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REF - ISSN 1808-0804 Vol.

V (2), 22 - 29, 2008

VALIDAO DE UM MTODO ANALTICO PARA ANLISE


SIMULTNEA DE ESTAVUDINA (D4T), LAMIVUDINA (3TC) E
ZIDOVUDINA (AZT) EM MATRIA-PRIMA

VALIDATION OF AN ANALYTICAL METHOD FOR DETERMINATION OF ESTAVUDINE


(D4T), LAMIVUDINE (3TC) AND ZIDOVUDINE (AZT) USING HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY (HPLC)

Felipe Casas Camilo1, Patrik Oening Rodrigues *1,2, Theodoro Marcel Wagner1
1
Departamento de Farmcia Universidade da Regio de Joinville (UNIVILLE), Campus Bom Retiro, CEP 88040-
900, Joinville Santa Catarina/Brasil. E-mail: patrikoening@gmail.com; fax: 55 47 3461 9091
2
Laboratrio de Controle de Qualidade, Departamento de Cincias Farmacuticas, Universidade Federal de Santa
Catarina (UFSC), Campus Trindade, Florianpolis SC, Brasil

* Autor para correspondncia: e-mail patrikoening@gmail.com

Recebido em 18/01/2008 - Aceito em 23/08/2008

RESUMO: A Estavudina (d4T), Lamivudina (3TC) e a Zidovudina (AZT) so inibidores nucleosdeos da


transcriptase reversa comumente utilizados na teraputica combinada anti-HIV. Esta combinao visa evitar a
seleo de cepas resistentes, mostrando-se mais eficaz na supresso da replicao viral. Atualmente no existe
metodologia farmacopica ou estudos que proponham a quantificao destes frmacos simultaneamente atravs
da Cromatografia Liquida de Alta Eficincia (CLAE). Dessa forma, o presente trabalho busca validar uma
metodologia cromatogrfica para a anlise simultnea de d4T, 3TC e AZT conforme as especificaes contidas na
RESOLUO N 899, de 29 de maio de 2003. Para tanto, os parmetros seletividade, linearidade, preciso, limite
de deteco (LOD), limite de quantificao (LOQ), exatido e robustez foram verificados para o mtodo proposto.
A anlise dos parmetros avaliados demonstrou que o mtodos foi adequado para a anlise dos antiretrovirais em
questo, apresentando os parmetros em consonncia com as especificaes da legislao vigente.

PALAVRAS-CHAVE: Estavudina, Lamivudina, Zidovudina, Matria-Prima, CLAE

ABSTRACT: The Estavudine (d4T), Lamivudine (3TC) and Zidovudine (AZT) are nucleoside reverse transcriptase
inhibitors commonly used in the antiretroviral therapy anti-HIV. This therapy consists in avoid the selection of
resistant stumps, demonstrating more efficient on suppression of viral reproduction. Don't have pharmacopeial
methodologies for simultaneous quantification of these drugs through High Performance Liquid Chromatography
(HPLC). In this way, the present study has as objective to validate an appropriate chromatography method to the
simultaneous analysis of d4T, 3TC, AZT of agreement to specification of the RESOLUTION 899, from 29th May
2003. For so much, the parameters selectivity, linearity, precision, detection limit, quantification limit, accuracy and
robustness were verified for the proposed method. The analysis of the appraised parameters demonstrated that the
method was appropriate for the analysis of the HIV drugs, presenting the parameters in agreement with the
specifications of the legislation.

KEY WORDS: Estavudine, , Lamivudine, Zidovudine, Material Raw and HPLC

INTRODUO
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A CLAE tornou-se um mtodo utilizado rotineiramente no controle de qualidade de frmacos anti-retrovirais,


