I.

INTRODUCCIN

En el presente informe de microbiologa de alimentos se dar a conocer

sobre el recuento de microorganismos y los medios de cultivo los
cuales son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones
adecuadas y en condiciones fsicas ptimas, permiten el crecimiento de
los microorganismos.

En los laboratorios de microbiologa se utilizan diferentes tipos de

medios de cultivo que pueden ser preparados en forma lquida o en
forma slida. Usualmente para preparar un medio slido, se parte de un
medio lquido al que se le aade un agente solidificante como el agar, la
gelatina o la slicagel.

El recuento de microorganismos es un mtodo muy utilizado cuando se

necesita determinar el tamao de la poblacin bacteriana de una
muestra. El recuento de microorganismos, en este caso, se basa en que
cada uno desarrollar una colonia visible. Pero debido a que una
muestra no es totalmente homognea con respecto a su composicin
microbiolgica, es posible que una colonia se origine de un
microorganismo o de cientos de ellos, dando en este ltimo caso un
recuento menor del real.

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 II. OBJETIVOS

2.1. General
- Realizar la toma de muestra, preparar, diluir y sembrar
muestras para el anlisis microbiolgico del alimentos.

2.2. Especfico
- Identificar el uso de los medios de cultivo de acuerdo al
microorganismo a estudiar.
- Conocer las dos tcnicas de sembrado (puncin y por estras)
realizados en 2 cajas Petri y 2 tubos de ensayo.
- Determinar la cantidad de microorganismos presentes en la
muestra de refresco de cocona.

III. MARCO TEORICO.

3.1 Toma de muestras de alimentos

La toma de muestras de alimentos y bebidas en las fases de
preparacin, almacenamiento, transporte, comercializacin y expendio,
permite determinar si estos al ser muestreados y analizados cumplen o
no con la reglamentacin sanitaria vigente, y son un recurso para la
evaluacin del riesgo inherente al alimento. A su vez constituye un
insumo invaluable para la determinacin del agente etiolgico de una
enfermedad transmitida por un alimento y establecer el eslabn de la
cadena alimenticia donde se origin la contaminacin; Razn por la cual
el proceso de toma de muestra desarrollado por los funcionarios de las
ETS, el anlisis y reporte final de resultados por parte de laboratorios
son un componente esencial del sistema de Inspeccin, Vigilancia y
Control de los alimentos.
La toma de muestra constituye un procedimiento que forma parte de la
vigilancia sanitaria de los alimentos mediante el anlisis de rotulado,
fisicoqumico y microbiolgico.
La toma de muestra incluye la planificacin de lo necesario para efectuar
el proceso, lo que incluye disponibilidad de la documentacin,
identificacin de las muestras, reactivos y dems insumos necesarios

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para el muestreo. Tambin debe cubrir el tipo de producto que se va a
analizar, pues la calidad de un anlisis depende de la calidad del
muestreo realizado.
La toma de muestras para anlisis debe ser practicada por el funcionario
que representa la autoridad sanitaria, el cual debe ser competente y
estar autorizado para hacerla efectiva durante la preparacin,
almacenamiento, transporte, comercializacin, expendio de alimentos y
bebidas, para efectos de la actividad de Inspeccin, Vigilancia y Control
sanitario de acuerdo con la reglamentacin sanitaria vigente, la cual
establece que las Entidades Territoriales de Salud, tomarn muestras de
acuerdo a su competencia.
A su vez la toma de muestras se basa en el peligro que puede ofrecer el
alimento a la poblacin susceptible de consumirlo, por la posibilidad de
la presencia de microorganismos con capacidad de alterar el alimento,
de patgenos o cualquier otro inconveniente fsico o qumico que se
determine como posible fuente de riesgo para la salud de las personas.

