1 Actividad enzimtica

(preparado por Markus Tellkamp)

1.1 Introduccin
Las enzimas son protenas catalticas que permiten acelerar reacciones qumicas
en sistemas biolgicos. Logran su efecto al bajar la energa de activacin de las
reacciones, un proceso que involucra el enlazar de forma no covalente las molculas de
sustrato a la enzima. El(los) sustrato(s) es(son) la(s) molcula(s) que son transformadas
en la reaccin qumica. Una vez que se consume el sustrato los productos son liberados y
la enzimaque no sufre ningn cambio permanentepuede repetir el proceso siempre y
cuando estn presente ms molculas de sustrato.
Varios factores pueden afectar las propiedades fsicas y qumicas de las enzimas
de forma temporal o permanente. Los cambios temporales en la estructura terciaria de
una enzima bajan la tasa de una reaccin qumica; los cambios permanentes provocan la
desnaturalizacin de las protenas desactivando permanentemente a las enzimas. La
temperatura, el pH, las concentraciones relativas de enzima y sustrato son algunos de los
factores que alteran la tasa con la cual una enzima cataliza una reaccin qumica.
Esta semana la estrella del show de la prctica de laboratorio ser la enzima
peroxidasa. En muchas plantas y animales su funcin es de convertir la sustancia txica
perxido de hidrgeno (subproducto de reacciones metablicas) en agua y oxgeno. El
perxido de hidrgeno, H2O2, es por tanto el sustrato de la peroxidasa.
H2O2 + ZH2 2 H2O + Z
La peroxidasa facilita la transferencia de uno de los tomos de oxgeno a una
molcula orgnica (denominada Z en la ecuacin). En esta reaccin de reduccin-
oxidacin (o simplemente reaccin redox) el perxido de hidrgeno es reducido y una
molcula orgnica es oxidada. La molcula orgnica que aceptar el oxgeno en nuestro
experimento ser el guayacol (o guaiacol).

1.2 Objetivos
1. Disear un experimento para medir el efecto de variables ambientales sobre la
tasa de reaccin de una enzima.
2. Colectar datos usando un espectrofotmetro.
3. Analizar una grfica para determinar la tasa de una reaccin qumica.
4. Graficar y analizar tasas de reacciones enzimticas bajo diferentes condiciones
ambientales.
5. Explicar y discutir el efecto que tiene el ambiente sobre la actividad de las
enzimas, tanto a nivel de organismo como molecular.

1.3 Reactivos qumicos

Para esta prctica se proveern los siguientes reactivos: peroxidasa (extrada de
nabo), perxido de hidrgeno y soluciones con varios pH.
PeroxidasaLa peroxidasa de las races de nabo (Brassica sp.) es una
glicoprotena monomrica con un peso de 36 kDa (Duarte-Vzquez et al. 2001). Es parte
de la maquinaria bioqumica que protege a la clula de los efectos oxidantes de los

1
subproductos metablicos generados en la raz del nabo que, siendo un rgano de
almacenamiento energtico, mantiene un metabolismo activo.
Perxido de hidrgeno (H2O2)El perxido de hidrogeno es una sustancia
oxidante poderosa que puede seriamente afectar el funcionamiento de la clula o causar
su muerte. Por qu hay perxido de carbono en la raz del nabo? La presencia de ese
qumico se debe a que las clulas de la raz son metablicamente activas, produciendo
cmo subproducto al perxido de hidrgeno. Por otro lado se ha descubierto que en
algunas plantas las concentraciones bajas de H2O2 actan como una hormona regulando
el crecimiento, la cicatrizacin de heridas y la respuesta inmunolgica ante patgenos
(Bajji et al. 2007, Bajji et al. 2008, Panina et al. 2004). Debido a que la peroxidasa afecta
la cantidad de H2O2 en la clulas, esta enzima tiene funciones reguladoras de estos
procesos importantes para la planta.
GuayacolEs un compuesto orgnico con la frmula qumica C6H4(OH)(OCH3)
que ocurre de forma natural en algunas plantas. En este experimento ser la sustancia
orgnica oxidada por la peroxidasa. La ventaja del guayacol para nuestro experimento es
que cambia progresivamente de un color transparente a un color caf mientras se oxida.
Eso significa que podemos medir la tasa de la reaccin indirectamente notando el cambio
de color de la solucin experimental. Para medir con alta precisin el cambio de color en
la solucin experimental vamos a usar un espectrofotmetro.

1.4 Procedimiento experimental

Antes de comenzar los experimentos, se recomienda familiarizarse con el
espectrofotmetro porque sus lecturas nos permitirn estudiar de forma indirecta la tasa
de una reaccin enzimtica. A pesar que los grupos de trabajo sern grandes, cada
miembro del grupo debe involucrarse en el estudio.
IMPORTANTE: cada grupo deber escribir un informe formal, al estilo de un
artculo cientfico, sobre esta prctica.

