Dengue Diagnostico PDF

Captulo 4: Diagnstico de Laboratorio y Pruebas Diagnsticas
CAPTULO 4
CAPTULO 4
DIAGNSTICO DE LABORATORIO
Y PRUEBAS DIAGNSTICAS
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Dengue: guas para el diagnstico, tratamiento, prevencin y control.
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CAPTULO 4. DIAGNSTICO DE LABORATORIO Y PRUEBAS

DIAGNSTICAS
4.1 PANORAMA GENERAL
El diagnstico eficiente y preciso del dengue es de fundamental importancia para

la atencin clnica, es decir, la deteccin temprana de casos graves, la confirmacin
de casos y el diagnstico diferencial con otras enfermedades infecciosas, actividades
de vigilancia, control de brotes, patognesis, investigacin acadmica, desarrollo
de vacunas y pruebas clnicas.
Los exmenes de laboratorio para confirmar la infeccin por el virus del dengue
pueden abarcar la deteccin del virus, el cido nucleico viral, antgenos o anticuerpos
o una combinacin de estas tcnicas. Despus de la aparicin de la enfermedad,
el virus se puede detectar durante cuatro a cinco das en el suero, el plasma, las
clulas sanguneas circulantes y otros tejidos. Durante las primeras etapas de la
enfermedad, se puede usar el aislamiento del virus, la deteccin del cido nucleico
o el antgeno para diagnosticar la infeccin. Al final de la fase aguda de la
infeccin, la serologa constituye el mtodo de eleccin para el diagnstico.
CAPTULO 4
La respuesta de los anticuerpos a la infeccin difiere de acuerdo con el estado
inmunitario del husped (1). Cuando la infeccin del dengue se presenta en personas
que no han sido previamente infectadas con un flavivirus ni inmunizadas con una
vacuna de flavivirus (por ejemplo, para fiebre amarilla, encefalitis japonesa, encefalitis
transmitida por garrapata), los pacientes desarrollan una respuesta primaria de
anticuerpos caracterizada por un lento aumento de anticuerpos especficos. Los
anticuerpos IgM son el primer isotipo de inmunoglobulina en aparecer. Estos
anticuerpos se pueden detectar en 50% de los pacientes alrededor de los das 3
a 5 despus de la aparicin de la enfermedad, y aumentan a 80% para el da 5
o a 99% para el da 10 (figura 4.1). Los niveles de IgM alcanzan el pico,
aproximadamente, dos semanas despus de la aparicin de los sntomas y luego
declinan a niveles no detectables durante dos a tres meses. Generalmente, los
anticuerpos IgG anti-dengue en el suero se pueden detectar en ttulos bajos al final
de la primera semana de la enfermedad, y aumentan lentamente desde entonces,
y los anticuerpos IgG son todava detectables en el suero despus de varios meses,
y probablemente incluso de por vida (24).
Durante una infeccin secundaria de dengue (una infeccin por dengue en un

husped infectado previamente por un virus de dengue, o algunas veces despus
de una vacunacin o infeccin de flavivirus no relacionada con el dengue), los
ttulos de anticuerpos se elevan rpidamente y reaccionan ampliamente contra
muchos flavivirus. La IgG es el isotipo de inmunoglobulina que predomina, es
detectable a niveles altos, aun en la fase aguda, y persiste por perodos que duran
de 10 meses a toda la vida. Los primeros niveles de IgM en la etapa de convalecencia
son significativamente ms bajos en las infecciones secundarias que en las primarias
y en algunos casos es posible que no se detecten, dependiendo de la prueba
empleada (5). Para distinguir entre las infecciones primarias y las secundarias de
dengue, las relaciones entre los anticuerpos IgM e IgG se usan ahora con mayor
frecuencia que la prueba de inhibicin de hemaglutinacin (6-8).
Se ha elaborado una serie de mtodos de diagnsticos de laboratorio para apoyar

al manejo del paciente y el control de la enfermedad. La seleccin del mtodo de
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diagnstico depende del propsito para el cual se realizan las pruebas (por ejemplo,
diagnstico clnico, estudio epidemiolgico, desarrollo de vacunas), el tipo de
laboratorio y la experiencia y conocimientos tecnicos disponibles, los costos y el
tiempo de recoleccin de las muestras.
Figura 4.1 Lnea de tiempo aproximada de las infecciones primarias y secundarias por el virus del
dengue y los mtodos de diagnstico que se pueden usar para detectar la infeccin
Deteccin de NS1
Aislamiento del virus

Deteccin de ARN
Viremia
IgM primaria
IgM secundaria
IgG secundaria
IgG infeccin secundaria
Aparicin de los sntomas (das)
En general, las pruebas con gran sensibilidad y especificidad requieren

experiencia y conocimientos tcnicos y tecnologas ms complejas, en tanto
que las pruebas rpidas pueden sacrificar la sensibilidad y especificidad por
la facilidad de su realizacin y la velocidad de su prctica. Las tcnicas de
aislamiento del virus y deteccin del cido nucleico son ms laboriosas y ms
costosas, pero tambin, son ms especficas que la deteccin de anticuerpos
mediante mtodos serolgicos. La figura 4.2 muestra una relacin inversa entre
la facilidad de uso o accesibilidad de un mtodo de diagnstico y la confianza
en los resultados de la prueba.
Figura 4.2 Comparacin de las pruebas diagnsticas de acuerdo con su accesibilidad y confianza
ACCESIBILIDAD
MTODOS DIRECTOS MTODOS INDIRECTOS
Aislamiento Deteccin del Deteccin Serologa Serologa

del virus genoma de NS1 IgM IgG
CONFIANZA
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4.2 CONSIDERACIONES EN LA SELECCIN DE LOS MTODOS DE

DIAGNSTICOS
4.2.1 Manejo clnico
La infeccin por el virus del dengue produce gran diversidad de sntomas, muchos
de los cuales no son especficos. Por lo tanto, no se puede confiar en un diagnstico
basado nicamente en los sntomas clnicos. La confirmacin temprana del diagnstico
clnico por el laboratorio puede ser valiosa, ya que algunos pacientes evolucionan
en poco tiempo, de la enfermedad leve a la grave y, algunas veces, a la muerte.
La intervencin temprana puede salvar la vida.
Antes del da 5 de la enfermedad, durante el perodo febril, las infecciones de

