I.

INTRODUCCIN

Las enzimas constituyen un grupo de biomolculas de alta actividad cataltica y

especificidad de accin que han ido alcanzando un notable incremento aplicativo en
la industria manufacturera y procesadora, en particular la industria alimenticia.1

La utilizacin de las enzimas microbianas como sustitutas de las obtenidas a partir

de organismos superiores es una tendencia creciente a nivel mundial, dado el
nmero de ventajas que presentan estas fuentes, entre las que deben sealarse2:
mayor facilidad de escalado de las producciones y por tanto ms posibilidad de
satisfaccin de las demandas, aumento de la productividad mediante mejoramiento
de cepas, mayor facilidad de cultivo en ambientes controlados y menor duracin de
los ciclos de produccin.

En funcin de su accin cataltica especfica las enzimas se clasifican en grupos o

clases. Dentro de la clase 3 correspondiente a las hidrolasas, las enzimas
proteolticas tambin denominadas proteasas, proteinasas o peptidasas integran la
subclase 3.4 y representan alrededor del 2% de todos los productos gnicos.3

Estas enzimas se caracterizan porque catalizan especficamente la hidrlisis del

enlace peptdico. Se han utilizado desde tiempos muy antiguos en un gran nmero
de procesos biotecnolgicos. Entre los ms conocidos pueden citarse3: la
tiernizacin de carnes, la elaboracin de cerveza, la panificacin, la elaboracin de
quesos y la obtencin de protenas modificadas en la industria alimentaria.

Tambin se utilizan como aditivos en polvos detergentes, en el tratamiento de

efluentes industriales, en el proceso de manufactura de cueros, en la industria textil
y ms recientemente en la sntesis de pptidos en medios no convencionales.4
Destaca adems su importancia clnica en la produccin de hidrolizados de protenas
para dietas nutricionales y teraputicas.5

Las proteasas obtenidas a partir de bacterias del gnero Bacillus representan las de
mayor significado aplicativo en la biotecnologa mundial. De ellas, resalta por su
gran diversidad de utilizacin la subtilisina (Subtilopeptidasa A.),6 serino-proteasa
secretada por B. subtilis durante una fase de su crecimiento y otros microorganismos
relacionados. Esta proteasa se produce fundamentalmente a escala industrial para su
 utilizacin en la manufactura de hidrolizados proteicos a partir diferentes fuentes
proteicas.7

El presente trabajo tiene como objetivos, aislar y seleccionar bacterias productoras

de proteasas, asimismo obtener el cultivo puro de dichas bacterias.

II. MATERIALES Y MTODOS

2.1 MATERIALES
2.1.1. Muestra
- Suelo de cultivo de yuca.
2.1.2. Medio de Cultivo
- Agar leche al 5%
2.1.3. Reactivos, colorantes y soluciones
- Agua destilada estril (ADE)
- Alcohol yodado
- Set para coloracin Gram
2.1.4. Material de Laboratorio
- Beaker de 200 mL
- Frascos de vidrio de 5 mL
- Placas de Petri
- Lminas porta-objetos
- Lminas cubre-objetos
- Asa bacteriolgica
- Mecheros
- Aceite de cedro
- Soporte para lminas
- Algodn
- Guantes
- Mascarillas
- Gorros
 2.1.5. Equipos e instrumentos
- Autoclave
- Estufa
- Microscopio ptico.
- Refrigeradora
- Cocina elctrica
- Termmetro (0-100C)
- Balanza de platillos
2.1.6. Otros
- Una caja de maicena
- Bandeja de plstico
- Pulverizador
- Bolsas de polietileno (nuevas)
- Encendedor
- Esptula de metal
- Tela nans
- Ron de quemar
- Marcador
- Etiquetas
- Cinta parafilm

