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PRODUO DE VACINAS

A FERMENTAO NA PRODUO DE VACINAS

A tecnologia de produo de vacinas realizada com mtodos de escala de

laboratrio desde o incio at hoje; devido vrios motivos:

A. apoio governamental desenvolvimento sem fins lucrativos; eficincia e

produtividade so secundrios. As operaes so realizadas em bancadas,
por profissionais como bilogos, qumicos e mdicos bacteriologistas no
pertencentes a rea de engenharia e portanto sem os conhecimentos
necessrios para a ampliao de escala do processo;
B. vacinas virais, preparadas com matrias-primas como: peles de bezerro e
ovos de galinha, tornam-se problemticas quando preparadas em larga
escala;
C. condies complexas de cultivo de bactrias patognicas e vrus,
conduziram ao falso conceito, de que cultivos em tanques seriam de difcil
realizao;
D. necessita-se de um profissional com viso integrada das vrias linhas e que
submeta a processos peridicos de reciclagem de conhecimento;
contribuindo para reduzir tais obstculos.

PRODUO DE VACINAS COMO PROCESSO UNITRIO

As operaes para produo de vacinas bacterianas e virais, compreendem:

a. temperaturas de cultivo: para bactrias ao redor de 37 0 C;

b. os volumes de meio de cultivo empregados na produo industrial de
vacinas (25 a 3500 litros)so pequenos, quando comparados com outros
processos industriais de cultivo;
c. a natureza complexa dos meios utilizados, o pH timo das fermentaes (~
7,5), a temperatura: favorvel a proliferao de m.os.. Exige-se assepsia na
conduo dos processos e proteo especial do operador contra infeces
acidentais;
d. efeitos colaterais, decorrentes da aplicao de vacinas, devem ser
minimizados, considerando que as vacinas pertencem ao grupo de
medicamentos preventivos;
e. a obteno imediata de valores de potencia da vacina praticamente
impossvel, pois se baseiam em efeitos demorados observados em animais
de laboratrio.

So importantes informaes sobre:

- pH do meio;
- oxignio dissolvido, porm no so considerados referenciais seguros pois nem
sempre se relacionam de maneira definida com a potncia da vacina.
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VACINAS BACTERIANAS CLASSIFICAO E PROCESSOS DE PRODUO

As vacinas bacterianas podem ser classificadas em particuladas e no

particuladas.
A tabela 1 apresenta a classificao segundo VAN HERMERT

PERTUSSIS

Microrganismo causador da coqueluche Bordetella pertussis bacilo gram-

negativo

Isolado e identificado por BORDET e GENGOU 1906 formulao do meio

semi-slido, contendo sangue de carneiro, empregado at hoje durante os
estgios iniciais de preparo do inoculo.

O processo de produo da vacina pertussis celular, compreende as etapas:

- preparao do inoculo;
- fermentao;
- filtrao e destoxificao

1. o preparo do inculo:

Inicialmente preparado pela ressuspenso do m.o. liofilizado em soro fisiolgico,

seguido de um espalhamento da suspenso resultante sobre o meio de BORDET.

Incubao: 350 C/ 96 h

Posteriormente cultivo da bactria em erlenmeyeres agitados, cada uma com o

meio de STAINER- SCHOLTE (sem sangue); 350 C/ 24h.

2. A fermentao

As dimenses dos erlenmeyeres dependero da capacidade do fermentador, a

relao entre volume de inoculo e o volume do meio, da ordem de 5%.

3. Filtrao e destoxificao

A etapa de filtrao tangencial, no processo de produo, visa separar as

bactrias do meio de cultura. Estas so ressuspensas em soro fisiolgico e
destoxificadas com formaldeido.
Por se tratar de uma bactria o pH de cultivo entre 7,5 e 8,5 , existe alta
probabilidade de contaminao.
feito o exame microscpico com a tcnica de GRAM (a Bordotella gram-
negativa), e tambm com dois tipos de meio: tioglicolato ou BREWER (detecta
contaminantes anaerbios) e casena de soja (indica presena de fungos).
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Amostras do fermentador e da vacina final, de ~0,5ml, colhidas aps cada etapa

de preparo do inoculo; so adicionadas aos meios, acondicionados em tubos de
ensaio. Se no apresentarem turvao, aps perodo determinado incubados a
350 C, significa ausncia de contaminantes. (testes de esterilidade)

A Bordetella pertussis no prolifera nestes meios.

