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REVISTA DO MS MATRIAS

Como evitar a formao

Qualidade

Autor: Lucia Clontz


A contaminao microbiana pode causar uma reduo de fluxo e corroso das linhas do sistema
de gua

N da Edio: 109
Maio / 2008 Introduo

Microorganismos esto presentes nos ambientes ou como clulas livres, ou formando


Confira os tipos e
caractersticas de comunidades microbianas complexas associadas superfcies diversas que se chamam
divisrias e forros para biofilmes. Na natureza, raro o tipo de ecologia com clulas individuais crescendo livres, em
reas limpas suspenso, sendo o biofilme a forma mais comum de uma populao microbiana. Biofilmes tm
importantes papis na natureza e so conhecidos como filtros biolgicos. Nas estaes de
Materiais tratamento de gua, biofilmes ajudam na remoo de organismos patognicos, participam na
reciclagem do enxofre oriundo de drenados de cidos de minas e reduzem a quantidade de
matria orgnica nos efluentes. Porm, em muitas situaes, o crescimento de biofilmes no
desejvel e sua presena tem um impacto negativo.
Biofilmes so formados naturalmente em qualquer superfcie slida quando em contato com gua
no esterilizada. A contaminao microbiana pode causar uma reduo de fluxo e corroso das
linhas do sistema de gua. Porm, o impacto negativo maior a deteriorao da qualidade
da gua que exerce papel fundamental nas diferentes fases do processo de fabricao de
produtos farmacuticos. A formao de biofilmes pode contaminar os produtos farmacuticos
e consequentemente causar injria pacientes submetidos aplicao dos mesmos.
Sistemas de purificao e distribuio de gua contribuem para a colonizao microbiana por
fornecer as quatro condies necessrias para a formao de biofilmes: gua, nutrientes,
superfcie inerte e presena de clulas livres (planctnicas). Por menor que seja, o processo de
formao de biofilmes (fouling) inevitvel. Portanto, necessrio o controle rigoroso dos
sistemas de purificao de gua e dos processos de tratamento, incluindo cuidados especiais
para os mtodos de avaliao, remoo e preveno de biofilmes.

O que so biofilmes?

Biofilmes so comunidades microbianas imobilizadas em superfcies biticas ou abiticas e


embebidas numa matriz viscosa, composta de substncias polimricas extracelulares, a qual
produzida pela prpria comunidade [1]. Biofilmes podem se originar de uma ou de diversas
espcies de microorganismos. As bactrias de um biofilme formam uma entidade biolgica
complexa e dinmica atravs de um comportamento multicelular com atividades coordenadas
de interao e comunicao interbacteriana (quorum sensing).
Biofilmes so de inquestionvel importncia para a sobrevivncia de microorganismos em
vrios tipos de ambientes. Umas das mais fascinantes descobertas sobre biofilmes o fato
de que vrias bactrias transferem entre si diversas caractersticas genticas. Por exemplo,
a resistncia a produtos antibiticos transferida a outras clulas da comunidade atravs
de plasmdeos. A resistncia a tratamentos com produtos micro biocidas tambm possvel
devido transferncia horizontal de genes, densidade do biofilme, aos tipos de
metabolismo das clulas e da expresso atpica de genes quando comparada ao fentipo
das clulas livres das mesmas espcies de organismos.

Formao e acumulao de biofilmes

Os processos de formao e acumulao de biofilmes, dependente de fatores fsicos e


biolgicos, so compostos de mais ou menos trs etapas distintas como ilustradas na Figura 1.
1. Na primeira etapa, clulas livres no meio lquido so transportadas para perto de uma
superfcie slida causando sua subsequente fixao devido participao de molculas de
adeso (fmbrias ou flagelos) presentes ao longo da superfcie celular. Estudos feitos com
linhagens mutantes de pseudomonas aeruginosa relataram que, quando clulas no
sintetizam flagelos, elas so incapazes de realizar as interaes iniciais com as superfcies
para formao do biofilme.
2. A segunda etapa envolve o crescimento e diviso das clulas fixas, a custa de nutrientes
presentes no lquido, e a produo e excreo da matria exopolissacardia (EPS) que passa a
atuar como substrato para aderncia de microorganismos colonizadores secundrios. Durante
esta etapa, a comunidade cresce com a fixao de outros tipos de clulas bacterianas e outras

