durante el trabajo de parto prematuro
son ineficaces para reducir la incidencia de parto prematuro (Mc-
Farlin, 2005). Para ello, una mejor comprensin de las propiedades del cuello uterino podra
facilitar el desarrollo de nuevos
intervenciones clnicas para reducir el riesgo de parto prematuro.
El cuello uterino tiene varias funciones durante el embarazo. Temprano
en el embarazo es firme para mantener el embarazo. Por ltimo,
el cuello del tero se ablanda para permitir que el feto pase a travs
el canal del parto (House & Socrate, 2006; Myers et al., 2008;
Timmons et al., 2010). Este cambio dramtico en la rigidez debe
a los cambios microestructurales y composicionales significativos de
el cuello del tero, que se producen durante una fase de remodelacin cervical
que comienza varios meses antes de las contracciones del tero
(House & Socrate, 2006;. Timmons et al, 2010). Durante Esto
perodo, el cuello del tero se transforma de un tejido fibroso denso con
una red organizada de fibras de colgeno a un distensible suave
tejido a travs de un proceso de desorganizacin colgeno y
disminucin de la concentracin de colgeno (Casa et al, 2009;. Myers
et al., 2009; Lee et al., 2007). Con el fin de observar los cambios
en la morfologa de colgeno durante la remodelacin de cuello uterino, de formacin de
imgenes
tcnicas, tales como difraccin de rayos X (Aspden, 1988), polarizado
microscopa de luz (Yu et al., 1995), la microscopa electrnica
(Yu et al., 1995) y segundo armnico de la generacin (SHG)
microscopa (Akins et al, 2010;. Myers et al, 2008;. Zhang
et al., 2012) se utilizaron en los estudios anteriores. Sin embargo, de rayos X
difraccin y microscopa electrnica exponer los tejidos a ionizante
la radiacin, mientras que la microscopa de luz polarizada y este ltimo
a menudo requieren tincin exgena para el contraste, no whichmay
preservar la microestructura original de los tejidos. Hasta la fecha, una
metodologa que tiene el potencial para cuantificar los cambios en
la organizacin de las fibras de colgeno durante la remodelacin cervical
no ha sido reportado. Proponemos la aplicacin potencial
de transformada de Fourier-segunda-generacin armnica (FT-SHG)
proyeccin de imagen, que combina de forma nica imagen SHG con espacial
Anlisis de Fourier, para detectar cuantitativamente microestructural
cambios durante la remodelacin cervical IN3D con alta especificidad
a las fibras de colgeno en concebiblemente de una manera mnimamente invasiva.

SHG es un proceso no lineal ptico en el que dos fotones de entrada

de la misma frecuencia simultneamente son aniquiladas
en un medio noncentrosymmetric sobre la cual un solo fotn
con dos veces la frecuencia se emite en la salida. Tipo I
colgeno, el colgeno fibrilar ms abundante en el ser humano
cuerpo, puede emitir una seal de SHG relativamente fuerte cuando se ilumina
por un campo ptico de alta intensidad. Por lo tanto, en una proyeccin de imagen
modalidad, imgenes de alto contraste de colgeno tipo I fibras
pueden obtenerse sin la necesidad de la tincin con exgeno
colorantes (. Campagnola y otros, 2002; Rao et al., 2009). En adicin,
la confocalidad intrnseca de la microscopa SHG, resultado de la
proceso no lineal, permite formacin de imgenes de muestras en tres dimensiones
(Campagnola y otros, 2002;.. Lau et al, 2012;. Nishino et al,
2009; Pena et al., 2007). En los ltimos aos, ha habido mucho
esfuerzo en el desarrollo de la microscopa cuantitativa SHG,
tales como FT-SHG, por lo que el proceso nico de SHG permite
informacin cuantitativa de una base de colgeno, tejido bajo
estudio para ser extrado fcilmente cuando se combina con armnica espacial
anlisis. Nuestros estudios previos han demostrado la
utilidad de esta tcnica en la cuantificacin de la organizacin de fibras de colgeno
a travs del uso de tales mtricas como la orientacin isotropa
y la frecuencia espacial basado tanto en 2D como en 3D imgenes SHG
(Ambekar et al, 2012;.. Lau et al, 2012). Estas mtricas
se ha demostrado para permitir la evaluacin de las diferencias en
disposicin espacial de las fibras de colgeno entre sano y
tejidos de los tendones lesionados (Sivaguru et al., 2010). FT-SHG tiene
Tambin ha aplicado para determinar diferencias en la fibra de colgeno
organizacin en los tejidos mamarios humanos en diferentes patolgica
etapas (por ejemplo, hiperplasia, displasia y maligno) (Ambekar
et al., 2012).