dengue se pueden diagnosticar mediante aislamiento del virus en el cultivo de
clulas, mediante deteccin de ARN viral por medio de pruebas de amplificacin
del cido nucleico (Nucleic Acid Amplification Test, NAAT) o mediante la deteccin
de antgenos virales por medio de la prueba ELISA o pruebas rpidas. El aislamiento
del virus en el cultivo celular generalmente slo se realiza en laboratorios con la
infraestructura y los conocimientos y experiencia tcnicos necesarios. Para el cultivo
del virus, es importante mantener muestras de sangre refrigeradas o congeladas con
el fin de preservar la viabilidad del virus durante el transporte desde el paciente
CAPTULO 4
hasta el laboratorio. El aislamiento y la identificacin de los virus del dengue en
los cultivos celulares generalmente toman varios das. Las pruebas para la deteccin
del cido nucleico con excelentes caractersticas de rendimiento pueden identificar
el ARN viral del dengue en un perodo de 24 a 48 horas. Sin embargo, estas
pruebas requieren equipos y reactivos costosos y, con el fin de evitar la contaminacin,
las pruebas deben cumplir con procedimientos de control de calidad y tienen que
ser practicadas por personal tcnico experimentado. Los kits para la deteccin del
antgeno NS1 que ahora se pueden obtener comercialmente, se pueden usar en
los laboratorios que cuentan con equipo limitado y arrojan resultados despus de
algunas horas. Las pruebas rpidas para la deteccin del antgeno del dengue se
pueden usar en la prctica de campo y proporcionan resultados en menos de una
hora. Actualmente, estas pruebas no son especficas para el tipo de virus, son
costosas y estn bajo evaluacin para la precisin del diagnstico y costo-efectividad
en mltiples circunstancias. La tabla 4.1 resume diferentes mtodos diagnsticos de
dengue y sus costos.
Tabla 4.1 Resumen de las caractersticas operativas y costos comparativos de los mtodos de diagnstico
de dengue (9)
Mtodos Diagnstico de Tiempo para Espcimen Tiempo de recoleccin Instalaciones Costo
diagnstico infecciones resultados despus de la apari-
agudas cin de los sntomas
Aislamiento viral e Confirmado 1-2 semanas Sangre total, 1-5 das Instalaciones para cultivos de mos- $$$
identificacin de suero, tejidos quito o clulas, laboratorio BSL-
a
serotipo 2/BSL-3 microscopio fluorescente
o equipo de biologa molecular
Deteccin de cido Confirmado 1 2 das Tejido, sangre 1-5 das Laboratorio BSL-2, equipo $$$
nucleico total, suero, para biologa molecular
plasma
Deteccin de Aun sin determinar 1 da Suero 1-6 das Facilidades para ELISA $$
antgenos Confirmado >1 da Tejido para NA Facilidades para histologa $$$
inmunoqumica
ELISA IgM Probable 1-2 das Suero, plasma, Despus de 5 das Facilidades para ELISA $
IgM prueba rpida 30 minutos sangre total Sin suministros adicionales
Facilidades para ELISA
IgG (suero pareado) Confirmado 7 das o ms Suero, plasma Sueros agudos Laboratorio BSL-2 para $
mediante prueba sangre total 1-5 das; convaleciente ensayo de neutralizacin
ELISA, IH o despus de 15 das
neutralizacin
a
Los requisitos pueden variar segn las polticas de cada pas. 95
Despus del da 5, los virus y antgenos del dengue desaparecen de la sangre, lo

que coincide con la aparicin de anticuerpos especficos. En algunos pacientes se
puede detectar el antgeno NS1 por algunos das despus de la disminucin de
la fiebre. Las pruebas serolgicas del dengue tienen mayor disponibilidad en pases
con dengue endmico que las pruebas virolgicas. El transporte del espcimen no
es un problema ya que las inmunoglobulinas son estables en temperatura ambiente
tropical.
El tiempo de la recoleccin del espcimen es ms flexible para la serologa que

para el aislamiento del virus o la deteccin de ARN, ya que la respuesta de un
anticuerpo se puede medir comparando una muestra obtenida durante la etapa
aguda de la enfermedad con las muestras recogidas semanas o meses despus.
En algunas infecciones, los bajos niveles de una respuesta al dengue de IgM
detectable -o su ausencia reduce la exactitud del diagnstico de las pruebas ELISA
IgM. Los resultados de las pruebas rpidas pueden estar disponibles en menos de
una hora. Sin embargo, debido a que el rendimiento de todas las pruebas comerciales
aun no ha sido evaluado por los laboratorios de referencia (10), la confianza en
las pruebas rpidas para diagnosticar infecciones de dengue debe ser considerada
con precaucin.
Un aumento de 4 veces o ms en los niveles de los anticuerpos medidos mediante

ELISA IgG o mediante la prueba de inhibicin de hemaglutinacin en sueros
apareados, indica una infeccin reciente con flavivirus. Sin embargo, no es muy
til para el diagnstico ni el manejo clnico esperar para recolectar suero en la
etapa de convalecencia cuando el paciente es dado de alta, y slo proporciona
un resultado retrospectivo.
4.2.1.1 Diagnstico diferencial
La fiebre del dengue puede confundirse fcilmente con enfermedades no relacionadas

con el dengue, especialmente en situaciones no epidmicas. Segn el origen
geogrfico del paciente, se deben descartar otras causas, incluyendo infecciones
por flavivirus no relacionadas con el dengue. stas incluyen fiebre amarilla, encefalitis
japonesa, encefalitis de Saint Louis, Zika y Nilo Occidental, alfavirus (tales como
Sinbis y Chikungunya), y otras causas de fiebre tales como malaria, leptospirosis,
fiebre tifoidea, enfermedades por rickettsias (Rickettsia prowazeki, R. mooseri, R.
conori, R. rickettsi, Orientia tsutsugamushi, Coxiella burneti, etc.), sarampin,
enterovirus, influenza y enfermedades con sntomas similares a la influenza y fiebres
hemorrgicas (Arenaviridae: Junin, etc.; Filoviridae: Marburg, Ebola; Bunyaviridae:
hantavirus, fiebre hemorrgica de Crimea-Congo, etc.).
Para el diagnstico del dengue se prefiere la tcnica de identificacin del virus/ARN

viral/antgeno viral y la deteccin de una respuesta de anticuerpos en vez de una
sola de estas tcnicas (ver tabla 4.2).
Tabla 4.2 Interpretacin de las pruebas de diagnstico del dengue [adaptadas del estudio de
Dengue y Control (DENCO)]
Muy sugestivo Confirmado
Uno de los siguientes: Uno de los siguientes:

1. IgM positiva en una sola 1. PCR positiva
muestra de suero 2. Cultivo del virus positivo
2. IgG positiva en una sola 3. Seroconversin IgM en sueros pareados
muestra de suero con un ttulo 4. Seroconversin IgG en sueros pareados o aumento
IH de 1.280 o ms cuadriplicado del ttulo IgG en sueros pareados
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Infortunadamente, an no est disponible una prueba diagnstica ideal que permita

el diagnstico rpido y temprano, sea accesible para los diferentes sistemas de
salud, sea fcil de realizar y tenga un slido rendimiento.
4.2.2 Investigaciones de brotes
Durante los brotes, se ha visto que algunos pacientes presentan fiebre con erupcin
o sin ella durante la etapa aguda de la enfermedad; algunos otros pueden presentar
extravasacin de plasma o choque, y otros presentan signos de hemorragias, en
tanto que otros pueden ser observados durante la fase de convalecencia.
Una de las prioridades en un brote sospechoso es identificar el agente causal, de

manera que se puedan tomar las medidas de salud pblica apropiadas y se pueda
motivar a los mdicos para que inicien el manejo apropiado de la enfermedad
aguda. En dichos casos, la rapidez y especificidad de las pruebas diagnsticas
son ms importantes que la sensibilidad de la prueba. Las muestras que se obtienen
de pacientes febriles podran analizarse mediante mtodos de cido nucleico en
un laboratorio bien equipado o un grupo ms amplio de laboratorios, usando un
kit de deteccin del antgeno del dengue basado en ELISA. Si las muestras se
recolectan despus del quinto da de la enfermedad, la prueba ELISA IgM comercial
CAPTULO 4
o pruebas rpidas sensibles para IgM del dengue pueden sugerir un brote de
dengue, pero los resultados se confirman preferiblemente con pruebas serolgicas
confiables realizadas en un laboratorio de referencia con amplia capacidad
diagnstica para arbovirus. Se pueden usar las pruebas serolgicas para determinar
la extensin de los brotes.
4.2.3 Vigilancia
Los sistemas de vigilancia del dengue tienen la finalidad de detectar la circulacin

de virus especficos en las poblaciones humanas o de mosquitos. Las herramientas
de diagnstico utilizadas deben ser sensibles, especficas y accesibles para el pas.
Como se describi anteriormente, generalmente los laboratorios responsables de
la vigilancia son laboratorios nacionales o de referencia capaces de practicar
pruebas diagnsticas para el dengue y para una amplia gama de otras causas.
4.2.4 Pruebas con vacunas
Las pruebas con vacunas se realizan con el fin de medir la seguridad y eficacia
de la vacuna en personas vacunadas. La prueba de neutralizacin por reduccin
de placas (Plaque Reduction Neutralization Test, PRNT) y las pruebas de
microneutralizacin se usan comnmente para medir correlaciones de proteccin.
Despus de las infecciones primarias en personas inmunes para virus diferentes a

los flavivirus, los anticuerpos neutralizadores medidos con PRNT pueden ser
relativamente o completamente especficos para el tipo de virus (11,12). Esta prueba
es el medio ms confiable para medir el ttulo de los anticuerpos neutralizadores
en el suero de un individuo infectado, como una medida del nivel de proteccin
contra un virus infeccioso. La prueba se basa en el principio de que los anticuerpos
neutralizadores inactivan el virus para que pierda su capacidad de infectar y
reproducirse en determinadas celulas.
Despus de una segunda infeccin por el virus del dengue, se producen ttulos
elevados de anticuerpos neutralizadores contra, por lo menos, dos y, a menudo, 97
los cuatro virus del dengue, as como tambin contra flavivirus no relacionados con
el dengue. Esta reaccin cruzada resulta de las clulas B de memoria, las cuales
producen anticuerpos dirigidos a eptopos viriones compartidos por los virus del
dengue. Durante la etapa de convalecencia temprana despus de las infecciones
secuenciales del dengue, el ttulo ms elevado del anticuerpo neutralizador a menudo
est dirigido contra el primer virus infeccioso y no contra el ms reciente. Este
fenmeno se conoce como pecado antignico original" (13).
La desventaja de la PRNT es que su prctica es laboriosa. Una serie de laboratorios

desarrollaron recientemente pruebas de neutralizacin de alto rendimiento que se
pueden usar a gran escala en estudios de vigilancia y pruebas con vacunas. Se
han observado resultados variables en las PRNT practicadas en diferentes laboratorios.
Las variaciones se pueden minimizar si las pruebas se hacen en lneas estndar de
clulas usando las mismas cepas del virus y la misma temperatura y tiempo para
la incubacin del virus con el anticuerpo. El ingreso del virus se debe calcular
detenidamente para evitar la superposicin de placas. Las lneas de clulas de
origen mamfero, tales como las clulas VERO, se recomiendan para la produccin
de virus semilla para ser usados en la PRNT.
La prueba de microneutralizacin se basa en el mismo principio que la PRNT. Existen

mtodos variables. En uno de ellos, en lugar de contar el nmero de placas por
pozo, el antgeno viral se tie usando un anticuerpo etiquetado y la cantidad de
antgeno se mide mediante colorimetra. La prueba puede medir el cido nucleico
usando la PCR. La prueba de microneutralizacin fue diseada para usar cantidades
ms pequeas de reactivos y para analizar mayores cantidades de muestras. En
las pruebas de deteccin del antgeno viral, la propagacin del virus a lo largo de
las clulas no est limitada debido a que en las PRNT que usan capas semislidas,
se debe estandarizar el tiempo despus de la infeccin para evitar que el crecimiento
se mida despus de muchos ciclos de replicacin. Como no todos los virus crecen
a la misma velocidad, los perodos de incubacin son especficos de cada virus.
Al igual que con las PRNT, los anticuerpos medidos por micromtodos en individuos
con infecciones secundarias pueden reaccionar ampliamente con los cuatro virus
del dengue.
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Tabla 4.3 Ventajas y limitaciones de los mtodos de diagnstico del dengue (9)
Indicaciones Pruebas Diagnsticas Ventajas Limitaciones
Diagnstico de Deteccin de cido La ms sensible y especfica Posibles falsos positivos debido

infeccin aguda nucleico Es posible identificar el serotipo a la contaminacin
de dengue Aparicin temprana (pre- Costoso
anticuerpo), con oportunidad Requiere experiencia y el equipo
de impactar en el manejo del de laboratorio es costoso
paciente No es posible diferenciar entre
la infeccin primaria y la
secundaria
Aislamiento en cultivo de Especfico Requiere experiencia e

clulas e identificacin Es posible identificar el serotipo instalaciones para el cultivo de
usando usando anticuerpos especficos la clula y microscopa
inmunofluorescencia fluorescente
Toma ms de 1 semana
No es posible diferenciar entre
la infeccin primaria y la
secundaria
Deteccin de antgenos Fcil de realizar No es tan sensible como el

en muestras clnicas La oportunidad para el aislamiento del virus o la
diagnstico temprano puede deteccin de ARN
impactar en el tratamiento del
paciente
Pruebas serolgicas: til para la confirmacin de Puede pasar por alto los casos
Pruebas IgM la infeccin aguda porque los niveles de IgM en
CAPTULO 4
Seroconversin: aumento El menos costoso algunas infecciones secundarias
de cuatro veces en los Fcil de realizar pueden estar bajos o no ser
ttulos IgG por IH o ELISA Puede distinguir entre infeccin detectados
entre las muestras de la primaria y secundaria Necesidad de dos muestras
fase aguda y la de Retraso en la confirmacin del
convalecencia diagnstico
Vigilancia e Deteccin de IgM Identificar casos probables de Puede pasar por alto los casos
identificacin de dengue porque los niveles de IgM
brotes; Fcil de realizar para la pueden estar bajos en las
deteccin de casos en infecciones secundarias
laboratorios centinela
Vigilancia de la Solo pueden practicarse en
efectividad de Aislamiento viral y Confirmar casos laboratorios de referencia
las intervenciones deteccin de ARN Identificar serotipos Necesita muestras de la fase aguda
En los ensayos de medicamentos, los pacientes deben tener un diagnstico etiolgico