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partculas flutuantes.
3. Finalmente, quando o biofilme atinge uma etapa de amadurecimento, a massa bacteriana
liberada por mecanismos como eroso e disperso. Microorganismos liberados podero
colonizar novos ambientes causando, eventualmente, uma contaminao sistmica do sistema
de gua.
A maioria das bactrias presentes em sistemas de gua so oligotrficas, podendo se
reproduzir em ambientes com contedo de carbono mnimo (e.g., 115 mg de carbono por litro
de gua). Nessas condies de deficincia nutricional, h um aumento na capacidade de
aderncia superfcies, pois clulas microbianas tm mais acesso a nutrientes quando
presentes numa comunidade imobilizada. Por isso, importante evitar a presena de pontos
mortos ou gua parada em tubulaes, pois estes facilitam a adeso de clulas s
superfcies.

Arquitetura dos biofilmes

Biofilmes so estruturas tridimensionais complexas e compostas aproximadamente de 15% de


uma densa massa microbiana envolta pela matriz de EPS que forma a maior parte do biofilme,
sendo essa uma estrutura composta na maior parte de gua (95%). Essa comunidade biolgica
contm reas intersticiais vazias e vrios canais de gua que podem ser comparados a um
sistema circulatrio primitivo. Esses canais permitem a troca de nutrientes e metablitos
potencialmente txicos para os organismos.
As clulas microbianas presentes num biofilme possuem vrios tipos de metabolismo,
estando as bactrias mais ativas (e aerbicas) na parte exterior e as bactrias mais inertes
(e anaerbicas) na parte interior da comunidade. Bactrias residindo no interior de biofilmes
so protegidas de deslocao quando expostas a uma corrente de gua com alta
turbulncia. Tais clulas tambm esto protegidas da ao de biocidas, como o cloro,
destinados a combater a expanso de biofilmes sobre superfcies industriais.
Clulas em biofilmes so muito mais resistentes desinfeco quando comparadas s clulas
livres [2]. Como ilustrado na Figura 2, o mecanismo de defesa em biofilmes tem vrias origens,
incluindo a estrutura da matriz EPS, um micro ambiente com regies aerbicas e anaerbicas e a
presena de clulas que parecem estar numa condio metablica de dormncia (persister
cells). Por isso, os mtodos convencionais de desinfeco so ineficientes contra biofilmes e
requerem, por vezes, doses elevadas do desinfetante.
Quando um biofilme atinge sua capacidade mxima, as clulas sofrem disperso, em geral de trs
tipos: (1) disperso expansiva acontece quando clulas retornam motilidade e so liberadas da
comunidade; (2) durante uma disperso de fragmentao, pores da comunidade so liberadas
por eroso forada; (3) disperso superficial acontece quando camadas na superfcie do biofilme
so liberadas via quorum-sensing.
Disperso de biofilmes tem um repercusso extremamente negativa, pois as clulas liberadas
mantm suas caractersticas genticas de resistncia e eventualmente se tornam ssseis,
colonizando outras partes do sistema de gua.