2.2 MTODO
2.2.1. Recoleccin de la muestra y pre-enriquecimiento
- Recolectar adecuadamente las muestras de suelo en bolsas de
polietileno de primer uso, teniendo en cuenta su ubicacin y
condiciones climticas al momento de recoleccin para ser luego
transportadas al laboratorio.
- Colocar las muestras por separado en bandejas de plstico y retirar las
piedras, ramas, hojas, etc.
- Espolvorear maicena al 10%.
- Humedecer con un pulverizador y remover peridicamente durante 5
das; evitar el exceso de agua.
2.2.2 Preparacin de la muestra de suelo
- Cumplido el tiempo del pre-enriquecimiento, homogeneizar la
muestra y pesar 10g de suelo y colocarlo en un beaker conteniendo
90 mL de agua destilada. Homogeneizar.
- Calentar a 80C durante 10 minutos.
- Dejar reposar unos 5 minutos.
2.2.2.1. Cultivo
- Colocar con el asa hasta 2 gotas del sobrenadante en placas
conteniendo Agar Leche y sembrar por estra.
- Incubar a 30C durante 24-48 horas. Observar el crecimiento de
colonias cada 24 horas.
2.2.2.2. Aislamiento y seleccin primaria de bacterias productoras
de proteasas
- Despus de la incubacin, contar las colonias desarrolladas que
presenten halos proteolticos
- De las colonias seleccionadas, observar y registrar el color, el
tamao, los bordes, u otras caractersticas macro-morfolgicas.
Enumerarlas
- Hacer coloraciones Gram para observar su morfologa
microscpica, chequear su pureza y determinar su
comportamiento frente a la coloracin Gram.
- Aislar las colonias seleccionadas en frascos de vidrio
conteniendo Agar leche inclinado. Rotular e incubar a 30C
durante 24 horas.
- Despus de la incubacin, hacer nuevamente coloraciones Gram
con la finalidad de chequear su pureza.
- De los cultivos contaminados hacer suspensiones en ADE,
sembrar por estra en placas conteniendo Agar leche e incubar a
30C durante 24 horas.
- Repetir los pasos anteriores, maximizando las medidas de
asepsia y continuar.
 2.2.2.3. Registro y conservacin de cultivos productores de
proteasas
- Sellar los cultivos puros en condicione aspticas, rotular y
conservarlos en recipientes estriles a 10C hasta el momento de
continuar con la seleccin.
- Llenar fichas de registro para cada cultivo seleccionado.

FUENTE DE
AISLAMIENTO:
SUELO DE CULTIVO 5g de suelo
+ 45 mL de Pre-tratamiento
Pre- ADE
enriquecimiento

Sembrar en la placa por estra

Tomar con el asa
hasta dos gotas
de la muestra

Incubar a 30C AGAR LECHE 5%

por 24h-48h

Observar morfologa
de la colonia y realizar
coloracin Gram

Chequear pureza Aislar las colonias

seleccionadas

Sellar los cultivos puros Llenar fichas de registro

y conservar a 10C para cada cultivo
seleccionado
 III. RESULTADOS

AISLAMIENTO Y SELECCIN PRIMARIA DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE PROTEASAS

Asignatura: Microbiologa Industrial Ao Acadmico: 2017-I Seccin: A Mesa: 2

Estudiantes responsables: Caldern Vsquez Miguel ngel, Daz Flores Rosa Milagros
Pre-tratamiento Condiciones
Cdigo del Fuente de Medio de Caractersticas
de la fuente de de Coloraciones Caractersticas macroscpicas
cultivo aislamiento aislamiento microscpicas
aislamiento incubacin

Suelo de 80C durante 10 Agar leche 30C por Tincin de Elevacin plana, margen dentado, Bacilos Gram (-),
MIT-BP2A1
cultivo de yuca minutos 5% 24h-48h Gram cremosa, brillosa, rugosa. con extremos curvos.

Suelo de 80C durante 10 Agar leche 30C por Tincin de Elevacin plana, margen Bacilos Gram (+),
MIT-BP2A2
cultivo de yuca minutos 5% 24h-48h Gram ondulado, brillosa, color crema. con extremos curvos.
Suelo de 80C durante 10 Agar leche 30C por Tincin de Elevacin plana, margen aserrado, Bacilos Gram (-),
MIT-BP2A3
cultivo de yuca minutos 5% 24h-48h Gram color mostaza, seca. con borde ovalado.
Suelo de 80C durante 10 Agar leche 30C por Tincin de Elevacin plana, margen dentado,
MIT-BP2A4 Cocos gram (-)
cultivo de yuca minutos 5% 24h-48h Gram brillosa, color crema.
Suelo de 80C durante 10 Agar leche 30C por Tincin de Elevacin plana, margen
MIT-BP2A5 Diplococos (-)
cultivo de yuca minutos 5% 24h-48h Gram ondulado, cremosa, brillosa.
IV. COMENTARIO

Bacillus es un gnero altamente presente en la rizsfera de diversos cultivos debido

a su capacidad de formacin de esporas que le da una ventaja de supervivencia en la
rizsfera vegetal.8 Es por ello que la fuente para el aislamiento y seleccin primaria
de bacterias productoras de proteasas fue un suelo de cultivo de yuca.