1.4.1 El espectrofotmetro
El espectrofotmetro es un instrumento importante para las prcticas de
laboratorio. Sin embargo, su utilidad depende de que lo usemos con mucho cuidado. Por
ejemplo, es fcil verter los contenidos lquidos de las cubetas sobre la fuente de luz
daando no slo todos los datos subsiguientes sino al espectrofotmetro.
Siga cuidadosamente los siguientes pasos para tomar las mediciones con el
modelo de espectrofotmetro marca Zuzi que estaremos utilizando. En parntesis
hacemos referencia a las secciones correspondientes del Manual del instrumento, que se
encuentra junto a ste.
1. Prenda el espectrofotmetro (el interruptor est detrs del instrumento).
2. Espere 20 minutos hasta que la mquina se caliente debidamente.
3. Presione el botn GOTO para acceder la pantalla de seleccin de la longitud de
onda. Ajuste la onda con los tringulos al lado derecho del panel [Punto 1 en Pg.
5 del Manual].
4. Presione el segundo botn de la derecha en la fila superior con la raya horizontal
( ) [botn 2.6 en la Figura 2 en Pg. 3 del Manual].
5. Presione SET para seleccionar las diferentes funciones del equipo [Punto 3 en
Pg. 6 del Manual].

2
 6. Elija 1. Test mode presionando el segundo botn de la izquierda de la fila
superior que tambin tiene una raya horizontal ( ) [botn 2.5 en la Figura 2 en
Pg. 3 del Manual].
7. Elija 2. T% y presione OK [Figura 6 en Pg. 6 del Manual].
8. La lmpara de deuterio debe estar apagada (recomendacin del fabricante). Para
ello escogemos 2. D2 Lamp Off y presione OK [Figura 7 en Pg. 7 del
Manual].
9. Escoge la opcin 2. Off y presione OK [Figura 7 en Pg. 7 del Manual].
10. Solo los paralelos de las 7:30 am tienen que hacer este paso: En el men de
SET presione 4. Dark current y presione OK [Figura 9 en Pg. 8 del
Manual]. Una vez terminado este proceso presione el botn Cancel.
11. Ahora estamos listos para medir la solucin blanco o de referencia. La
composicin qumica de la solucin de referencia se describe ms abajo. Ponga la
cubeta con la solucin de referencia en el compartimiento porta-cubetas y presione
el botn BASIC [Punto 2 en Pg. 5 del Manual].
12. Ahora coloque la cubeta con la muestra a ser analizada (pero vase las
instrucciones ms abajo) en el porta-cubeta y aplaste el botn izquierdo de la
rayita horizontal [botn 2.5 en la Figura 2 en Pg. 3 del Manual] y siga el
procedimiento hasta concluir su experimento.

1.4.2 Medicin de lnea de base

En este experimento es muy importante limitar los errores experimentales
causados por la contaminacin de los reactivos. Use pipetas o jeringuillas para transferir
cantidades menores a 1 ml. Para todas las fases que implican el uso de reactivos se debe
usar guantes.
Para preparar la solucin de referencia, mezcle en un tubo de ensayo 8.7 ml de
agua desionizada, 0.1 ml de 0.2% guayacol y 1.0 ml de extracto de nabo. Utilizando el
dedo pulgar para sellar el tubo de ensayo, invierta el tubo tres veces con mucho cuidado
para evitar la formacin de burbujas de aire en la mezcla de reaccin. Vierta
cuidadosamente una muestra de la mezcla en una cubeta limpia de tal manera que la
cubeta quede aproximadamente 3/4 llena. Esta es la solucin de referencia que sirve para
calibrar el espectrofotmetro (vase punto 12 arriba).
Para realizar el experimento, cada miembro del grupo de estudiantes debe ser
asignado una tarea especfica. Por ejemplo, un miembro del grupo debe ser designado
como cronometrador. l o ella sern responsables de avisar a los otros miembros del
grupo cuando tomar las lecturas del espectrofotmetro. La reaccin avanza rpidamente,
as que ser necesario que todos trabajen en equipo para tomar los datos ms precisos
posibles!
Para preparar la solucin de muestra, mezcle 8.7 ml de agua desionizada, 0.1 ml
de 0.2% de guayacol y 0.2 ml de perxido de hidrgeno en un tubo de ensayo limpio.
Luego, cuando el grupo est listo para comenzar la reaccin, aadir 1.0 ml de extracto de
nabo. Para medir volmenes mayores a 1 ml, puede usarse probetas, mientras que para
medir volmenes menores a 1 ml, debe usarse pipetas. Tape el tubo con su pulgar y
suavemente invirtalo tres veces. Rpidamente, pero con mucho cuidado(!), vierta la
muestra del tubo de ensayo en una cubeta limpia e insrtela en el porta-cubetas del
espectrofotmetro. Al momento de cerrar la tapa, registre el valor inicial de transmitancia
y comience a tomar el tiempo. La transmitancia inicial debera ser por encima de un 95%;
de no ser as, significa que el procedimiento no ha sido bien realizado y debe repetirse.