En este trabajo, aplicamos FT-SHG para evaluar cuantitativamente

la microestructura del cuello uterino. 'Materiales y mtodos'
seccin describe nuestra metodologa, incluyendo la preparacin de muestras,
adquisicin de imgenes y anlisis de imgenes. 'Resultados y
seccin de discusin ', se discute la aplicacin del FT-SHG a
tejido cervical de ratas no embarazadas. Llegamos a la conclusin de 'Conclusin'
seccin con un resumen y una breve discusin de
la importancia de esta metodologa para detectar microestructural
cambios durante la remodelacin cervical.
materiales y mtodos
preparacin de la muestra
Tejido cervical fue cosechada de cinco ratas embarazadas usando
un protocolo aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo
Comit de la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign.
Muestras recolectadas fueron incorporados en los PTU bloques y almacenados
en -80 hasta sectioning.And secciones de tejido 50-micras de espesor, perpendicular
a los canales de cuello uterino, se obtuvieron proximal a
el orificio externo del cuello del tero (os externo) y cerca de la
mediados de cuello uterino (medio camino entre el cervical interno y externo
OS), como se muestra en la Figura 1, para cada muestra encajada, usando un criostato Leica
CM3050 (Leica Microsystems Inc., Buffalo
Grove, IL, EE.UU.).
Adquisicin de imgen
Imgenes SHG detectadas-Epi de secciones cervicales fueron adquiridos
utilizando un Zeiss LSM 710 microscopio confocal (Carl Zeiss Microscopy,
Maple Grove, MN 55369, EE.UU.), junto con un femtosegundo
fuente de luz (Newport Corporation, Irvine, CA, EE.UU.)
centrada en la longitud de onda 780 nm. A fin de facilitar ms
emisin uniforme de seales de SHG de las fibras de colgeno en todas las orientaciones,
el haz incidente fue polarizada circularmente. Adems,
para minimizar el desajuste del ndice de refraccin entre el
la muestra y el medio de formacin de imgenes, una abertura numrica-1,2
(NA) lente objetivo de inmersin en agua (Carl Zeiss Microscopy,
Maple Grove, MN, EE.UU.) fue elegido tanto para la iluminacin de la muestra
y la recogida de la seal. La combinacin de un pase corto-
Filtro de 760 nm seguido por un / filtro de paso de banda 390 20-nm (Newport
Corporation, Irvine, CA, EE.UU.) se coloca entre el
objetivo y un detector GaAsP-NDD (Carl Zeiss Microscopy, Maple Grove, MN, EE.UU.) para extraer
la retrodispersin SHG
seal.