3.2 Definicin de medio de cultivo

Un medio de cultivo es un sustrato o una solucin de nutrientes que

permite el desarrollo de microorganismos. En las condiciones de
laboratorio para realizar un cultivo, se debe sembrar sobre el medio de
cultivo elegido las muestras en las que los microorganismos van a crecer
y multiplicarse para dar colonias. Los microorganismos son los seres
ms abundantes de la tierra, pueden vivir en condiciones extremas de
pH, temperatura y tensin de oxgeno, colonizando una amplia
diversidad de nichos ecolgicos. Entre los requerimientos ms
importantes para su desarrollo estn el carbono, el oxgeno, nitrgeno,
dixido de carbono e hidrgeno. Muchas bacterias sin embargo
necesitan del aporte extra de factores de crecimiento especficos en
forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros.

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3.2.1 Recuento microbiano
Se determina el nmero de microorganismos en una muestra en
relacin a las colonias que forman, las UFC (Unidades Formadoras de
Colonias). Se emplean soluciones diluidas o diluciones de una
muestra concentrada para que cada colonia formada provenga de un
solo microorganismo aunque algunas agrupaciones no pueden ser
separadas por las diluciones. Se utilizan principalmente para la
cuantificacin de bacterias, levaduras y hongos filamentosos. Se
reporta como:
UFC ****/unidad de volumen o peso.

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de

microorganismos es observar su crecimiento en sustancias
alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material
alimenticio en el que crecen los microorganismos es el medio de
cultivo y el crecimiento de los microorganismos. Para que las
bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial
debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura,
grado de humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un
grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe
contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y
debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos

materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero,
sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan
por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo
del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los
microorganismos que ayuden a identificarlos. Tambin se aaden
colorantes que actan como indicadores para detectar, por
ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento
de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como
indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La
Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el
crecimiento de la mayora de las bacterias Gram-positivas).

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3.3 Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

3.3.1. Disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha

de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales
inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y
otra sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar
presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o
captadores de electrones para las reacciones qumicas que tengan
lugar.

3.3.2 Consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia

aadiendo productos como albmina, gelatina o agar, con lo que
obtendramos medios en estado semislido o slido. Los medios
solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos
microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas
inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen
la capacidad de licuarla. Actualmente los medios slidos son de uso
universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran
cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en
el laboratorio.

3.3.3 Presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con

tensin de oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno
directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos
anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una
atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los
microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones
atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy
reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo
capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

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3.3.4. Condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la

atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas
vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el
mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo
a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que
mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y
evitar as que se deseque el medio.

3.3.5 Luz ambiental

La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la

oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes
como sera el caso de los microorganismos fotosintticos.

3.3.6 pH

La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el

crecimiento de los microorganismos. La mayora de ellos se
desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que
requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la
presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el
crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar
sus procesos metablicos normales.

3.3.7. Temperatura

Los microorganismos mes filos crecen de forma ptima a

temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C
y los termfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores
(hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen
en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los
saprofitos tienen rangos ms amplios.

3.3.8 Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para

evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar
o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los
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 especmenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico para
esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de
agua a presin como agente esterilizante)

3.4 Clasificacin de los medios de cultivo

Segn su origen:

3.4.1 Naturales
Son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal
o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya
composicin qumica no se conoce exactamente.
3.4.2 Sintticos
Son los medios que contienen una composicin qumica definida
cualitativa y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados
reproducibles.
3.4.3 Semisintticos
Son los sintticos a los que se les aaden factores de crecimiento
bajo una forma de un extracto orgnico complejo, como por ejemplo
extracto de levadura.
3.4.4 Lquidos
Se denominan caldos y contienen los nutrientes en solucin acuosa.
3.4.5 Slidos
Se preparan aadiendo un agar a un medio lquido (caldo) a razn de
15g/litro. El agar es una sustancia inerte polisacrido (hidrato de
carbono) que se extrae de las algas. Como esta sustancia no es
digerida por las bacterias no constituye ningn elemento nutritivo.
Este conjunto convenientemente esterilizado puede ser vertido en
placas de Petri o en tubos de ensayo y presentan la posibilidad de
aislar y diferenciar bacterias, "procesos que antes no eran posibles en
medio lquido".
3.4.6 Semislidos:
Contienen 7,5 g de agar /litro de caldo. Se utilizan para determinar la
motilidad de las especies en estudio. Actualmente se encuentran
disponibles comercialmente con el agregado de agar. microbiano, a