devido a sua alta sensibilidade, repetibilidade, especificidade e boa performance de anlise (SARKAR et al., 2006;
ZECEVIC et al., 2006). Atravs do emprego de um mtodo analtico, deve-se obter resultados confiveis e
consistentes quando usado por diferentes operadores, aparelhagem similar em diferentes laboratrios (SHARP,
2000). A validao de mtodos analticos de suma importncia, tanto por razes cientficas, uma vez que
produzem resultados confiveis na transferncia entre laboratrios, quanto por razes comerciais, pois mtodos
validados so pr-requisitos para a certificao das anlises e para o livre comrcio internacional (CUNHA et al.,
2005).
Para garantir que um novo mtodo analtico gere informaes confiveis e interpretveis sobre a amostra
ele deve ser validado. A validao de um mtodo um processo contnuo que comea no planejamento da
estratgia analtica e continua ao longo de todo o seu desenvolvimento e transferncia entre laboratrios. Para
registro de novos produtos, todos os rgos reguladores do Brasil e de outros pases exigem a validao da
metodologia analtica a ser utilizada (BRASIL, 2003; BRASIL 2003a). Para isso, a maioria deles estabelece
documentos oficiais que so diretrizes a serem adotadas no processo de validao. Um processo de validao
bem definido e documentado oferece s agncias reguladoras evidncias objetivas de que o mtodo e o sistema
esto adequados para o uso desejado (RIBANI et al., 2004).
A validao deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o mtodo atenda s exigncias das
aplicaes analticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar seletividade,
linearidade, intervalo, preciso, limite de deteco, limite de quantificao e exatido adequados anlise
(BRASIL, 2003).
O objetivo desse trabalho foi desenvolver e validar uma metodologia analtica para anlise simultnea de
3 frmacos anti-retrovirais atravs do uso da Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) (TURNER et al,
2003; FAN & STEWART, 2002). Os frmacos Estavudina (d4T), Lamivudina (3TC) e Zidovudina (AZT) (Figura 1)
esto entre os anti-retrovirais mais amplamente utilizados na clnica (GALLO, 2002; HARDMAN & LIMBIRD, 2003;
KAPOOR et al., 2006), devido a sua grande eficcia, possuindo efeitos sinrgicos quando associados, resultando
numa melhor atividade anti-retroviral (GALLO, 2002; VOLOSOV et al., 2002; NOTARI, 2006). A validao da
metodologia analtica foi verificada segundo os critrios estabelecidos na Resoluo RE n 899, de 29 de maio
de 2003, descrita pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria ANVISA (BRASIL, 2002).

O O
NH2
CH3
CH3 HN
HN N
O N
N O HO
O N
HO O
HO O
O

- +
S N N N
d4T AZT
3TC
FIGURA 1. Estrutura molecular da Estavudina (2,3-didesidro-2,3-di-desoxitimidina; d4T), Lamivudina (2-
desoxi-3-tiacitidina; 3TC) e Zidovudina (3-azido-3-desoxitimidina; AZT).

MATERIAIS E MTODOS

Os ensaios foram realizados em cromatgrafo Merck-Hitachi Modelo/D-7000 Chrom. Data Station Software.
HPLC System Manager, utilizando uma coluna Merck de fase reversa C8 (250 mm x 4 mm x 5 m), deteco no
ultravioleta (270 nm). Utilizou-se fase mvel gradiente constituda de tampo CH3COOK, 0,0663 mol L-1, pH 6,0 e
Metanol, com fluxo de 1,2 mL min-1. A coluna foi mantida na temperatura de 45C e o volume de injeo da
amostra de 20 L. Neste sistema foram analisados os 3 frmacos anti-retrovirais doados pela Fundao para o
Remdio Popular - FURP. A soluo padro contendo Estavudina (d4T, pureza de 99,8%), Lamivudina (3TC,
pureza de 99,8%) e Zidovudina (AZT, pureza de 99,7%) foi preparada atravs da dissoluo de cada frmaco em
gua deionizada, tendo concentraes diferenciadas para cada, respeitando-se a proporcionalidade das doses
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comumente utilizadas na clnica, perfazendo 26,6 g mL-1 de d4T; 100 g mL-1 de 3TC e 200 g mL-1 de AZT. A
partir de diluies sucessivas desta soluo padro, foram preparadas solues de trabalho. A validao do
mtodo proposto foi obtida por meio da avaliao dos parmetros de seletividade, linearidade, limite de deteco
(LOD), limite de quantificao (LOQ), preciso, exatido e robustez, conforme descritos na na Resoluo RE n
899, de 29 de maio de 2003, proposta pela ANVISA.

AVALIAO DA SELETIVIDADE

A seletividade do mtodo foi verificada atravs da anlise de solues-placebo contendo concentraes


conhecidas de excipientes comumente encontrados nas formulaes de anti-retrovirais (lactose, celulose
microcristalina e estearato de magnsio). Os dados foram avaliados em comparao com a anlise de uma
soluo contendo apenas os frmacos, sem os excipientes e por meio da anlise da soluo dos anti-retrovirais
contaminada com a soluo placebo.

DETERMINAO DA LINEARIDADE

A linearidade do mtodo proposto foi avaliada atravs da construo de curvas de calibrao produzidas
com solues de diferentes concentraes contendo os 3 frmacos. As curvas de calibrao foram construdas
nas faixas de 2,5 16,7 g ml-1 para d4t; 9,4 62,4 g ml-1 para 3tc e 18,7 124,8 g ml-1 para azt e avaliadas
matematicamente quanto a parmetros de linearidade.