3
Tome lecturas cada 10 segundos durante 3 minutos. Repita este procedimiento un total
de tres veces (hasta dominar el procedimiento). Registre sus datos en la Tabla 1-1.
Tabla 1-1. % transmitancia de luz de 470 nm en condiciones de pH fisiolgico (lnea base).

Tiempo (segundos) Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3

0
10
20
30
40
50
60
etc.

1.4.3 Clculo de la tasa de reactividad enzimtica

Vamos a utilizar Excel para calcular y comparar las tasas de reaccin de los tres
ensayos. Primero registre los datos en una hoja de Excel y grafique el % transmitancia
(eje y) vs. el tiempo (eje x). Examine las curvas resultantes. Cada curva muestra el cambio
de % transmitancia a lo largo de los tres minutos de ensayo. Al inicio hay un
decrecimiento constante de % transmitancia. Este segmento de la curva es lineal y
representa la tasa mxima de reaccin. A medida que el sustrato se agota, la tasa de
cambio en % transmitancia decrece y la curva gradualmente se aplana. En este
experimento, estamos interesados en la parte lineal inicial solamente.
Copie y pegue los datos correspondientes al segmento lineal en una nueva tabla
de Excel. Grafique los datos y realice una regresin lineal, con su respectiva ecuacin. Su
instructor le ensear como realizarlo en Excel. El estadstico R2 muestra lo bien que los
datos se ajustan a una lnea recta (un R2 igual 1.0 significa que el ajuste es perfecto).
Examine la ecuacin de la lnea obtenida. La pendiente de la lnea nos muestra que tan
rpido cambi el % transmitancia durante el perodo inicial del experimento, que es la
tasa mxima de reaccin enzimtica (% transmitancia / s)! Registre este valor en la celda
apropiada de la Tabla 1-2.
Tabla 1-2. Tasa mxima de reaccin enzimtica (% transmitancia / s) calculada en base de los
datos de la Tabla 6-1.
Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3

1.5 Tu propio experimento

Ahora cada grupo debe disear su propio experimento, aplicando los
procedimientos aprendidos en la seccin anterior. Hay varios factores que pueden afectar
la reactividad de una enzima, tal como el pH, la temperatura o la concentracin del
sustrato. Con la ayuda de su instructor, defina el factor que se va a manipular en el
experimento de su grupo (variable de tratamiento).
Antes de iniciar el experimento, debe disearlo bien aplicando los conceptos
aprendidos en la prctica del Mtodo Cientfico. Responda lo siguiente en su cuaderno
de laboratorio:

4
Pregunta: _______________________________________________
Ttulo del experimento: El efecto de ______ sobre la tasa de reaccin de la peroxidasa.
Variable de tratamiento: __________________________
Variable de respuesta: ____________________________
H0: ____________________________________________________
HA: ____________________________________________________
Explique el raciocinio de la HA (porqu tiene sentido):
_______________________________________________________
Diseo experimental (procedimiento, nmero de rplicas, anlisis estadstico, etc.):
_______________________________________________________

1.6 Literatura citada

Bajji, M., P. Delaplace, P. Du Jardin, M-L. Fauconnier, F. Gastiny & M.
MHamdi. 2008. Catalase inhibition alters suberization and wound healing
in potato (Solanum tuberosum) tubers. Physiologia Plantarum 129, 472
483.
Bajji, M., M. M'Hamdi, F. Gastiny, J. Rojas-Beltrn & P. Du Jardin. 2007.
Catalase inhibition accelerates dormancy release and sprouting in potato
(Solanum tuberosum L.) tubers. Biotechnologie, Agronomie, Socit et
Environnement 11: 121131.
Duarte-Vzquez, M., B. Garca-Almendrez , C- Regalado & J. Whitaker. 2001.
Purification and properties of a neutral peroxidase isozyme from turnip
(Brassica napus L. Var. Purple Top White Globe) roots. Journal of
Agricultural Food Chemistry 49: 44504456.
Panina, Y., N. Vasyukova & O. Ozeretskovskaya. 2004. Inhibition of activity of
catalase from potato tubers by salicylic and succinic acids. Doklady
Biological Sciences 397: 131133.