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 veces es necesario agregar o eliminar componentes qumicos del
medio.
3.4.7 Comunes o universales:
Su finalidad es el crecimiento de la mayor parte de los
microorganismos poco existentes. Es el medio ms frecuentemente
utilizado para mantener colonias microbianas. Por ejempl: agar
comn o caldo comn.
3.4.8 Enriquecidos
Estn compuestos de un medio base como apoyo del crecimiento al
cual se le puede agregar un gran exceso de nutrientes como
suplementos nutritivos, por ejemplo: sangre, suero, lquido asctico,
etc. Se utiliza para microorganismos que tienen grandes exigencias
nutricionales.
3.4.9 Selectivos
Son slidos en los que la selectividad se consigue alterando las
condiciones fsicas del medio o aadiendo o suprimiendo
componentes qumicos especficos con el fin de inhibir el crecimiento
de especies qumicas cuyo crecimiento no interesa. Este tipo de
medio slo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos e
inhibiendo el de otros. Se utiliza para seleccionar y aislar
microorganismos a partir de poblaciones mixtas. Por ejemplo Agar
salado-manitol o Chapman (permite el crecimiento de ciertos
estafilococos).

3.5 Recuento microbiano en el crecimiento de microorganismos

El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser entendido desde

diferentes perspectivas y de acuerdo a stas se puede llegar a
determinar la medida del crecimiento mediante diversas metodologas.

Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que

tienen las clulas individuales, esto es iniciar y completar una divisin
celular. De esta forma, se considera a los microorganismos como
partculas discretas y el crecimiento es entendido como un aumento en
el nmero total de partculas bacterianas. Existen dos formas para
determinar el nmero total de microorganismos en una muestra:

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 Recuento microscpico de partculas
Recuento electrnico de partculas

Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos

capaces de formar colonias debido a que slo se tiene en cuenta el
nmero de microorganismos viables, esto es capaces de crecer
indefinidamente. Las determinaciones que se utilizan son:

Recuento de colonias
Mtodo del nmero ms probable

Para los fisilogos bacterianos, bioqumicos y bilogos moleculares una

medida del crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos, la
sntesis macromolecular y un incremento en la capacidad para la sntesis
de los componentes celulares es una medida del crecimiento. Para este
grupo la divisin celular es un proceso esencial pero menor que rara vez
limita el crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es la capacidad
del sistema enzimtico para utilizar los recursos del medio y formar
biomasa.

Determinacin de peso hmedo

Determinacin de peso seco
Determinacin de nitrgeno total
Determinacin qumica de un cido nucleico

Un ltimo grupo entiende al crecimiento sobre la base de la influencia

que ejercen los microorganismos en los cambios qumicos de su entorno
como consecuencia del incremento de la biomasa.

3.5.1 Recuentos Directos

Recuento microscpico: Es una tcnica comn, rpida y barata que

utiliza un equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de
microbiologa. Para estos recuentos se utilizan generalmente cmaras
de recuentos, aunque tambin pueden realizarse a partir de muestras
filtradas en membranas y transparentadas o teidas con colorantes
fluorescentes (Naranja de acridina).

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La mayor dificultad del recuento en cmara es obtener
reproducibilidad en el llenado de la cmara con lquido. Otra dificultad
es la adsorcin de las clulas en las superficies del vidrio, incluyendo
pipetas. Esta adsorcin es crtica en el proceso de dilucin de la
muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de alta
fuerza inica (solucin fisiolgica o medios mnimos sin fuente de
carbono).

Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-

Hausser. La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con
objetivos de inmersin, aunque la mayora de los recuentos se
realizan con objetivos secos. Una de las mayores ventajas del
recuento microscpico es brindar informacin adicional sobre el
tamao y la morfologa de los objetos contados.

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IV. MATERIALES Y METODOS.