VERIFICAO DA REPETIBILIDADE E PRECISO INTERMEDIRIA

Para avaliar a repetibilidade do mtodo foram feitas seis injees consecutivas de uma soluo contendo
concentraes quem mantinham a proporcionalidade das diferentes doses comumente utilizadas, ou seja, 5 g ml-
1 de d4t; 18,7 g ml-1 de 3tc e 37,4 g ml-1 de azt em um mesmo dia. A avaliao da preciso intermediria foi
realizada atravs de injees de seis solues com as mesmas concentraes utilizadas para a verificao da
repetibilidade em 3 diferentes dias, tendo um dia de intervalo entre as anlises.

IDENTIFICAO DO LIMITE DE DETECO E QUANTIFICAO

Para determinar a menor quantidade dos analitos passveis de serem verificados atravs do mtodo
proposto, calculou-se a relao de 3 vezes o rudo da linha de base que pode ser expressa pela equao 1.

DPa x3
LOD =
IC (1)

Onde: dpa o desvio padro do intercepto com o eixo y e ic a inclinao da curva de calibrao.

A menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser quantificada com preciso e
exatido aceitveis sob as condies experimentais estabelecidas foi determinada atravs da relao de 10 vezes
o rudo da linha base, expressa pela equao 2

DPa x10
LOQ =
IC (2)

Onde: dpa o desvio padro do intercepto com o eixo y e ic a inclinao da curva de calibrao.

O mesmo critrio de lod pode ser adotado para o loq, utilizando a relao 10:1, ou seja, o loq pode ser
calculado utilizando o mtodo visual, a relao sinal-rudo ou a relao entre a estimativa do desvio padro da
resposta (que pode ser a estimativa do desvio padro do branco, da equao da linha de regresso ou do
coeficiente linear da equao) e a inclinao da curva analtica (s), em nveis prximos ao loq, a partir da equao
3.

s
LOQ = 10 x
S (3)

IDENTIFICAO DA EXATIDO DO MTODO


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A exatido da metodologia foi verificada por meio do mtodo da recuperao. uma soluo amostra foi
contaminada, fazendo com que se obtenha uma concentrao terica. a exatido foi verificada avaliando-se o
quo prximo o valor calculado em relao ao valor terico.

VERIFICAO DA ROBUSTEZ

Foram realizadas variaes nos fatores que potencialmente afetariam as condies analticas; no caso, a
temperatura do forno da coluna, que sofreu variaes de 5 oc; na fase mvel sendo estabelecidas variaes do
ph de 0,1 e do tampo e metanol de 2%, avaliando o impacto destas variaes nas reas sobre as curvas
obtidas. Se com essas variaes, os resultados mantm-se dentro dos limites de exatido, preciso e seletividade
aceitveis, ento o mtodo pode ser considerado robusto e estas variaes aceitveis ao procedimento.

RESULTADOS E DISCUSSO

A validao de uma metodologia analtica visa assegurar atravs de inferncias qualitativas e quantitativas
que um mtodo adequado ao objetivo pretendido. Desta maneira foi realizada a validao da metodologia de
quantificao de 3TC, d4T e AZT por CLAE. Para tanto, foram avaliados parmetros de seletividade, linearidade,
LOD, LOQ, preciso e exatido do mtodo proposto.

A figura 1 apresenta o cromatograma da anlise simultnea dos antiretrovirais obtidos dentro das condies
experimentais citadas anteriormente. Verifica-se que os tempos de reteno foram elevados; estando na ordem de
12,0; 10,2 e 15,7 minutos para d4t, 3tc e azt, respectivamente. esse tempo de reteno mostra-se adequado para
separao dos frmacos em matrizes biolgicas, a exemplo do sangue, fazendo com que as protenas
plasmticas, que comumente saem nos primeiros minutos da corrida cromatogrfica no prejudiquem a anlise.
pode-se a partir da figura visualizar que os picos mostraram-se simtricos e sem cauda, o que denota a robustez e
adequabilidade da separao cromatogrfica.
A anlise do parmetro seletividade, avaliada atravs da contaminao de solues padro contendo
concentraes conhecidas dos antiretrovirais em questo e os excipientes lactose, celulose microcristalina e
estearato de magnsio demonstrou no haver influncia desses no tempo de reteno dos frmacos bem como
nas reas dos picos.
AZT

200

150
3TC

100
rea

50
d4T

0 5 10 15 20

Tempo de reteno / min

FIGURA 2. Cromatograma da anlise simultnea dos antiretrovirais d4T, 3TC e AZT.