5
2 Respiracin celular aerbica
(preparado por Markus Tellkamp)

2.1 Introduccin
El metabolismo es la suma total de todas las reacciones bioqumicas necesarias
para la vida. Cada ser vivo es un sistema abierto que necesita obtener energa para
transformarla en trabajo, energa qumica y finalmente calor. Por lo tanto para determinar
el metabolismo de un organismo de forma directa pudiramos medir la cantidad de
energa trmica que produce. Sin embargo, medir el calor emitido por un organismo es
problemtico y por tanto los fisilogos usan mtodos indirectos que estiman la tasa de
metabolismo midiendo la cantidad de oxgeno consumido o dixido de carbono
producido. Para entender cmo funcionan los mtodos indirectos tenemos que considerar
lo que pasa durante la respiracin celular.
La respiracin celular es el proceso que convierte molculas orgnicas, tal como
la glucosa, en molculas portadoras de energa, comnmente el adenosin trifosfato (ATP).
Este nucletido forma parte de todas las reacciones en la clula que requieren un aporte
energtico para transformar reactivos en productos (o sea permite catalizar reacciones
endergnicas). Ya que la glucosa es la fuente principal de energa que reciben las clulas
vamos a enfocarnos en el metabolismo, o estrictamente el catabolismo, de esta molcula.
Podemos resumir al metabolismo de glucosa con la siguiente frmula qumica:
C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + energa qumica (ATP) + energa calorfica (1)
Obsrvese que por cada molcula de glucosa se consumen seis molculas de
oxgeno y se generan seis molculas de dixido de carbono y seis molculas de agua. Ya
que sabemos el contenido calrico de la glucosa podemos estimar la energa liberada por
el metabolismo correlacionndola con el nmero de molculas de oxgeno consumidas o
molculas de dixido de carbono producidas.
El cociente entre la cantidad de dixido de carbono producido y oxgeno
consumido es llamado el coeficiente respiratorio (CR) (Hill et al. 2012).
(producido)
CR = (2)
(consumido)

Para el metabolismo de glucosa, CR = 1. Sin embargo, en el metabolismo de

protenas y grasas el coeficiente es menor, alrededor de 0.7 y 0.8 respectivamente. En la
prctica de hoy vamos a medir el metabolismo de grillos alimentados principalmente con
carbohidratos, por lo tanto vamos a suponer que CR = 1. De esta forma estimamos la
cantidad de oxgeno consumido midiendo la cantidad de dixido de carbono producido.
De dnde provienen las 6 molculas de CO2 producidas en la ecuacin (1)? La
respuesta es fcil: de los seis carbonos de la glucosa. Pero para qu se consumen las 6
molculas de O2? La respuesta a esta pregunta es un poco ms compleja. En la Figura 2-1
podemos ver un esquema general del metabolismo de la glucosa.

6
 Figura 2-1. Resumen del metabolismo de la glucosa (tomado de Audesirk et al. 2008)
Como vemos, las cadenas de reacciones bioqumicas no slo convierten glucosa
a piruvato en la gliclisis y luego a otras molculas orgnicas en el ciclo de Krebs, sino
que tambin se produce NADH y FADH2. Cul es la funcin de estas molculas?
Prcticamente son portadores de electrones de alto contenido de energa (cosechados de
la glucosa) que llevan la energa hacia la matriz de la mitocondria donde esa energa es
usada para hacer ATP mediante la fosforilacin oxidativa (que incluye la cadena
transportadora de electrones y la quimismosis). Una vez que los electrones pasan de una
molcula orgnica a otra, cul es su destino final? Como se puede ver en la Figura 2-1,
el receptor final de los electrones es el oxgeno que, aceptando los electrones, se une con
dos protones para producir agua.
En la prctica de hoy, evaluaremos el efecto de dos temperaturas sobre el
metabolismo (la tasa de respiracin) de grillos.

7
2.2 Objetivos
1. Estimar la tasa de metabolismo de grillos (de nombre cientfico desconocido)
de forma indirecta, en dos condiciones de temperatura diferentes.
2. Aprender el uso de un sensor para medir la concentracin de CO2.
3. Determinar la influencia de la temperatura ambiental sobre el metabolismo de
poiquilotermos (animales de sangre fra).