Tamaos laterales escaneo de paso que van desde 208 nm a 2,1 micras
fueron adaptados para la rata de imgenes tejidos del cuello uterino a diferentes escalas.
Para obtener imgenes de cortes transversales enteras de cuello del tero de la rata, imgenes
SHG
fueron adquiridas por raster explorar el haz incidente en un lateral
tamao de paso de 2,1 micras utilizando un galvoscanner. Un paso lateral
tamao de 208 nm se utiliz para obtener imgenes de mayor resolucin de
los caractersticos pilas de imgenes regions.And 3D seleccionadas de la
regiones caractersticas se lograron mediante la toma de muestras en un lateral
tamao de paso de 208 nm y un paso axial de 210 nm. Utilizando similares
tamaos de paso en ambas direcciones laterales y axiales pueden evitar interpolacin
entre imgenes consecutivas como interpolacin puede
introducir incertidumbres. Entre los cinco cuellos uterinos de rata utilizados en
este estudio, tres fueron utilizados para el anlisis 2D y dos se utilizaron
para el anlisis 3D. Una imagen completa de cada rebanada transversal era
tomado por todos los cuellos de tero de rata.
Anlisis de imagen
Para evaluar cuantitativamente la disposicin de las fibras de colgeno
en el tejido del cuello uterino, tanto de imgenes 2D y 3D FT-SHG se llev
mtodo de imagen awell establecida out.FT-SHGis que tiene
ha aplicado a diferentes estructuras biolgicas, incluyendo la crnea
(Ambekar y Toussaint, 2011), tendn (Sivaguru et al., 2010)
y el hueso (Ambekar et al., 2012), y una descripcin detallada de
la tcnica se puede encontrar en otro lugar (Lau et al, 2012;. Rao
et al., 2009). Brevemente, se realiz un anlisis de FT en un cuadriculada
Imagen (2D), as como los grupos de autoayuda (3D) pilas de imgenes; cada regin
delimitada por la red fue examinado individualmente. El tamao de la cuadrcula
wascarefully elige de tal manera que cada regin limitada era pequea
suficiente para describir la orientacin local de las fibras de colgeno mientras
evitando los errores comunes debido a la pixelacin. Cada regin que
muestra una orientacin dominante en el espectro de frecuencia se marc como un isotrpico y se
le asigna una orientacin preferida,
mientras que las regiones que carecen de orientaciones prominentes eran
etiquetados como isotrpico. Adems, las regiones con bajo o insignificante
Intensidad SHG no proporcion informacin representativa de
isotropa orientacin; estas regiones se etiquetan por consiguiente
regiones oscuras.
Para la evaluacin cuantitativa, un histograma circular resumiendo
orientaciones preferidas de regiones anisotrpicas y un histograma
regiones de marcadas se generan para cada analizado
imagen. La respectiva varianza circular de cada regin era
calculado como as con el fin de proporcionar medidas cuantitativas de
la isotropa orientacin del histograma circular. La varianza circular, una medida adimensional de
la propagacin de la orientacin
(Fisher, 1993; Jammalamadaka y Sengupta, 2001),
tiene un valor entre 0 y 1; cuanto menor es la varianza circular,
mayor ser la distribucin de la orientacin preferida.

Resultados y discusin
2D FT-SHG
Figura 2 (a) es una imagen representativa de una rodaja de tejido obtenido
desde mediados del cuello uterino. El anlisis FT muestra circunferencialmente
fibras de colgeno alineados que son aproximadamente simtrica con respecto tanto a la sagital y
coronal. planos los
bucle que contiene las fibras alineadas tiene su centro en la interseccin
de estos aviones. El anlisis tambin muestra que las reas
adyacente a las fibras altamente alineados y entre la cervical
canales son predominantemente isotrpico [Fig. 2 (b)]. De la misma
muestra, un trozo de tejido obtenido de cerca el orificio externo de la
cuello uterino muestra arreglo similar de fibras de colgeno [Fig. 2 (c)
y (d)]. Del mismo modo, las rebanadas de tejido de cuello uterino de la rata adicional de cuatro
las muestras se encuentran para ser similar en su disposicin espacial de
fibras de colgeno en ambos lugares longitudinal. Esta evaluacin inicial
del cuello del tero de rata indica simetras y consistencia
en la organizacin de la fibra en el plano transversal y en dos diferentes
profundidades en el rgano, respectivamente. Por lo tanto, proporciona una
base para nosotros para seleccionar regiones caractersticas para una ms detallada
evaluacin de organizacin de las fibras de colgeno.
Dadas las diferencias en la organizacin de fibras de colgeno en la
regin entre los canales de cuello uterino y en las regiones que contienen
las fibras orientadas circunferencialmente, tres caracterstico
regiones, tanto en el segmento de tejido mediados de cuello uterino y la rebanada orificio externo
se identificaron para formacin de imgenes y anlisis en un tamao de paso lateral
de 208 nm (nmero de animales, n = 3) [Fig. 3]. La circular
histogramas de orientacin preferida de las regiones anisotrpicas
se muestran junto a sus imgenes SHG correspondientes en la figura
3, y la varianza circular cantidad es una medida de la
extendido en la orientacin. Adems, el histograma de etiquetado
regiones incluye informacin sobre la contribucin de la
cada regin marcada en cada imagen SHG. En breve, las regiones oscuras
representan reas con cantidad insignificante de seal de los grupos de autoayuda, y
regiones isotrpicos y anisotrpicos regiones indican zonas donde
fibras estn orientadas al azar, oa lo largo de una orientacin preferida pronunciada,
respectivamente. Durante los seis rodajas de tejido analizadas,
la varianza circular media y su correspondiente rango
para la regin entre los canales de cuello uterino, y las dos regiones
que muestra las fibras predominantemente orientadas circunferencialmente cerca
el plano coronal y el plano sagital, son 0.187 (0.076-
0,295), 0,132 (0,044-0,213) y 0.0898 (0,043-,116),
respectivamente. En el mismo orden, la relacin de las regiones anisotrpicas
a las regiones son isotrpicas 1,40 (desviacin estndar =
1,27), 1,87 (desviacin estndar = 0,614) y 1,61 (estndar
desviacin = 0,297).