Outras duas provas fundamentais para a liberao final da vacina so: toxidez e
de potncia em camundongos de linhagem estabelecida.

A utilizao de antiespumante no recomendada na produo de vacina

pertussis, pois acarreta aumento de toxidez do produto final.

Um recurso: evitar turbulncia do meio com a remoo das chicanas da parede da

dorna e a introduo de ar na superfcie.

Sistema :
- baixa eficincia de aerao;
- evita flotao de bactrias, dispensando o uso de antiespumante;
- apresenta homogeneidade para freqncias de agitaes maior ou igual a
300min -1 e volumes de meio superiores a 300litros.

O pH do meio tem um aumento constante, valores iniciais entre 7,0 e 7,5 at 8,0 a
8,6.

A VACINA ACELULAR

Devido a vacina desenvolvida apresentar efeitos colaterais como: dores e febre,

houve um estimulo a pesquisa de novas vacinas que minimizavam os efeitos
colaterais.
Muitos componentes celulares (polissacardeos, lipdeos, protenas) tem sido
identificados. Alguns deles foram considerados importantes por sua
antigenicidade. A estratgia para a obteno de uma vacina acelular, consiste no
isolamento daquele grupo de substncias antignicas das demais.
Sato, no Japo, 1981, obteve a primeira vacina acelular.

VACINAS CONTRA CLERA E FEBRE TIFIDE

A clera e a febre tifide possuem uma epidemiologia comparvel. Causam

doenas no trato gastro-intestinal, sendo as bactrias correspondentes gram
negativas. Reproduzem-se em meios simples, com mtodos de cultivo e
processamento semelhantes. Por isso, descritos juntos.

M. O. causador da clera Vibrio cholerae descoberto por Koch;

Origem da doena ndia e Paquisto.
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At o momento melhor imunidade obtida contra a clera a conferida por uma

vacina contendo cepas atenuadas (Inaba e Ogawa, empregadas em conjunto) de
Vibrio cholerae.

Febre tifide descrita por Budd 1856;pela primeira vez ;

1880 - por Eberth;
1884 Gaffky dicispulo de Koch responsvel pelo isolamento.

A Salmonella typhi penetra no organismo pela via digestiva, atingindo a corrente

sangunea, o que no ocorre com o Vibrio cholerae que permanece no trato
digestivo e portanto presente nas fezes.

A vacina contra febre tifide consiste em bactrias de Salmonella typhi (cepa Ty 2)

inativadas pelo calor a 53 0 C, durante 1h e preservadas em fenol a 0,5%.

Os cultivos submersos de Vibrio cholerae , bem como o da Salmonella typhi ,

podem ser realizados em fermentador, com um meio lquido simples, de
composio em (g/L):
- hidrolisado cido de casena (p);
- extrato de levedura em pasta;
- pH = 7,6.

A glicose adicionada parceladamente durante a fermentao. O hidrolisado de

cido de casena conhecido comercialmente como cido casamnico.

Se toda glicose necessria estiver presente no incio da fermentao, h uma

tendncia de que ambas as bactrias formem colnias rugosas durante um cultivo
posterior em meio semi-slido. Desse modo, elas no apresentaro
patogenicidade (denominadas de averulentas) , o que no interessante do
ponto de vista da produo de vacinas, por causa do baixo teor de certos
antgenos. Com a adio parcelada de glicose, durante a fermentao submersa,
as colnias apresentaro aspecto posterior liso, portadoras de virulncia.
O pH controlado na faixa de 7,3 a 7,6, com adio de soluo de hidrxido de
sdio.