2.3 Materiales
Neulog CO2 Logger Sensor
Computadora
Bao de agua a 23C
Bao de agua a 33C
Termmetros
Cmara metablica
Grillos (no identificados)

2.4 Procedimiento
1. Descargar e instalar el software del dispositivo Neulog CO2 Logger Sensor
(http://neulog.com/software/).
2. Descargar el manual para NeuLog Neuron Logger Sensor Network
Technology (http://neulog.com/wp-
content/uploads/2014/07/NeuLog_User_Guide_Ver_6_3_.pdf).
3. Conecte el sensor a la computadora y espere 30 min para calentarlo. Luego
ubquelo verticalmente para compensarlo y espere hasta que la lectura sea de
alrededor de 350 ppm, que es el valor mnimo de concentracin que puede el
sensor detectar. Para esto, es necesario la presencia de viento por lo puede
tener que salir fuera del aula.
4. Coloque silica gel en la cmara metablica (para absorber las molculas de
agua producto de la respiracin).
5. Coloque el grillo en la cmara metablica y tpela con el sensor.
6. Coloque la cmara metablica en un bao de agua a 23C tomando todas las
precauciones del caso para evitar que el sensor se moje.
7. Configure el software del sensor para que registre lecturas cada 2 segundos
durante 20 minutos.
8. Configure el software para que los datos del sensor comiencen a registrarse
cuando la concentracin de CO2 en la cmara (proveniente de la respiracin)
supere los 350 ppm (la mnima concentracin detectable por el sensor). Esto es
necesario porque la concentracin de CO2 en la atmsfera en altitudes
relativamente grandes (>2000 m) es <350 ppm.
9. Durante los 20 minutos del experimento es necesario monitorear el
comportamiento del grillo ya que su actividad aumentar la respiracin celular.
Las actividades pueden incluir caminar, saltar, estridular o mover las antenas.
Es necesario anotar el momento cuando inicia y termina una actividad.
10. Luego de terminado el experimento, grabe los datos en su computadora.
11. Repita el experimento a la temperatura de 35 C.

8
2.5 Clculos
Los siguientes clculos convierten las unidades de concentracin de CO2 de ppm
a l/h, y deben hacerse para los datos de los dos experimentos (para las dos temperaturas):
1. Calcule la diferencia de concentracin de CO2 [CO2, en ppm] antes y despus
del experimento:

[CO2] = [CO2] final [CO2] inicial

2. Determine el nmero de moles (n) de CO2 producido:

1
n (CO2 producido, en ) = [CO2]
6.023 1023

3. De la Ecuacin de los Gases Ideales sacamos la relacin V = , por lo tanto

(unidades en parntesis):

V (CO2 producido, en ) =

() 8.21 x 104 ( 1 1 ) ()
0.78 ()

4. Nota que esta frmula calcula el volumen en l. Este valor necesita

estandarizarse con respecto al volumen de un milln de molculas de aire,
V1.000.000, que es de 4.06 x 10-11 l. Divida, por tanto, el valor V (CO2) para
V1.000.000.
5. Multiplica ese cociente por el volumen de la cmara metablica (120 ml = 120
000 l).
6. Divida el resultado obtenido en el paso 5 para 0.33 h (los 20 minutos del
experimento).
Responda las siguientes preguntas en su cuaderno de laboratorio:
Por qu sube la tasa metablica cuando aumentamos la temperatura?
Cmo afectan las diferentes actividades del grillo al consumo de oxgeno?
O sea, cules actividades son energticamente ms costosas?
Digamos que lo siguiente sucede en el experimento: el grillo sigue vivo y
activo, pero la produccin de CO2 disminuye drsticamente. Qu conclusin
puedes sacar sobre la concentracin de oxgeno en el ambiente de la cmara
metablica?

2.6 Literatura citada

Audesirk, T., G. Audesirk y B. E. Byers. 2008. Biologa: la vida en la tierra, 8a
edicin. Pearson Educacin, Naucalpan de Jurez, Estado de Mxico, Mxico
Hill, R. W., G. A. Wyse y M. Anderson. 2012. Animal physiology, 3a edicin.
Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts, USA.

9
3 Pigmentos fotosintticos
(preparado por Hugo Romero-Saltos)

3.1 Introduccin
Un pigmento es una substancia que absorbe y refleja la luz de una manera
caracterstica. La luz es energa, y cuando es absorbida por un pigmento, la energa
cambia de forma. En muchos casos, la energa se pierde a travs del movimiento
molecular al azar (entropa), como cuando el chasis de un carro negro absorbe la energa
de la luz solar y se calienta.
En el que es quizs el sistema biolgico ms increble de todos, la fotosntesis, la
luz absorbida por los pigmentos vegetales no se pierde. Por lo contrario, se convierte en
energa elctrica a travs de cadenas de transferencia de electrones (las reacciones de la
fotosntesis dependientes de la luz) y luego en energa qumica contenida en los enlaces
covalentes a travs de una serie de reacciones qumicas (las reacciones de la fotosntesis
independientes de la luz). Sin las plantas y sus pigmentos que capturan la luz, la vida en
la Tierra como la conocemos no existira.
Para comprender mejor el laboratorio de hoy, es necesario revisar el contenido
sobre fotosntesis en su libro de Biologa general, especialmente lo relacionado a los roles
que tienen los pigmentos fotosintticos con respecto a la captura de energa solar. En la
prctica de hoy, se extraern algunos de estos pigmentos y se examinarn algunas de sus
propiedades fsicas.