La regin entre los canales cervicales, proximal a la interseccin

de los planos sagital y coronal (regin 1), tiene una
mayor varianza circular relativa a las regiones que contienen el
circunferencialmente orientado fibras. Cuanto mayor sea la varianza circular
indica que la organizacin de las fibras de colgeno en esta regin
es ms istropo, es decir, las fibras de colgeno son menos alineados,
en comparacin con las regiones que contiene el circunferencialmente
fibras orientadas. De hecho, la imagen SHG de la regin central
muestra una red entrelazada de fibras de colgeno inmany diferente
orientaciones [Fig. 2 (a)]. En consonancia, el anlisis FT-SHG
muestra que las regiones isotrpicas y anisotrpicas son regiones
distribuidos al azar en toda la regin central [Fig. 3 (a)]. por
las regiones que contienen las fibras orientadas circunferencialmente,
resultados de los anlisis FT-SHG resaltar el grupo de circunferencialmente
fibras orientadas mencionados en la evaluacin inicial
[Higo. 3 (b) y (c)]. Para ambas imgenes, sus histogramas circulares
de orientacin de anisotrpico regiones muestran relativamente bajo circular
varianzas, que indican que las fibras de colgeno lo largo de la
bucle circunferencial estn altamente alineados. Similar a la Figura 2 (a),
zonas en los alrededores inmediatos de la altamente alineados
fibras son relativamente isotrpico para ambas regiones. Por observacin,
las regiones que son altamente anisotrpico siguen un circunferencial
lazo alrededor del cuello uterino cilndrica. Por lo tanto, las regiones 2
y 3 son aproximadamente equivalentes entre s.
Tal disposicin interesante de fibra divide el cuello del tero de la rata
en tres secciones distintas: una seccin con colgeno altamente alineados
fibras intercalado entre dos secciones isotrpicos [Fig.
4]. Adems, las secciones isotrpicos tambin apunta a un potencial
3D estructura fibrilar presente en el cuello del tero de la rata. Nuestro informe anterior
en el anlisis 3D FT-SHG indicaron que las regiones etiquetadas como isotrpico por el anlisis FT
2D pueden contener potencialmente
fuera de plano de fibras (Lau et al., 2012). Fuera de avin u oblicua,
fibras alineadas aparecen como grupos de puntos brillantes debido al hecho
que cada imagen 2D slo puede capturar una pequea parte de su
longitudes. En comparacin, el anlisis 3D FT-SHG evita tales
ambigedad teniendo en cuenta varias imgenes a lo largo
la profundidad de los cortes de tejido. Por lo tanto, el ya mencionado 3D
anlisis puede proporcionar amore evaluacin integral del
cuello del tero de la rata.