VACINA B C G

Koch 1882 relacionou a tuberculose micobactria Mycobacterium

tuberculosis.

A infeco com o Mycobacterium tuberculosis, afeta os pulmes, os ossos e o

trato gnito urinrio.

Koch tentativa sem sucesso obter a vacina do Mycobacterium tuberculosis

inativado pelo calor, formaldedo e outros agentes qumicos.
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Calmette 1921 suspeitando que a imunidade poderia ser adquirida pela

presena de m os vivos no organismo do hospedeiro, desenvolveu uma cepa
atenuada de Mycobacterium bovis , causadora da tuberculose bovina.

A bactria se tornou avirulenta como conseqncia de 250 subcultivos, durante

vrios anos em meio que continha: batata, glicerina e bile bovina. Com essas
caractersticas, a cepa ficou conhecida pelo nome de Calmette Gurin (BCG).

MTODO DE CULTIVO

As micobactrias se desenvolvem na forma de uma pelcula na superfcie de

determinados meios lquidos sem agitao.
O mtodo industrial de produo de BCG se baseia nesse cultivo esttico,
aplicando nmero elevado de frascos.
Como exemplo, produo no Instituto Butant, so utilizados 6000 erlenmeyeres
por semana (cada um com capacidade total de meio litro e contendo 180ml de
meio de Sauton). Esta quantidade de material conduz a produo de 18000 doses
de BCG por semana.

Essa grande quantidade visa a compensao do crescimento lento da bactria (8

dias) para cobrir o meio e tambm a morte de 40 a 60% da populao bacteriana
devido a um processo posterior de disperso bacilar, esta desagregao
requisito para a BCG oral; porm com diminuio de qualidade.

Para solucionar o problema, a mais de 30 anos pesquisadores vem

desenvolvendo a tcnica de cultivo submerso deste m o. Como resultado, a vacina
BCG Glaxo produzida por esta tcnica.

Foram desenvolvidos alguns meios para o cultivo submerso, como o de Dubos,

Ungar e Proskauer Beck, fora o meio de Sauton, tradicionalmente empregado
para o cultivo esttico.

O mais tradicional, Sauton, apresenta a seguinte composio:

- L asparagina;
- citrato de ferro amoniacal;
- cido ctrico anidro;
- sulfato de magnsio;
- fosfato de potssio;
- glicerina;
- gua;
- pH 7,2 ( corrigido com soluo de hidrxido de amnio).

O cultivo submerso parece ser mais promissor frente ao cultivo esttico,

conduzindo a um produto final mais vivel. As bactrias cultivadas em
profundidade so mais resistentes a uma posterior liofilizao, do que os m os que
sofreram a disperso bacilar.
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Porm ainda temos problemas como: perda de viabilidade durante cultivos

prolongados, manter a assepsia durante o perodo (~8 dias), pois o pH do meio
permanece ao redor de 7,5, favorvel a proliferao de contaminantes e menor
imunogenicidade frente a BCG obtida pelo mtodo esttico.

Organizao Mundial de Sade - estabeleceu normas para controle e liberao

do produto final BCG.
Essas compreendem:
- medidas fsicas ( massa semi-seca e seca);
- testes de viabilidade (consumo de oxignio, unidades formadoras de colnia);
- mtodos estatsticos para a interpretao de erros associados aos resultados
experimentais.

TOXIDES

Sero descritas as vacinas, cujos preparos se baseiam em cultivos de bactrias

que excretam toxinas.

Estas, so posteriormente submetidas a uma destoxificao, que consiste na

destruio de suas propriedades txicas (atravs do formaldeido ou do calor, por
exemplo), sem alterar as propriedades imunognicas.

A molcula de toxina, assim modificada conhecida como toxide ou anatoxina.

Um mtodo rpido, para detectar a presena de toxina no meio, consiste em

coloc-la na presena de um soro que contenha os anticorpos contra esta toxina,
tambm conhecido como soro padro ou antitoxina.