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O mtodo proposto foi avaliado quanto a sua linearidade por meio do tratamento matemtico dos resultados
obtidos nas anlises realizadas em triplicatas dos 3 frmacos. As curvas de calibrao para d4t (r2 =0,9994) para
3tc (r2 =0,9995) e azt (r2 =0,9993) mostraram-se adequadamente lineares, como demonstram os coeficientes de
correlao apresentados (figura 3). Os resduos das curvas de calibrao tambm foram avaliados (figura 4). Os
mesmos apresentaram uma leve tendncia no terceiro ponto da curva para todos os frmacos. Entretanto, esses
se apresentaram homogneos entre as curvas e entre a linha central da tendncia de distribuio.
LAMIVUDINA ZIDOVUDINA
6
8.0x10
7
1.2x10
6
6.0x10
6
9.0x10
rea (mV)

rea (mV)
6
4.0x10
6
6.0x10
y = 75828,09 + 1,1E8x y = 112243,13 + 1E8x
6
2.0x10 6
3.0x10

0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.03 0.06 0.09 0.12 0.15
Concentrao (mg/mL) Concentrao (mg/mL)

Figura 2. Curvas de calibrao e equaes da reta dos antiretrovirais d4T, 3TC e AZT.

ESTAVUDINA

40000

20000
Resduo

-20000
0 0.005 0.01 0.015 0.02
Varivel X 1

LAMIVUDINA

100000
Resduo

-100000
0 0.02 0.04 0.06 0.08
Varivel X 1
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ZIDOVUDINA

200000
Resduo

-200000
0 0.05 0.1 0.15
Varivel X 1

Figura 4. Plotagem dos resduos das curvas de calibrao demonstrando a simetria dos pontos.

A repetibilidade de um mtodo traduz a preciso do mesmo nas mesmas condies experimentais e num
curto espao de tempo. J a preciso intermediria reflete a capacidade de um mtodo de resistir a variaes dos
resultados quando analisados em um espao de tempo maior, como em dias consecutivos. Os coeficientes de
variao (cv) encontrados para as anlises de repetibilidade (intra-dia) foram de 2,20% para 3tc; 1,94% para d4t e
1,92% para azt, enquanto que para a preciso intermediria (inter-dias) obteve-se um cv de 0,93% para 3tc;
1,88% para d4t e 0,53% para azt, garantindo assim uma adequada preciso do mtodo, visto que a legislao5
admite valores at 5 % para o cv. As anlises intra e inter-dias foram ainda avaliadas quanto similitude dos
resultados, mostrando-se significativamente semelhantes (p>0,05; ic 95%)

Os limites de deteco (lod) calculados para o mtodo demonstraram que o mesmo mostra-se bastante
sensvel para a deteco dos frmacos, sendo estabelecido em 0,026 g ml-1 para d4t; 0,034 g ml-1 para 3tc; e
0,038 g ml-1 para azt. Da mesma maneira, o limite de quantificao (loq) tambm permitiu quantificar
concentraes bastante baixas dos antiretrovirais, estando em 0,088 g ml-1 para d4t; 0,114 g ml-1 para 3tc; e
0,127 g ml-1 para azt, indicando que o mtodo suficientemente sensvel.

A exatido do mtodo cromatogrfico, determinada pela metodologia da recuperao mostrou-se entre


96,4% e 99,2%, ficando dentro das especificaes de 80% a 120%. Foi tambm constatado que o mtodo pouco
sensvel a modificaes na temperatura do forno da coluna, ph e constituio da fase mvel, tendo estas
variaes uma influncia inferior a 5%, confirmando sua robustez.

CONCLUSES

O mtodo proposto atende as exigncias da Resoluo RE n 899 ANVISA5, garantindo a adequabilidade


da anlise, sendo um passo importante para as subseqentes etapas do desenvolvimento de formas
farmacuticas contendo estes trs frmacos ou mesmo anlise das concentraes sanguneas desses. O mtodo
proporciona um custo razovel, com um tempo de anlise curto, acelerando assim a resposta da anlise,
imprescindvel na indstria farmacutica ou laboratrios responsveis pela anlise da forma farmacutica ou
matrizes biolgicas.

Agradecimentos: Os autores so gratos Fundao para o Remdio Popular FURP pelo fornecimento das matrias-primas e
Universidade da Regio de Joinville (UNIVILLE) pelo apoio logstico.

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