confirmado (vease la tabla 4.2 para obtener informacin sobre el diagnstico muy
sugestivo y el diagnstico confirmado).
La tabla 4.3 resume las ventajas y limitaciones de cada uno de los mtodos
diagnsticos para cada propsito.
4.3 MTODOS ACTUALES PARA EL DIAGNSTICO DEL DENGUE
4.3.1 Aislamiento del virus
Las muestras para el aislamiento del virus se deben obtener al principio del curso
de la infeccin, durante el perodo de la viremia (generalmente, antes del da 5).
El virus se puede recuperar del suero, el plasma y las clulas mononucleares de
sangre perifrica, y se puede intentar recuperarlo de los tejidos tomados en la
autopsia (por ejemplo, hgado, pulmn, gnglios linfticos, mdula sea). Debido
a que el virus del dengue es lbil al calor, las muestras que se van a transportar
al laboratorio se deben mantener en un refrigerador o deben empacarse en hielo
hmedo. Si las muestras se van a almacenar hasta 99
por 24 horas, se deben conservar entre +4 C y +8 C. Para tiempos de

almacenamiento ms prolongados, se deben congelar a -70 C en un congelador
hondo o almacenarse en un recipiente de nitrgeno lquido. No se recomienda el
almacenamiento a 20 C, ni por perodos cortos
El cultivo celular es el mtodo ms utilizado para el aislamiento del virus del dengue.
La lnea celular del mosquito C6/36 (clonada de Ae. albopictus) AP61 (lnea celular
de Ae. pseudoscutellaris) son las clulas husped preferidas para el aislamiento de
rutina del virus del dengue. Debido a que no todos los virus del dengue de tipo
silvestre inducen un efecto citoptico en las lneas celulares, se tienen que examinar
los cultivos de las clulas para saber si hay prueba especfica de la infeccin. Este
examen se realiza mediante una prueba de inmunofluorescencia para la deteccin
del antgeno, usando anticuerpos monoclonales especficos para el serotipo y
anticuerpos reactivos al grupo de los flavivirus o anticuerpos monoclonales reactivos
al complejo de dengue. Tambin, se pueden usar varios cultivos celulares de mamferos,
tales como VERO, LLCMK2 y BHK21, pero son menos eficientes. El aislamiento del
virus seguido de una prueba de inmunofluorescencia para confirmacin, generalmente
requiere 1 a 2 semanas y slo es posible si la muestra se transporta y almacena
correctamente para preservar la viabilidad del virus.
Cuando no se dispone de otros mtodos, las muestras clnicas tambin se pueden

inocular a travs de la ruta intracraneal en ratones lactantes o por la inoculacin
intratorcica de mosquitos. Los animales recin nacidos pueden desarrollar sntomas
de encefalitis, pero es posible que con algunas cepas del dengue los ratones no
presenten signos de enfermedad. El antgeno del virus se detecta en el cerebro del
ratn o en macerados de cabezas de mosquitos, mediante tincin con los anticuerpos
anti-dengue.
4.3.2 Deteccin de cido nucleico
El ARN es lbil al calor y, por lo tanto, las muestras para la deteccin del cido
nucleico tienen que manipularse y almacenarse de acuerdo con los procedimientos
descritos para el aislamiento del virus.
4.3.2.1 RT-PCR
Desde la dcada de los 90, se han desarrollado varias pruebas de reaccin en

cadena de la transcriptasa-polimerasa inversa (Reverse Transcription-Polymerase
Chain Reaction, RT-PCR). Estas ofrecen mayor sensibilidad en comparacin con el
aislamiento viral, en un tiempo mucho ms rpido. La RT-PCR in situ ofrece la
capacidad de detectar el ARN del dengue en tejidos embebidos en parafina.
Todas las pruebas para la deteccin de cido nucleico comprenden tres pasos
bsicos: extraccin y purificacin del cido nucleico, amplificacin del cido
nucleico, y deteccin y caracterizacin del producto amplificado. La extraccin y
purificacin del ARN viral de la muestra se pueden realizar mediante mtodos
tradicionales de separacin de fases lquidas (por ejemplo, fenol, cloroformo), pero
se han ido reemplazado gradualmente con los kits comerciales basados en slice
(abalorios o columnas), que son ms reproducibles y rpidos, especialmente porque
se pueden automatizar usando sistemas robticos. Muchos laboratorios utilizan una
100 prueba de RT-PCR anidada, usando cebadores universales para el dengue
dirigidos a la regin C/prM del genoma como un paso inicial de la transcripcin

inversa y amplificacin, seguido de una amplificacin de PCR anidada que es
especfico para el serotipo (14). La combinacin de los cuatro cebadores especficos
para los oligonucletidos del serotipo en un solo tubo de reaccin (RT-PCR multiplex
de un solo paso) es una interesante alternativa para RT-PCR anidada (15). Los
productos de estas reacciones se separan mediante electroforesis en un gel de
agarosa, y los productos de la amplificacin se visualizan como bandas de diferentes
pesos moleculares en el gel de agarosa usando colorante de bromuro de etidio, y
haciendo comparaciones con los marcadores de peso molecular estndar. En este
diseo, los serotipos del dengue se identifican por el tamao de sus bandas.
En comparacin con el aislamiento del virus, la sensibilidad de los mtodos RT-PCR

vara de 80% a 100% y depende de la regin del genoma seleccionado por los
cebadores, el mtodo usado para amplificar o detectar los productos PCR (por
ejemplo RT-PCR de un paso comparado con RT-PCR de dos pasos) y el mtodo
empleado para los subtipos (por ejemplo, PCR anidado, hibridacin de mancha
con sondas de ADN especficas al sitio de restriccin, anlisis de secuencia, etc.).
Para evitar resultados falsos positivos debido a una amplificacin inespecfica, es
importante identificar las regiones del genoma que son especficas para dengue y
no las que se conservan en los flavivirus y otros virus relacionados. Los resultados
falsos positivos tambin pueden ocurrir como consecuencia de la contaminacin
CAPTULO 4
por amplicones de amplificaciones previas. Esto se puede evitar mediante la
separacin fsica de los diferentes pasos del procedimiento y el seguimiento de los
estrictos protocolos para la descontaminacin.
4.3.2.2 RT-PCR en tiempo real
La prueba de RT-PCR en tiempo real es un sistema de ensayo de un solo paso que