4.1. Materiales.
- Asas de siembra
- Agua destilada
- Piseta
- Algodn
- Placa Petri
- Tubos de ensayo
- Pipeta
- Detergente
- Escobillas
- Mechero de alcohol
- Gradilla
- Vaso precipitado

4.2. Sustancias
- Agar nutritivo
- Muestra (refresco de cocona)

4.3. Metodologa.
El siguiente trabajo prctico se realiz en el laboratorio de
fitopatologa de la Universidad Nacional de Ucayali a las 11a.m el
da 06/06/17 el cual se realiz con las explicaciones de la Ing.
Cristina Quiones y con la colaboracin de su ex alumno Cristian
Ramos.
La prctica consisti en la determinacin de microorganismos en
una muestra lquida la cual fue refresco de cocona; realizamos las
diluciones 10-1 10 -2 y 10 -3 de la muestra madre.

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V. PROCEDIMIENTO.

Desinfectamos el rea de trabajo.

Tuvimos preparado el agar nutritivos en dos cajas Petri y dos tubos
de ensayo.
En un vaso de precipitado se coloca la muestra de refresco de
cocona.
Colocar 9 ml de agua destilada en tres tubos de ensayo.
En el primer tubo de ensayo colocar con una pipeta 1 ml de muestra,
el cual ser la muestra de 10-1
En el segundo tubo de ensayo colocar con una pipeta 1 ml de
muestra del tubo 1, el cual ser la muestra de 10-2
En el tercer tubo de ensayo colocar con una pipeta 1 ml de muestra
del tubo 2, el cual ser la muestra de 10-3

Siembra en placa Petri y tubo de ensayo.

Coger el asa de siembra por el cabo, en forma similar, a cuando

tomamos el lpiz para escribir.
Introducimos el asa de alambre de platino o nicrn directamente en la
llama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo e introducimos
lentamente el resto del alambre para lograr el mismo efecto,
retiramos el asa de siembra de la llama y esperamos de 4 a 5
segundos con el objetivo de que el asa se enfre.
Con el asa estril y fra tomamos una cierta cantidad de la muestra y
procedemos a sembrar en el agar de las dos placas Petri y en los
dos tubos de ensayo.
Despus anotamos con un plumn a las dos placas Petri y dos tubos
de ensayo segn las diluciones correspondientes y el nmero de
grupo.
Luego hicimos el recuento microbiano, con el contador de colonia a
las 24 horas y 48 horas.

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Los resultados obtenidos fueron:

Placa Petri # de colonias 24 h # de colonias 48 h

Agar nutritivo
10-2 2 3
10-3 1 2
total 3 5

Tubos de ensayo # de colonias 24 h # de colonias 48 h

Agar nutritivo
10-1 3 4
10-3 1 1
total 4 5

VI. CONCLUSIONES.

Se prepar y diluy la muestra para el anlisis microbiolgico del

alimento (refresco de cocona)
Se determin la cantidad de microorganismos presentes en la
muestra de refresco de cocona lo cual se puede decir que con pasar
del tiempo las colonias van creciendo ms porque est en un medio
donde se pueden desarrollarse.
La dilucin 10-1 se puede detectar ms microorganismos que en las
dems diluciones.
La muestra (refresco de cocona) al realizar el anlisis microbiolgico
se obtuvo pocos microorganismo.

VII. BIBLIOGRAFA.

https://www.ecured.cu/Medio_de_cultivo_(Microbiolog%C3%ADa)
https://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/bio
tecnologia/practicoIII.pdf
https://libroslaboratorio.files.wordpress.com/2012/09/medios-de-
cultivo-en-un-laboratorio-de-microbiologc3ada.pdf
http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp4.pdf
http://www.ugr.es/~cjl/medios%20de%20cultivo.pdf

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VIII. ANEXOS.

Materiales utilizados
Desinfeccin del rea de trabajo con
detergente y agua destilada

Muestras de refresco de cocona

Las diluciones realizadas

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Esterilizacin del asa de siembra

Siembra de la muestra en caja Petri.

Siembra de la muestra en tubo de

ensayo. Conteo de colonias en placa Petri.

Conteo de colonias en tubo de ensayo.

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