Avaliao de Biofilmes

A presena de biofilmes em sistemas de gua purificada difcil de ser detectada, pois na maioria
dos casos, as clulas do biofilme esto em condies viveis mas no culturveis (VBNC
viable-but-non-culturable). Sendo assim, essas clulas no iro se reproduzir nos meios de
cultura tpicos para o cultivo de bactrias (e.g., TSA e R2A). Geralmente clulas detectadas so
planctnicas ou se soltaram do biofilme. Por isso, quando microorganismos gram negativos so
detectados e os ensaios foram feitos corretamente, h uma alta probabilidade de que um biofilme
existe no sistema de gua, nas vlvulas ou nas mangueiras usadas para coletar as amostras
importante fazer esta distino para poder verificar a origem da contaminao.
A avaliao da presena de biofilmes tambm oferece um dilema aos microbiologistas, pois no
existe uma relao direta quanto ao nmero de clulas detectadas nas amostras e a
localizao ou o tamanho da comunidade microbiana. Por exemplo, um nmero baixo de
microorganismos pode ser uma indicao de um biofilme amadurecido (clulas se soltam para
colonizar outras partes do sistema de gua). Porm, este mesmo biofilme pode soltar um
nmero enorme de clulas esporadicamente (e.g., 1000 CFU UFC/mL) ou no soltar nenhuma
clula. Quando este tipo de padro de bioburden for observado nos resultados de
monitoramento de um sistema de gua, h razo para investigar a presena de um biofilme.
Os mtodos visuais (e.g., microscopia de contraste, microscopia epifluorescncia, microscopia
eletrnica de varredura, ou uso do corante alaranjado de acridina) e no visuais (e.g., impedncia
e bioluminescncia) podem ser usados para avaliar biofilmes diretamente nas superfcies. A
tcnica de bioluminescncia, baseada no contedo de trifosfato de adenosina (ATP), uma boa
alternativa para detectar clulas de biofilmes em amostras de gua. Usando essa tecnologia,
clulas viveis mas no culturveis podem ser enumeradas.

Preveno de biofilmes

Remoo de biofilmes extremamente difcil. Por isso, a melhor soluo para evitar a
formao de biofilmes a preveno, a qual deve comear com o projeto e continuar com a
manuteno do sistema. Cuidados durante a fase do projeto garantem a produo de gua
com boa qualidade e
evitam contaminao microbiana no futuro.
Em sistemas inadequados, a formao de biofilmes pode ser iniciada algumas horas aps a
instalao e em certos casos, em poucos minutos [3]. As reas de maior risco de

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contaminao num sistema de gua purificada so as gaxetas, cotovelos e locais onde a


velocidade do fluxo baixa (e.g., zonas mortas, trocadores de calor e tanques de
armazenamento). Cuidados tambm so necessrios para evitar vazamentos nos trocadores
de calor e contaminao de blocos de carbono ativado e das membranas dos sistemas de
osmose reversa. Para a instalao do sistema necessrio utilizar tubos, vlvulas, registros,
gaxetas, etc. fabricados com materiais inertes, livres de pontos mortos, sem superfcies
speras ou vazamentos. Estes mesmos devem ser facilmente limpos, drenados e sanitizados.
O uso de materiais lisos, como ao inoxidvel 316L e Teflon, no s facilitam a limpeza como
tambm retardam a adeso de microorganismos. Cotovelos e interconexes devem ser
evitados para diminuir a possibilidade de que clulas livres entrem em contato com
superfcies.
O fluxo de circulao contnua o mtodo de distribuio recomendado e geralmente, sistemas
de gua purificada so mantidos a uma velocidade de 1.52.5 metros por segundo, criando uma
turbulncia satisfatria para satisfazer as autoridades regulamentares (e.g., FDA e Anvisa).
Porm, j que biofilmes podem ser formados mesmo em condies de alta turbulncia [4],
contar com fluxo elevado de circulao como preveno de contaminao sem usar um
tratamento biocida no uma prtica recomendada.

Sanitizao e remoo de biofilmes

Os processos de tratamento e sanitizao de linhas de gua utilizam mtodos diferentes ou