3.2 Procedimiento
Las clorofilas y carotenoides que son usados por las plantas para capturar energa
solar y convertirla en energa qumica estn embebidas en las membranas tilacoides
dentro de los cloroplastos. Extraeremos estas molculas de pigmento de las hojas de una
especie de planta que ser escogida por su instructor. Se recomienda escoger una planta
con hojas muy verdes y obscuras, pues esto indica una alta concentracin de pigmentos
(pero no escoja una planta con hojas muy gruesas). Esta prctica de laboratorio consiste
en aislar pigmentos a partir de clulas vegetales vivas, separarlos y examinar su espectro
de absorcin y otras propiedades fsicas. Se recomienda trabajar en grupos de 45
personas mximo.

3.2.1 Extraccin de pigmentos

1. En una placa calefactora, hierva agua en un vaso de precipitacin de tamao
mediano. Si el agua tarde en hervir, disminuya su cantidad.
2. En otra placa calefactora, caliente 40 ml de etanol al 85% en un vaso de
precipitacin de tamao pequeo. No permita que el alcohol hierva.
3. Seleccione algunas hojas sin pecolos, rmpalas en pedazos (no tan pequeos)
y, con la ayuda de una pinza, remjelas en el agua hirviendo por 1530
segundos. Este proceso rompe las membranas de las clulas, facilitando la
extraccin de pigmentos.
4. Seque con papel absorbente el exceso de humedad de las hojas y colquelas
en el etanol caliente por 5 minutos mientras las agita. El etanol debe adquirir
un color verde oscuro intenso. Los pigmentos fotosintticos de la hoja han
sido extrados!

10
 5. Retire el vaso de precipitacin con la solucin de pigmentos extrados de la
placa calefactora.
6. Vierta parte de la solucin de pigmentos extrados en etanol en un tubo de
ensayo hasta llenarlo hasta la mitad. Tenga cuidado de no vertir restos de hojas
u otros residuos.

3.2.2 Separacin de clorofilas, carotenoides y xantfilos por cromatografa de

papel
Las clorofilas, carotenoides y xantfilos tienen diferentes estructuras moleculares
y por tanto diferentes propiedades fsicas y qumicas. Cada pigmento tiene un cierto grado
de solubilidad a solventes polares (como el alcohol) y solventes no polares (como el ter
de petrleo). Debido a estas diferencias fsicas, los pigmentos pueden ser separados
mediante un procedimiento conocido como cromatografa de papel.
El trmino cromatografa fue usado por primera vez en 1906 por el botnico ruso
(Mikhail Semyonovich Tsvet/Tsvett/Tswett) (18721919).
La cromatografa de papel separa una mezcla de compuestos por adsorcin segn las
afinidades de estos compuestos a una fase estacionaria (papel, gel u otro material) y segn
su solubilidad a una fase mvil (un solvente lquido como ter de petrleo).
En esta prctica, se observar cmo las diferentes afinidades y solubilidades de
los diferentes pigmentos fotosintticos causan que los pigmentos migren a diferentes
velocidades sobre el papel cromatogrfico. Estas tasas de migracin dependen
principalmente del grado de adsorcin al tipo de papel de las molculas que migran, y de
la composicin del solvente que fluye por el papel. El producto final es un cromatograma:
un papel que muestra los componentes separados, e identificables, de una mezcla que era
inicialmente homognea.
Para esta prctica utilizaremos papel cromatogrfico tipo Whatman y ter de
petrleo + acetona como solventes no polares. El solvente ser preparado previamente y
contenido en una cmara cromatogrfica sellada hermticamente (frasco de vidrio con
tapa). Para realizar la cromatografa, siga los siguientes pasos:
1. Coloque la tira de papel cromatogrfico horizontalmente sobre una superficie
limpia. No ensucie el papel cromatogrfico; manjelo slo por los filos.
2. Con un tubo capilar, tome pequeas cantidades de la extraccin de pigmentos
en etanol y realice una lnea delgada en la base del papel, a una distancia
desde el filo del papel que sea superior al nivel del solvente en la cmara
cromatogrfica (24 cm?). Practique primero la tcnica sobre un pedazo de
papel absorbente.
3. Espere unos minutos hasta que el alcohol de la lnea se evapore, y luego repita
este procedimiento varias veces hasta obtener una lnea delgada verde
obscura.
4. Coloque el frasco de cromatografa en su mesa y NO LO MUEVA. Abra el
frasco y cuidadosamente ubique el papel cromatogrfico verticalmente dentro
del frasco, asegurndose que la lnea del pigmento quede SOBRE el nivel del
solvente, NO inmerso en l. De ser necesario, doble el filo superior del papel
para que quede sostenido por el filo del frasco.
5. Tape el frasco y observe cmo los pigmentos suben por el papel
cromatogrfico. NO MUEVA EL FRASCO. Espere unos minutos y retire el