se utiliza para cuantificar el ARN viral y que emplea pares de cebadores y sondas
que son especficos para cada uno de los serotipos del dengue. El uso de una
sonda fluorescente permite la deteccin de los productos de la reaccin en tiempo
real, en una mquina de PCR especializada, sin necesidad de electroforesis. Muchos
ensayos RT-PCR en tiempo real se han desarrollado empleando tecnologas TaqMan
o SYBR Green. La PCR en tiempo real de TaqMan es muy especfica debido a la
hibridacin de secuencia especfica de la sonda. No obstante, es posible que los
cebadores y sondas reportados en las publicaciones no sean capaces de detectar
todas las cepas del virus del dengue: la sensibilidad de los cebadores y de las
sondas depende de su homologa con la secuencia del gen seleccionado del virus
especfico analizado. La RT-PCR en tiempo real de SYBR Green tiene la ventaja de
la simplicidad en el diseo del cebador y utiliza protocolos RT-PCR universales, pero
es tericamente menos especfica.
La RT-PCR en tiempo real puede ser singleplex", es decir, solo detectan un serotipo
a la vez, o multiplex, es decir, son capaces de identificar los cuatro serotipos en
una sola muestra. Los ensayos multiplex tienen la ventaja de que una sola reaccin
puede determinar los cuatro serotipos sin la posibilidad de introducir contaminacin
durante la manipulacin de la muestra. Sin embargo, aunque los ensayos multiplex
de RT-PCR en tiempo real son ms rpidos, actualmente son menos sensibles que
los ensayos de RT-PCR anidado. Una ventaja de este mtodo es la capacidad de
determinar el ttulo viral en una muestra clnica, la cual se puede usar para estudiar
la patogenia de la enfermedad del dengue (16).
101
4.3.2.3 Mtodos de amplificacin isotrmica
La prueba de NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) (amplificacin

basada en la secuencia del cido nucleico) es un ensayo de amplificacin isotrmica
especfica del ARN que no requiere instrumentacin de ciclos trmicos. La etapa
inicial es una transcripcin inversa en la cual el objetivo de ARN de una sola cadena
es copiado a una molcula de ADN doble cadena que sirve como una plantilla
para la transcripcin del ARN. La deteccin del ARN amplificado se logra mediante
electroqumioluminiscencia o, en tiempo real, con sondas moleculares fluorescentes.
La NASBA se ha adaptado a la deteccin del virus del dengue con una sensibilidad
cercana a la del aislamiento del virus en cultivos celulares y puede ser un mtodo
til para estudiar las infecciones del dengue en estudios de campo (17).
Tambin se han descrito mtodos de amplificacin mediados por asas, pero no se

conoce su rendimiento en comparacin con otros mtodos de amplificacin de
cido nucleico (18).
4.3.3 Deteccin de antgenos
La deteccin de antgenos del dengue en el suero de la fase aguda era hasta hace
poco inusual en casos de infecciones secundarias, debido a que dichos pacientes
tenan complejos inmunitarios preexistentes de anticuerpos IgG del virus. Nuevos
avances en ELISA y tcnicas de hibridacin en punto mancha dirigidos al antgeno
de la envoltura y membrana y la protena 1 no estructural (NS1), demostraron que
se pueden detectar altas concentraciones de estos antgenos en forma de complejos
inmunitarios tanto en casos de infeccin primaria como en secundaria, hasta nueve
das despus de la aparicin de la enfermedad.
La glucoprotena NS1 es producida por todos los flavivirus y secretada por las
clulas de mamferos. La NS1 produce una respuesta humoral muy fuerte. Muchos
estudios han estado dirigidos a detectar la NS1 para hacer un diagnstico temprano
de infeccin por el virus del dengue. Los kits comerciales para la deteccin del
antgeno NS1 ya se encuentran disponibles, aunque no distinguen entre los serotipos
del dengue. Su rendimiento y utilidad estn siendo actualmente evaluados por
diferentes laboratorios a escala mundial, incluyendo la red de laboratorios de
WHO/TDR/PDVI.
Los ensayos de anticuerpos fluorescentes, inmounoperoxidasa y de la enzima avidina-

biotina, permiten la deteccin del antgeno del virus del dengue en leucocitos fijados
en acetona y en tejidos de autopsia sometidos a congelacin rpida o fijados en
formalina.
4.3.4 Pruebas serolgicas
4.3.4.1 MAC-ELISA
Para la captura de anticuerpos IgM por MAC-ELISA, la IgM total en los sueros de
los pacientes se captura mediante anticuerpos especficos para la cadena anti-
(especficos para IgM humana) revestidos en un microplato. Los antgenos especficos
del dengue, de uno a cuatro serotipos (DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4), estn
ligados a los anticuerpos IgM anti-dengue capturados y son detectados mediante
102 anticuerpos monoclonales o policlonales del dengue, directa o indirectamente
conjugados con una enzima que transforma un substrato sin color en productos con
color. La densidad ptica se mide mediante espectrofotmetro.
El suero, la sangre en papel de filtro y la saliva, pero no la orina, se pueden usar

para la deteccin de IgM si las muestras se toman dentro de un perodo apropiado
(cinco das o ms despus de la aparicin de la fiebre). Las muestras de suero se
pueden analizar en una dilucin individual o en mltiples diluciones. La mayora
de los antgenos usados para esta prueba se derivan de la protena de envoltura,
usualmente, sobrenadantes de cultivos celulares infectados con el virus o preparaciones
del cerebro de ratones lactantes. La prueba MAC-ELISA tiene buena sensibilidad y
especificidad pero slo cuando se usa cinco das o ms despus de la aparicin
de la fiebre. Hay diferentes kits comerciales disponibles (ELISA o pruebas rpidas),
pero tienen sensibilidad y especificidad variables. Una red de laboratorios de
WHO/TDR/PDVI evalu recientemente las pruebas ELISA comerciales y las pruebas
diagnsticas rpidas de primera generacin, y encontraron que la prueba ELISA
generalmente tiene un mejor rendimiento que las pruebas rpidas.
La reaccin cruzada con otros flavivirus circulantes, tales como encefalitis japonesa,
encefalitis de Saint Louis y fiebre amarilla, no parece ser un problema, pero se
obtuvieron algunos falsos positivos en los sueros de pacientes con malaria, leptospirosis
CAPTULO 4
e infeccin previa de dengue (10). Se deben tener en cuenta estas limitaciones cuando
se usen pruebas en regiones donde estos patgenos circulan concomitantemente. Se
recomienda que las pruebas sean evaluadas contra un panel de sueros de enfermedades
relevantes en una regin en particular, antes de ser distribuidas al mercado. No es
posible usar pruebas de IgM para identificar los serotipos del dengue, ya que estos
anticuerpos presentan amplia reaccin cruzada, incluso despus de infecciones
primarias. Recientemente, algunos autores han descrito un MAC-ELISA (figura 4.3)
que podra permitir la determinacin de serotipos, pero se requieren mayores
evaluaciones (19).
Figura 4.3 Principio de una prueba MAC-ELISA
Espectrofotmetro
Sustrato sin Sustrato con Anti-dengue