En un trabajo realizado9 se seleccionaron cepas nativas del gnero Bacillus con

actividad quitinoltica y proteoltica, en suelo tropical en la costa de Oaxaca,
Mxico. Se aislaron 150 cepas, de las cuales 22 fueron seleccionadas por presentar
actividad quitinoltica y proteoltica. Dicha actividad se evalu por la formacin de
halo de hidrlisis alrededor de la colonia de 2 mm para quitinasas y 8 mm para
proteasas en medios de cultivo suplementados con quitina coloidal al 5% y leche
descremada al 1% respectivamente.

En otro trabajo8 se realiz una descripcin morfolgica de las colonias,

caracterizacin fisiolgica y bioqumica a 43 aislamientos de Bacillus spp.
provenientes de la rizsfera del cultivo de papa de dos zonas altoandinas en Per. Se
encontr que las bacterias del gnero Bacillus constituan un grupo importante,
siendo la mayora pertenecientes al grupo de Bacillus subtilis. Se realizaron
correlaciones entre morfologa de colonia, lugar de procedencia, crecimiento a
temperatura baja y a pH bajo para llegar a conocer la existencia o ausencia de una
relacin que nos lleve a un mejor entendimiento del comportamiento de este gnero.

Un paso fundamental para tener xito en el aislamiento de bacterias productoras de

proteasas es que despus del tiempo de incubacin se deben seleccionar aquellas
colonias con caractersticas del gnero Bacillus, tomando en cuenta su aspecto y
morfologa tpica: blanquecinas, opacas, aplanadas de bordes irregulares y
caractersticas microscpicas tpicas: formas bacilares y fomadoras de endosporas.9
V. CONCLUSIONES

Al concluir la prctica se logr aislar y seleccionar cinco tipos de bacterias

diferentes, las cuales son productoras de proteasas a partir de muestras de suelo de
cultivo. Adems, se obtuvo el cultivo puro de dichas bacterias, resultando factible
aislar con xito bacterias productoras de proteasas de: suelo frtil de camote, papa,
races de plantas, etc.; esto siempre y cuando se apliquen las estrategias adecuadas,
como el tratamiento trmico, pre-enriquecimiento, temperatura y tiempo de
incubacin

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Knorr. D. and Sinskey. A.J."Biotecnology in food production and processing"

Science, 229:1224, (1985).
2. Frost, G.M. and Moss, D.A. "Production of Enzymes by
Fermentation"Biotechnology, 7:333, 1993.
3. Uhlig, H. (1998). Industrial enzymes and their applications. Nueva York: Willey
& Sons, pp.: 1-11, 146-179.
4. Guzmn F., S. Barberis & A. Illanes (2007) Peptide synthesis: chemical or
enzymatic Electronic Journal of Biotechnology, 10: 279-314.
5. Loffler, A. "Proteolytic enzymes: Sources and aplications".
Food.Technol.,40:63. (1986).
6. Smith, K.E. and Bradley, R.L. "Activity of four anzyme-based cleaners
forultrafiltrations systems against proteins in skim milk and whey". J. Dairy.
Sac.70:243, (1987).
7. Adler-Nissen.J. "Enzimatyc Hydrolisis of Food Proteins" Elsevier
AppliedScience. /New York/:104-271, (1986).
8. Calvo E, Zuiga D. Caracterizacin fisiolgica de cepas de Baillus spp. aisladas
de la rizsfera de papa (Solanum tuberosum). Ecol. Apl. 2010; 9(1): 31-39.
9. Rodas B, Quero M, Magaa H, Reyes A. Seleccin de cepas nativas con
actividad Quitino-Proteoltica de Bacillus sp. aisladas de suelos tropicales. Rev.
Colomb. Biotecnol. 2009; 11(1): 107-113.
VII. ANEXOS

Anexo 01. Medio de cultivo

a) Agar leche
Peptona 5.0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Dextrosa 1.0 g
Leche descremada 1,0 g
Agar 12.5 g

Anexo 02. Halo de hidrlisis por bacterias productoras de proteasas

Fig1. Colonias de bacterias productoras de

proteasas en Agar Leche que presentan zonas
transparentes a su alrededor.
Anexo 03. Observacin microscpica de las bacterias productoras de proteasas
aisladas con coloracin Gram.

Fig2. Colonia MIT-BP 2A1 Fig3. Colonia MIT-BP 2A2

Fig4. Colonia MIT-BP 2A3 Fig5. Colonia MIT-BP 2A4

Fig6. Colonia MIT-BP 2A5

Anexo 03. Cultivos puros de bacterias productoras de proteasas aisladas de
suelo de cultivo de yuca en Agar Leche.

Fig7. Cultivos puros de las colonias MIT-BP 2A1- MIT-BP 2A5

respectivamente.