11
 papel ANTES que el primer pigmento llegue al filo superior del papel! Djelo
secar.
Los carotenoides usualmente viajan con el frente del solvente y deberan formar
una banda amarillenta en la parte superior del cromatograma. Ms abajo, los xantfilos
deberan formar una banda amarillenta-anaranjada. La clorofila a debera aparecer luego
formando una banda verde obscura. Finalmente la clorofila b debera formar una banda
verde claro en la parte inferior del cromatograma.
Corte tiras del cromatograma y reprtalas a sus compaeros de grupo para que las
peguen en s u cuaderno de laboratorio y responda las siguientes preguntas en su
cuaderno de laboratorio:
Funcionan todos estos pigmentos en los fotosistemas I y II?
Cul es la funcin de cada pigmento?
Qu pigmentos estuvieron presente en su cromatograma?
Cul es el valor Rf para cada pigmento?

=

Por qu los valores Rf son diferentes para cada tipo de pigmento?

3.2.3 Separacin de pigmentos por solubilidad diferencial

Las clorofilas, los carotenoides y los xantfilos tienen diferentes solubilidades en
diferentes solventes, dependiendo de su polaridad. Las clorofilas tienden a ser ms polares
que los carotenoides. En este ejercicio, aprovecharemos los diferentes grados de
solubilidad de los pigmentos, tanto en etanol como en ter de petrleo, para separar
clorofilas de carotenoides.
Para esta parte, trabajaremos con el extracto en el tubo de ensayo lleno hasta la
mitad. El procedimiento es:
1. Agregue ter de petrleo al tubo de ensayo lleno hasta la mitad con los
pigmentos extrados en etanol. Llene el tubo casi completamente.
2. Cubra el tubo de ensayo con su dedo pulgar y mezcle bien. Luego, levante su
dedo LENTAMENTE para liberar la presin acumulada por los vapores.
3. Deje reposar el tubo de ensayo por unos cinco minutos o hasta que se
observen dos capas COMPLETAMENTE separadas (la de etanol y la de ter).
Considerando la polaridad de los carotenoides respecto a las clorofilas, el hecho
que las clorofilas se ven ms verdes que los carotenoides, y la diferente densidad de los
solventes utilizados, responda las siguientes preguntas en su cuaderno de laboratorio:
Cul es la capa de ter de petrleo y qu pigmentos estn disueltos en ella?
Cul es la capa de etanol y qu pigmentos estn disueltos en ella?
Qu importancia puede tener las diferentes polaridades de los pigmentos
para el proceso de la fotosntesis?

3.2.4 Espectro de absorcin de los pigmentos fotosintticos

El rango de longitudes de onda que pueden ser absorbidas por un pigmento se
conoce como su espectro de absorcin. El rango de longitudes de onda que hacen posible
una reaccin fotoqumica especfica (como la fotosntesis) se conoce como el espectro de

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accin de la reaccin. Si el espectro de accin de una reaccin qumica dada coincide con
el espectro de absorcin de algn pigmento(s) presente en el sitio de la reaccin, puede
hipotetizarse que dicho pigmento(s) est(n) involucrados en la reaccin.
Estudie el espectro de absorcin de las clorofilas y los carotenoides (Figura 3-1)
y comprelos con el espectro de accin del proceso de la fotosntesis (Figura 3-2).
Responda en su cuaderno de laboratorio:
Qu implica el sobrelapamiento (o falta de sobrelapamiento) entre el
espectro de absorcin de los diferentes pigmentos y el espectro de accin?
Por qu sera una ventaja tener varios tipos de pigmentos en vez de slo uno?

Figura 3-1. Espectros de absorcin de la clorofila a, la clorofila b y los carotenoides (tomado

del libro Principles of Biology 2015).