combinaes de processos para garantir a produo de gua com as qualidades fsico-qumicas e
microbiolgicas necessrias para uso na indstria farmacutica. A gua potvel tratada com
processos como filtrao primria, ultrafiltrao, carvo ativado e ultravioleta. Para produo de
gua usada na manufatura de produtos farmacuticos, processos como deionizao, osmose
reversa, destilao e ultrafiltrao, alm de tratamento com radiao ultravioleta so usados.
Sanitizao frequente necessria para prevenir a formao de biofilmes. Quanto mais denso o
biofilme, mais difcil ser para que ele seja inativado ou removido. Por isso, importante que o
mtodo de sanitizao usado seja capaz de reduzir o nmero das clulas livres e de prevenir
adeso das mesmas nas superfcies da tubulao.
O processo de sanitizao mais eficaz envolve manuteno da gua aquecida a 65-80C e
circulando continuamente um sistema mantido nestas condies considerado auto-sanitizante,
pois bactrias adaptadas a sistemas aquticos geralmente no podem sobreviver em
temperaturas acima de 30C. Para manuteno de sistemas de gua purificada com circulao e
temperatura ambiente (25 5C) ou com circulao e temperatura fria (05C) recomendado
sanitizao semanal de tubulaes e sanitizao diria dos pontos de uso.
Radiao ultravioleta (UV) tambm usada como sanitizante e atinge em geral uma eficincia de
99% na eliminao de clulas planctnicas UV no tem eficcia contra clulas em biofilmes.
Filtrao usando membranas micro retentivas em combinao com radiao ultravioleta uma
prtica bem eficaz para eliminar clulas livres, especialmente para sistemas de gua que no
podem ser mantidos temperaturas altas. Porm, deve-se ter cuidado para evitar que clulas
acumuladas na superfcie do filtro atravessem o mesmo e contaminem o sistema.
Produtos qumicos, como cloro, oznio, hipoclorito de sdio, dixido de cloro, formaldedo e cido
peractico tambm so usados como sanitizantes. Porm, quando um biofilme se instala no
sistema, difcil sua remoo com produtos qumicos [5]. O oznio, frequentemente usado em
sistemas de gua purificada, extremamente eficaz tendo um desempenho superior ao hipoclorito
de sdio, formaldedo e cido peractico. O formaldedo apenas desinfeta a superfcie do
biofilme, pois ele no penetra as camadas da massa microbiana. O hipoclorito de sdio e cido
peractico atacam o biofilme, mas vrios tratamentos so necessrios, e com bastante
frequncia, para poder eliminar totalmente as clulas (e.g., de uma a duas vezes por semana). J
o oznio mais eficaz, podendo penetrar e desintegrar a matriz EPS, atacando as bactrias no
interior do biofilme e destruindo as endotoxinas produzidas por clulas gram negativas. Por isso,
dos tratamentos qumicos usados, o oznio o mais preferido e o mais seguro. Porm, quando
usar oznio para remover biofilmes estabelecidos, preciso aplicar uma concentrao maior do
que a usual e por um tempo de contato mais longo. O dixido de cloro tambm eficaz e como
um gs dissolvido em gua, este produto capaz de penetrar nas camadas do biofilme e inativar
as clulas. Como h certas dificuldades com o uso de dixido de cloro, muitas companhias
preferem usar oznio.
Alm de tratamento qumico e de calor, remoo de biofilmes por meios fsicos deve ser utilizada
sempre que possvel. As clulas mortas, se no forem removidas, servem de nutrientes e
superfcie para clulas planctnicas, causando uma rpida re-colonizao.

Concluso

Biofilmes so comunidades microbianas extremamente resistentes processos que


normalmente seriam letais s clulas planctnicas. Por isso, necessrio evitar a adeso de
clulas livres a superfcies usando meios fsicos (e.g., filtrao, UV, calor) e remover
completamente biofilmes detectados por meios fsicos (e.g. limpeza mecnica com uso de
soluo detergente, fluxo alto e temperatura elevada) e qumicos (e.g., oznio).
Em geral, contaminao microbiolgica de sistemas de gua resulta de falhas durante o projeto
ou durante a manuteno. Prevenir biofilmes extremamente importante, pois a remoo
completa de um biofilme estabelecido muito difcil. Para preveno e remoo de biofilmes, a
sanitizao dos encanamentos, vlvulas e mangueiras, usando mtodos qumicos e fsicos, um
procedimento crtico.
A vigilncia constante com monitoramento de amostras de gua necessria para garantir o
controle microbiolgico do sistema. Por isso, os mtodos usados devem ser otimizados para

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cultivar clulas bacterianas tpicas de sistemas de gua purificada.


O entendimento da importncia de biofilmes na qualidade da gua usada na indstria
farmacutica pode levar a uma melhor manuteno preventiva dos sistemas de purificao,
atravs da definio de protocolos de monitoramento e sanitizao peridicas e frequentes,
evitando o impacto negativo de biofilmes.

Lucia Clontz
Diretora de Microbiologia da Diosynth Biotechnology, uma companhia da Schering-Plough,
Carolina do Norte, EUA

Referncias bibliogrficas

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