color color Ab conjugado
con enzima
IgM especfico no antgeno

relacionado con el DEN
dengue
IgM del
paciente
Cadena
Anti-
Microplato
103
4.3.4.2 ELISA IgG
La prueba ELISA IgG se usa para la deteccin de infecciones por dengue recientes
o pasadas (si se recolectan sueros pareados dentro del perodo correcto). Esta
prueba usa los mismos antgenos que la prueba MAC-ELISA. El uso de ELISA para
la captura de IgG (GAC) especfico para envoltura y membrana permite la deteccin
de anticuerpos IgG durante un perodo de 10 meses despus de la infeccin. De
acuerdo con la medicin de ELISA IgG indirecto revestido de antgenos de envoltura
y membrana, los anticuerpos IgG duran toda la vida, pero se pueden usar anticuerpos
IgG con un aumento cuadriplicado o mayor en los anticuerpos IgG en sueros
pareados de fase aguda y de convalecencia para documentar infecciones recientes.
Los resultados de la prueba se correlacionan bien con la prueba de inhibicin de
la hemaglutinacin. Tambin se utiliza un mtodo de inhibicin de ELISA (EIM) para
detectar anticuerpos IgG del dengue (20) para el diagnstico serolgico y la
vigilancia de los casos de dengue. Este sistema se basa en la competencia por los
sitios de antgeno por parte de los anticuerpos IgG del dengue en la muestra y en
el conjugado humano IgG anti-dengue.
Este mtodo se puede usar para detectar anticuerpos IgG en suero o plasma y
muestras de sangre almacenadas en papel de filtro, y permite la identificacin de
un caso como infeccin primaria o secundaria por dengue (20-22). En general, la
ELISA IgG carece de especificidad dentro de los grupos del serocomplejo de los
flavivirus. Despus de las infecciones virales, los anticuerpos recientemente producidos
son menos vidos que los anticuerpos producidos meses o aos despus de la
infeccin.
La avidez de los anticuerpos se usa en algunos laboratorios para distinguir entre

las infecciones primarias y las secundarias del dengue. Dichas pruebas no se usan
extensamente y no estn disponbles comercialmente.
4.3.4.3 Relacin IgM/IgG
Se puede usar una relacin entre IgM/IgG especfica para la protena E/M del
virus del dengue para distinguir las infecciones primarias de las secundarias. Las
pruebas ELISA de captura de IgM y de IgG son las ms comunes para este propsito.
En algunos laboratorios, la infeccin por dengue se define como primaria si la
relacin de IgM/IgG es mayor de 1,2 (usando sueros del paciente a una dilucin
de 1/100) o de 1,4 (usando sueros del paciente a diluciones de 1/20). La
infeccin es secundaria si la relacin es menor de 1,2 o 1,4. Este algoritmo tambin
ha sido adoptado por algunos proveedores comerciales. Sin embargo, las proporciones
pueden variar de un laboratorio a otro, lo que indica la necesidad de una mejor
estandarizacin en el rendimiento de la prueba (8).
4.3.4.4 IgA
La deteccin positiva para IgA anti-dengue en suero de acuerdo con la medicin

con ELISA de captura de IgA del virus anti-dengue (AAC-ELISA), a menudo se presenta
un da despus que la de IgM. El ttulo de IgA alcanza el pico cerca del da 8
despus de la aparicin de la fiebre y declina rpidamente hasta el da 40, cuando
deja de ser detectable. Los autores no encontraron diferencias en los ttulos de IgA
de los pacientes con infeccin primaria o secundaria. Aun cuando los valores de
IgA generalmente son ms bajos que los de IgM, tanto en suero
104
como en saliva, los dos mtodos se pueden realizar juntos para ayudar a interpretar
la serologa del dengue (22, 23). Este mtodo no se usa con mucha frecuencia y
requiere evaluacin adicional.
4.3.4.5 Prueba de inhibicin de la hemaglutinacin
La prueba de inhibicin de la hemaglutinacin (figura 4.4) se basa en la capacidad

de los antgenos del dengue de aglutinar eritrocitos de gansos o eritrocitos humanos
tipo O con tripsina. Los anticuerpos anti-dengue en suero pueden inhibir esta
aglutinacin y la prueba de inhibicin de la hemaglutinacin mide la potencia de
esta inhibicin. Las muestras de suero son tratadas con acetona o caoln para
remover inhibidores no especficos de hemaglutinacin, y luego son absorbidas con
eritrocitos de gansos o humanos tipo O con tripsina para eliminar aglutininas
inespecficas. Se optimiza cada lote de antgenos y eritrocitos. El pH ptimo de
cada hemaglutinina de dengue requiere el uso de mltiples y diferentes reguladores
de pH para cada serotipo. Para ser ptima, la prueba de inhibicin de la
hemaglutinacin requiere sueros pareados obtenidos al momento de la hospitalizacin
(agudo) y al ser dados de alta (convaleciente) o sueros pareados con un intervalo
de ms de siete das. La prueba no distingue entre infecciones causadas por flavivirus
ntimamente relacionados (por ejemplo entre el virus del dengue y el virus de la
CAPTULO 4
encefalitis japonesa o el del Nilo Occidental), ni entre isotipos de inmunoglobulina.
La respuesta a una infeccin primaria se carteriza por el bajo nivel de anticuerpos
en el suero de la fase aguda extrados antes del quinto da y, de all en adelante,
una elevacin lenta de los ttulos de anticuerpos IH. Durante las infecciones
secundarias por dengue, los ttulos de anticuerpos IH se elevan rpidamente,
excediendo generalmente de 1:1.280. Los valores inferiores, generalmente, se
observan en el suero de pacientes convalecientes con respuestas primarias.
Figura 4.4 Prueba de Inhibicin de hemaglutinacin
Inhibicin de
Hemaglutinacin hemaglutinacin
= resultado negativo = resultado positivo
Eritrocitos
Antgenos del
virus del
dengue
Anticuerpos del virus
anti-dengue
4.3.5 Pruebas hematolgicas
El nmero de plaquetas y el hematocrito se miden frecuentemente durante las etapas

agudas de la infeccin por dengue. Estas mediciones se deben realizar con
precaucin utilizando reactivos, equipo y protocolos estandarizados. 105
En la fiebre del dengue se puede observar una cada por debajo de 100 000 por
L en el conteo de plaquetas, pero esta es una caracterstica constante en la fiebre
por dengue hemorrgico. Generalmente, se observa trombocitopenia en el perodo
entre el da 3 y el da 8 despus de la aparicin de la enfermedad.
La hemoconcentracin, calculada por un aumento del 20% o ms en el hematocrito