Figura 3-2. Espectro de absorcin de los pigmentos fotosintticos comparado con el espectro
de accin de la fotosntesis (tomado del libro Principles of Biology 2015).
A continuacin, realizaremos un anlisis CUALITATIVO del espectro de
absorcin de los pigmentos separados por la diferencia en solubilidad con los solventes
etanol y ter de petrleo. Para esto, utilizaremos un instrumento conocido como
espectroscopio (ver https://pantherfile.uwm.edu/awschwab/www/specweb.htm).
El procedimiento a seguir es:

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 1. En el tubo de ensayo con las fases de ter y etanol separadas, absorba unos
1020 ml de la capa superior con la ayuda de una pipeta Pasteur (no es
necesario ser exactos) y deposite la solucin en un nuevo tubo de ensayo.
Luego haga lo propio con la otra fase, depositndola en otro tubo de ensayo.
Tenga cuidado en no mezclar las fases. DESECHE la porcin media natosa
que separa una fase de la otra.
2. Aada el solvente correspondiente (etanol o ter de petrleo, segn
corresponda) a cada uno de los tubos de ensayo para diluir la solucin.
3. Examine la solucin contenida en cada uno de los tubos pequeos con el
espectroscopio. Primero observe la luz natural (el arco iris) y luego cubra la
apertura del espectroscopio con el tubo de ensayo que contiene el extracto de
pigmentos. Qu colores desaparecen del espectro? Haga esto tanto para el
tubo con la solucin de clorofilas como con el tubo con la solucin de
carotenoides.
Dibuje lo observado en su cuaderno de laboratorio (utilice lpices de color). En
su dibujo, debe identificar claramente, aunque aproximadamente, las longitudes de onda
() correspondientes (ver Figura 3-1).
Responda en su cuaderno las siguientes preguntas:
Qu colores son absorbidos por la solucin de clorofilas? Qu colores son
transmitidos y reflejados por esta solucin?
Qu colores son absorbidos por la solucin de carotenoides? Qu colores
son transmitidos y reflejados por esta solucin?
Cul es la relacin entre la luz absorbida y la energa disponible para la
fotosntesis? cul tipo de pigmentos ser ms eficiente para llevar a cabo las
reacciones de luz de la fotosntesis? recuerde que a menor longitud de onda,
la energa contenida en los fotones de luz (o de cualquier radiacin
electromagntica) es mayor.
Aparte de la absorcin de energa lumnica, qu otros roles cumplen los
diferentes pigmentos? estn estos pigmentos presentes slo en las plantas?
(CONSULTE).

3.2.5 Fluorescencia: captura y emisin de energa lumnica

Cuando una molcula de clorofila absorbe un fotn, uno de sus electrones
orbitantes es disparado (excitado) a un nivel de energa superior. En una membrana
tilacoide viva del cloroplasto, este electrn sera aceptado por una protena que cumple el
rol de aceptor primario de electrones y enviado a la cadena de fotofosforilacin cclica
o no cclica, hasta depositar la energa del fotn en la maquinaria celular que empaca
dicha energa en las molculas de ATP o NADPH.
Las molculas de clorofila que hemos extrado estn suspendidas en una solucin
de solvente que NO tiene aceptores primarios de electrones (los pigmentos no estn en
las membranas celulares, pues las destruimos!). Sin embargo, los electrones de los
pigmentos pueden ser todava excitados a un nivel de energa superior cuando absorben
un fotn, aunque no haya un aceptor primario de electrones que los lleven en su viaje
fotosinttico (al ciclo de fotofosforilacin). Por tanto, en la ausencia de un aceptor
primario de electrones, el electrn excitado cae desde su orbital de alta energa (inestable)
de vuelta a su orbital original (estable). Qu pasa con la energa que fue originalmente

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absorbida? Recordemos por la Primera Ley de Termodinmica que la energa no puede
ser creada ni destruida, solo transformada.
Cuando el fotn fue absorbido inicialmente, su energa fue momentneamente
cambiada de energa lumnica a energa elctrica (el electrn excitado). Cuando el
electrn excitado regres a su orbital original estable, transforma nuevamente la energa
extra a energa lumnica. Es decir, otra vez la energa se transforma en un fotn! Debido
a que las transformaciones de energa de este tipo nunca pueden ser 100% eficientes, el
fotn que se emite al volver el electrn de su orbital excitado al orbital original tiene una
energa menor que el fotn que originalmente se absorbi, porque algo de su energa
original ya se perdi en forma de entropa (calor). Por tanto, la energa lumnica que se
observa en el espectro visible es una energa de amplia longitud de onda, es decir, de
qu color? Este fenmeno se conoce como fluorescencia.
Para observar la fluorescencia, siga los siguientes pasos:
1. Acerque el tubo de ensayo con la solucin de clorofila a una lmpara de 100
W, preferiblemente ubicando la solucin en frente de un fondo negro. Ante
tan fuerte irradiacin, la solucin debera cambiar de un color _____ a un
color _______. No es esto algo increble? La intensidad del color ______ va
a depender de la concentracin de clorofila en la solucin.
Responda las siguientes preguntas en su cuaderno:
Cul es el significado de la fluorescencia?
Podra ocurrir fluorescencia en plantas vivas? por qu s o por qu no?

3.3 Literatura citada

Nature Publishing Group. 2015. Principles of Biology (live on-line textbook).
http://www.nature.com/principles

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