Ao ocorrer a combinao entre esses anticorpos e as molculas da toxina,

apareceruma floculao visvel a olho nu. Esse mtodo foi institudo por Ramon e
permite exprimir a quantidade da toxina em termos de unidade de floculao
(Lf/ml). Por ser rpido, aplicado nos controles finais de qualidade e durante os
cultivos em fermentador, sem a necessidade de grande nmero de animais de
laboratrio.

Nas provas de liberao das vacinas, o mtodo in vitro, dever tambm estar
obrigatoriamente acompanhado do teste in vivo .

TOXIDE DIFTRICO

Bactria gram positiva Corynebacterium diphtheriae, a causadora da difteria

doena provoca infeco no trato respiratrio superior, bem como na parte
cutnea.
A toxina diftrica um polipeptdio, com PM ~ 62000. H dois fragmentos na
molcula, denominados A e B. O fragmento B necessrio para a penetrao na
clula que ser afetada.
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Aps penetrao, o fragmento A responsvel pela toxidez, interferindo

enzimaticamente com a sntese protica da clula afetada. Embora haja uma
variedade de antgenos para ambos os fragmentos, os anticorpos dirigidos contra
o fragmento B so aqueles que protegem contra a infeco.
A presena de protenas estranhas no toxide, causa reaes colaterais no
paciente, como a febre. Com isso, a vacina aplicada vrias vezes em doses
moderadas, com o objetivo de minimizar os efeitos indesejveis.

O MTODO DE CULTIVO

O meio de cultura empregado para o cultivo do Corynebacterium diphtheriae foi

desenvolvido por Linggood e Fenton; sua composio para um litro e meio, a
seguinte:

Carne bovina (~) 155g

Extrato de levedura em pasta 0,15g
Lactato de sdio 1,5ml
Maltose 50ml
Sulfato de magnsio 0,62g
alanina 1,75mg
cido nicotnico 1,75mg
cido pimlico 0,11mg
Sulfato de cobre 0,75mg
Sulfato de zinco 0,60mg
Cloreto de mangans 0,22mg
pH 7,8

A carne previamente digerida, por intermdio de uma soluo com a seguinte

composio:

Papana 1,5g
Soluo de hidrxido de sdio 8,0ml
cido clordrico 2,5ml
cido actico 6,0ml
Hidrocloreto de cistena 0,25g

A formao da toxina no est associada reproduo bacteriana: sua atividade

(medida em unidades floculantes: Lf/ml), se torna mensurvel ao redor de 18
horas de fermentao. Atinge seu valor mximo em 200 Lf/ml com 40 horas. O pH
diminui nesse mesmo perodo de 7,8 para 7,5.
Se a aerao for insuficiente, a queda ser mais pronunciada (de 7,8 para 6,5),
com produo mais baixa de toxina (100 Lf/ml).
O processo industrial de produo da toxina diftrica constitudo pelas etapas
de:
- fermentao;
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- filtrao tangencial do meio fermentado;

- filtrao molecular do filtrado;
- cromatografia;
- destoxificao;
- nova cromatografia;
- filtrao esterilizante da toxina purificada;
- mistura com o toxide tetnico (DT);
- ou este e a vacina contra coqueluche (DTP)

a filtrao tangencial do meio fermentado visa a separao das bactrias do meio,

onde se encontra a toxina.
A filtrao molecular, separa os nutrientes residuais e os metablitos da toxina.
Na cromatografia separao das molculas por tamanho e carga, permitindo a
obteno de uma toxina de alta pureza.
A destoxificao consiste em desnaturar a toxina pela ao do formaldeido a 37 0
C / 4 a 6 semanas, conduzindo ao toxide ou anatoxina diftrica.
Mais uma etapa de cromatografia purifica e concentra a anatoxina nos padres
estabelecidos.
Ela pode ser misturada com o toxide tetnico, constituindo na vacina combinada
DT ou em mistura com a vacina pertussis, para se constituir na vacina trplice
DTP.