en comparacin con los valores de la fase de convalecencia, sugiere hipovolemia
debido a aumento de la permeabilidad vascular y extravasacin de plasma.
4.4 DESARROLLO FUTURO DE LAS PRUEBAS
Los inmunoensayos basados en microesferas se estn volviendo cada vez ms

populares como una prueba serolgica opcional para el diagnstico de laboratorio
de muchas enfermedades. Esta tecnologa est basada en el enlace covalente del
antgeno o anticuerpo para microesferas o abalorios. Los mtodos de deteccin
incluyen el uso de lser para provocar la fluorescencia de diversas longitudes de
onda. Esta tecnologa es atractiva ya que es ms rpida que la MAC-ELISA y tiene
el potencial de realizar pruebas serolgicas mltiples diseadas para identificar las
respuestas de los anticuerpos a diferentes virus. Los inmunoensayos basados en
microesferas tambin se pueden usar para detectar virus.
Los rpidos avances en la tecnologa de biosensores mediante el uso de espectrometra

de masa han conducido al desarrollo de poderosos sistemas que pueden proporcionar
una rpida distincin de los componentes biolgicos en mezclas complejas. Los
espectros de masa que se producen pueden considerarse una huella especfica o
perfil molecular de la bacteria o virus analizado. El sistema de software incorporado
al instrumento identifca y cuantifca el patgeno en una muestra determinada,
comparando los espectros de masa resultantes con los de la base de datos de
agentes infecciosos y permite, as, la rpida identificacin de muchos miles de tipos
de bacterias y virus. Adems, estas herramientas pueden reconocer un organismo
previamente no identificado en la muestra y describir cmo est relacionado con
aquellos previamente encontrados. Esto pudiera ser til no solo para determinar los
serotipos del dengue, sino, tambin los genotipos del dengue durante un brote. Los
kits para identificacin de agentes infecciosos estn disponibles en formato de 96
pozos y pueden estar diseados para cumplir con requisitos especficos. Las muestras
son procesadas para la extraccin del ADN, amplificacin PCR, espectrometra de
masa y anlisis digital.
La tecnologa microarray hace posible analizar en paralelo una muestra, comprobando

la existencia de muchos fragmentos diferentes de cido nucleico que corresponden
a diferentes virus. El material gentico se tiene que amplificar antes de la hibridacin
con el microarray y la estrategia de amplificacin puede estar dirigida a secuencias
conservadas, as como tambin a secuencias aleatorias. Los oligonucletidos cortos
adjuntos en la corrida del microarray permiten una identificacin de secuencia
relativamente exacta, en tanto que los fragmentos ms largos de ADN proporcionan
una mayor tolerancia para apareamientos equivocados y, por lo tanto, una mejor
capacidad para detectar cepas divergentes. Un escner basado en lser se utiliza
comnmente como un lector para detectar los fragmentos amplificados etiquetados
con tintes fluorescentes. La tecnologa microarray podra ser til para analizar, al
mismo tiempo, el virus del dengue y otros arbovirus que circulan en la regin y todos
106 los patgenos responsables de sntomas similares al dengue.
Se han analizado otros mtodos, pero todava estn en las primeras etapas de
desarrollo y evaluacin. Por ejemplo, las tcnicas basadas en luminiscencia se estn
volviendo cada vez ms populares, debido a su alta sensibilidad, amplio rango
dinmico e instrumentacin relativamente econmica.
4.5 CONTROL DE CALIDAD
Muchos laboratorios usan pruebas preparadas por ellos mismos. Su debilidad

principal es la falta de estandarizacin de los protocolos, de modo que los resultados
no se pueden comparar ni analizar en conjunto. Es importante que los centros
nacionales o de referencia organicen programas de garanta de calidad para que
el personal de laboratorio tenga la capacidad de realizar pruebas y producir
materiales de referencia para el control de calidad de los kits de prueba y ensayos.
Para las pruebas de amplificacin de cidos nucleicos, es necesario tomar

precauciones para evitar la contaminacin de los materiales del paciente. Para
garantizar un alto nivel de confianza, se necesita que se analicen los controles y
las capacidades (24).
CAPTULO 4
4.6 ASUNTOS DE BIOSEGURIDAD
La recoleccin y procesamiento de sangre y otras muestras colocan al personal de

atencin en salud en riesgo de exposicin a materiales potencialmente infecciosos.
Para minimizar el riesgo de infeccin, se deben poner en prctica las tcnicas
seguras de laboratorio, es decir, uso de equipo de proteccin personal, recipientes
apropiados para la recoleccin y transporte de muestras, etc., segn se describe
en el Manual de la OMS sobre bioseguridad de laboratorio (25).
4.7 ORGANIZACIN DE LOS SERVICIOS DE LABORATORIO
En un pas con enfermedades endmicas, es importante organizar los servicios de

laboratorio en el contexto de las necesidades del paciente, y estrategias para el
control de enfermedades. Se deben asignar los recursos apropiados y proporcionar
la capacitacin. En la tabla 4.4 se propone un modelo. En la tabla 4.5 se pueden
encontrar ejemplos de buenas y malas prcticas.
107
Tabla 4.4 Modelo propuesto para la organizacin de los servicios de laboratorio

Pruebas para el diagnstico de Centros de atencin Centros Centro de referencia
dengue primaria distritales
- Cultivo de virus +
- Deteccin de cido nucleico +
- Deteccin de antgenos: + +
ELISA + +
Pruebas rpidas + + +
- Serologa
ELISA + +
Pruebas rpidas + + +
Funciones
- Capacitacin y supervisin + +
- Garanta de calidad + + +
- Actividades de vigilancia + +
- Investigaciones de los brotes +
- Referencia de muestras + + +
problemticas
- Investigacin de muestras +
problemticas
Tabla 4.5 Diagnstico de dengue por laboratorio: ejemplos de buenas y malas prcticas
Buenas prcticas Malas prcticas
1. Cundo usar una prueba Considerar el propsito de las Usar pruebas inapropiadas lleva a mala
pruebas antes de hacer una interpretacin de los resultados
seleccin (por ejemplo, para
investigaciones de brotes
comparado con diagnstico
clnico)
2. Cmo usar una prueba Seguir estrictamente las No seguir las recomendaciones del fabricante
recomendaciones del fabricante No seguir los procedimientos escritos del
o los procedimientos operativos laboratorio para cada prueba o modificar los
estndarizados actualizados procedimientos sin validacin previa
con buenas prcticas de
laboratorio
Los resultados no son confiables ni exactos
3. Asuntos de laboratorio Sistema de manejo de calidad porque no se usa ningn control de calidad
establecido en el laboratorio en el ensayo o el personal no est capacitado
o el equipo no est calibrado
Los registros no se mantienen adecuadamente
Uso de kits de pruebas no validados
Mezclar reactivos de diferentes kits de pruebas

o lotes de pruebas
Resultados falsos positivos debido a

contaminacin
Las muestras de suero pareado Interpretacin excesiva y mala interpretacin

se deben analizar en el mismo de los resultados de las pruebas
ensayo para determinar si ha Las muestras de la fase aguda no se vuelven
cuadriplicado el aumento del a analizar en conjunto con las muestras de
ttulo la fase de convalecencia
108
4.8 REFERENCIAS
1. Vorndam V, Kuno G. Laboratory diagnosis of dengue virus infections. In: Gubler