3D FT-SHG
Figura 5 muestra los resultados del anlisis 2D y 3D FT-SHG de
un trozo de tejido obtenido de la mitad de cuello uterino. El anlisis 2D
de la imagen de los grupos de autoayuda de toda la lmina de tejido muestra el mismo
patrn de organizacin de fibra de colgeno se ha descrito previamente
[Higo. 5 (b)]. Posteriormente, el anlisis se centra en el anlisis
las regiones caractersticas desde una perspectiva 3D. A pesar de
alta orientacin isotropa observada de la imagen 2D de la
regin entre los canales, hay un nmero significativo de colgeno
fibras orientadas de forma oblicua al plano de imagen de acuerdo
al 3D representa la imagen de la regin central, as como la
Anlisis 3D FT-SHG [Fig. 5 (c) y (d)]. Para la regin fuera
de los canales de cuello uterino, etiquetado como regin 2 en la Fig. 5 (a), una sustancial
nmero de fibras fuera del plano estn presentes en los lugares
donde el anlisis 2D se identifica como isotrpico [Fig. 5 (e) y
(F)]; Por lo tanto, estas ubicaciones son de hecho anisotrpica. Similar
disposicin de las fibras de colgeno tambin se encuentra en otra muestra
de cuello uterino de rata. Por lo tanto, el anlisis 3D nos proporciona
no slo informacin similar acerca de la orientacin preferida
en el plano de fibras como el anlisis 2D, pero es ms revelador con
respecto a la orientacin de las fibras en el isotrpica predominantemente
reas marcadas por el anlisis 2D. Como se muestra en la Figura 6, para
algunas de esas regiones isotrpicas, existen fibras fuera del plano
como se indica por el anlisis 3D.
El anlisis 3D est de acuerdo con los modelos anteriores
del cuello del tero de la rata. Se ha establecido que la rata anteriormente
cuello uterino se compone de tres capas concntricas alrededor de cada cervical
Canal: una capa de fibras alineadas circunferencialmente, paralela a la
plano transversal, intercalada entre dos capas compuestas de fibras predominantemente
longitudinales (Yu et al., 1995). Esta
anteriormente mencionada estructura da el cuello del tero de la rata de la forma y
requiere propiedades mecnicas para cumplir con su papel como parte del
el sistema reproductivo. El cuello del tero humano (tambin organiz
de manera similar, excepto que slo hay un canal cervical (Myers
et al., 2009). Es importante destacar que las caractersticas estructurales compartidas
entre la rata y el tema humant significar aplicacin potencial
de nuestra tcnica para evaluar tejido cervical humano.

Conclusin
Imgenes SHG nos permite obtener imgenes de alto contraste de colgeno
fibras en el tejido del cuello uterino de la rata sin la necesidad de exgena
tincin. Utilizando el anlisis de FT, estamos en condiciones de evaluar
Imgenes SHG de cuellos uterinos de ratas de ambos puntos de vista en 2D y 3D.
El anlisis FT-SHG del cuello del tero de rata muestra que el
organizacin de las fibras de colgeno vara en diferentes lugares
el plano transversal, pero permanece relativamente constante a lo largo de la direccin
longitudinal. Segn el anlisis FT 3D, hay
es un bucle pronunciado de fibras orientadas circunferencialmente en el
cuello uterino de rata, pero colgeno fibras en el entorno inmediato
de esta zona y en la regin entre los canales cervicales son
predominantemente alineado fuera de plano. La estructura observada
del cuello del tero de la rata es similar a la humana cervixmodel propuesto
por estudios anteriores. Sobre la base de la similitud entre humana
y cuellos uterinos de rata, 3D FT-SHG tiene el potencial para la utilidad clnica.
SHG Adems, el reciente desarrollo de una fibra ptica
escaneo endomicroscope por Zhang et al. (2012) es un prometedor
indicador de que FT-SHG se puede adaptar para evaluar prematura
remodelacin cervical en los seres humanos.