DJ, Kuno G, eds. Dengue and dengue hemorrhagic fever. New York, CAB International,
1997, 313333.
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infections where dengue and Japanese encephalitis co-circulate. American Journal
of Tropical Medicine and Hygiene, 1989, 40:418427.
3. PAHO. Dengue and dengue hemorrhagic fever in the Americas: guidelines for
prevention and control. Washington, DC, Pan American Health Organization, 1994
(Scientific Publication No. 548).
4. WHO. Dengue haemorrhagic fever: diagnosis, treatment, prevention and control,

2nd ed. Geneva, World Health Organization, 1997.
5. Chanama S et al. Analysis of specific IgM responses in secondary dengue virus

infections: levels and positive rates in comparison with primary infections. Journal
of Clinical Virology, 2004, 31:185189.
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6. Kuno G, Gomez I, Gubler DJ. An ELISA procedure for the diagnosis of dengue
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7. Shu PY et al. Comparison of a capture immunoglobulin M (IgM) and IgG ELISA

and non-structural protein NS1 serotype-specific IgG ELISA for differentiation of
primary and secondary dengue virus infections. Clinical and Diagnostic Laboratory
Immunology,
2003, 10:622630.
8. Falconar AK, de Plata E, Romero-Vivas CM. Altered enzyme-linked immunosorbent

assay immunoglobulin M (IgM)/IgG optical density ratios can correctly classify all
primary or secondary dengue virus infections 1 day after the onset of symptoms,
when all of the viruses can be isolated. Clinical and Vaccine Immunology, 2006,
13:10441051.
9. Pelegrino JL. Summary of dengue diagnostic methods. World Health Organization,

Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases, 2006 (unpublished
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10. Hunsperger EA et al. Evaluation of commercially available antidengue virus

immunoglobulin M tests. Emerging Infectious Diseases (serial online), 2009, March
(date cited). Accessible at http://www.cdc.gov/EID/content/15/3/436.htm
11. Morens DM et al. Simplified plaque reduction neutralization assay for dengue
viruses by semimicro methods in BHK-21 cells: comparison of the BHK suspension
test with standard plaque reduction neutralization. Journal of Clinical Microbiology,
1985, 22(2):250254.
109

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Captulo 4: Diagnstico de Laboratorio y Pruebas Diagnsticas

CAPTULO 4. DIAGNSTICO DE LABORATORIO Y PRUEBAS

4.1 PANORAMA GENERAL

El diagnstico eficiente y preciso del dengue es de fundamental importancia para

Durante una infeccin secundaria de dengue (una infeccin por dengue en un

Se ha elaborado una serie de mtodos de diagnsticos de laboratorio para apoyar

Aislamiento del virus

IgG infeccin secundaria

Aparicin de los sntomas (das)

En general, las pruebas con gran sensibilidad y especificidad requieren

MTODOS DIRECTOS MTODOS INDIRECTOS

Aislamiento Deteccin del Deteccin Serologa Serologa

4.2 CONSIDERACIONES EN LA SELECCIN DE LOS MTODOS DE

4.2.1 Manejo clnico

Antes del da 5 de la enfermedad, durante el perodo febril, las infecciones de

Despus del da 5, los virus y antgenos del dengue desaparecen de la sangre, lo

El tiempo de la recoleccin del espcimen es ms flexible para la serologa que

Un aumento de 4 veces o ms en los niveles de los anticuerpos medidos mediante

4.2.1.1 Diagnstico diferencial

La fiebre del dengue puede confundirse fcilmente con enfermedades no relacionadas

Para el diagnstico del dengue se prefiere la tcnica de identificacin del virus/ARN

Muy sugestivo Confirmado

Uno de los siguientes: Uno de los siguientes:

Infortunadamente, an no est disponible una prueba diagnstica ideal que permita

4.2.2 Investigaciones de brotes

Una de las prioridades en un brote sospechoso es identificar el agente causal, de

Los sistemas de vigilancia del dengue tienen la finalidad de detectar la circulacin

4.2.4 Pruebas con vacunas

Despus de las infecciones primarias en personas inmunes para virus diferentes a

La desventaja de la PRNT es que su prctica es laboriosa. Una serie de laboratorios

La prueba de microneutralizacin se basa en el mismo principio que la PRNT. Existen

Diagnstico de Deteccin de cido La ms sensible y especfica Posibles falsos positivos debido

Aislamiento en cultivo de Especfico Requiere experiencia e

Deteccin de antgenos Fcil de realizar No es tan sensible como el

En los ensayos de medicamentos, los pacientes deben tener un diagnstico etiolgico

4.3 MTODOS ACTUALES PARA EL DIAGNSTICO DEL DENGUE

4.3.1 Aislamiento del virus

por 24 horas, se deben conservar entre +4 C y +8 C. Para tiempos de

Cuando no se dispone de otros mtodos, las muestras clnicas tambin se pueden

4.3.2 Deteccin de cido nucleico

Desde la dcada de los 90, se han desarrollado varias pruebas de reaccin en

dirigidos a la regin C/prM del genoma como un paso inicial de la transcripcin

En comparacin con el aislamiento del virus, la sensibilidad de los mtodos RT-PCR

4.3.2.2 RT-PCR en tiempo real

La prueba de RT-PCR en tiempo real es un sistema de ensayo de un solo paso que

4.3.2.3 Mtodos de amplificacin isotrmica

La prueba de NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) (amplificacin

Tambin se han descrito mtodos de amplificacin mediados por asas, pero no se

4.3.3 Deteccin de antgenos

Los ensayos de anticuerpos fluorescentes, inmounoperoxidasa y de la enzima avidina-

4.3.4 Pruebas serolgicas

El suero, la sangre en papel de filtro y la saliva, pero no la orina, se pueden usar

Figura 4.3 Principio de una prueba MAC-ELISA

Sustrato sin Sustrato con Anti-dengue

IgM especfico no antgeno

4.3.4.2 ELISA IgG

La avidez de los anticuerpos se usa en algunos laboratorios para distinguir entre

4.3.4.3 Relacin IgM/IgG

La deteccin positiva para IgA anti-dengue en suero de acuerdo con la medicin

4.3.4.5 Prueba de inhibicin de la hemaglutinacin

La prueba de inhibicin de la hemaglutinacin (figura 4.4) se basa en la capacidad

Figura 4.4 Prueba de Inhibicin de hemaglutinacin

4.3.5 Pruebas hematolgicas