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ALEXANDRE BARRETO DE ALMEIDA

Sistema biolgico de aumento da taxa de prenhez.


Embries partenogenticos podem ajudar o
reconhecimento materno da gestao

So Paulo
2008
II

ALEXANDRE BARRETO DE ALMEIDA

Sistema biolgico de aumento da taxa de prenhez.


Embries partenogenticos podem ajudar o
reconhecimento materno da gestao

Tese apresentada ao Programa de Ps-


Graduao em Repoduo Animal da
Faculdade de Medicina Veterinria e
Zootecnia da Universidade de So Paulo
para obteno do ttulo de Doutor em
Medicina Veterinria

Departamento:
Reproduo Animal

rea de concentrao:
Reproduo Animal

Orientador:
Prof. Dr. Ed Hoffmann Madureira

So Paulo
2008
III
IV

FOLHA DE AVALIAO

Nome: ALMEIDA, Alexandre Barreto

Ttulo: Sistema biolgico de aumento da taxa de prenhez. Embries partenogenticos


podem ajudar o reconhecimento materno da gestao

Tese apresentada ao Programa de Ps-


Graduao em Reproduo Animal da
Faculdade de Medicina Veterinria e
Zootecnia da Universidade de So Paulo
para obteno do ttulo de Doutor em
Medicina Veterinria

Data: ____/____/____

Banca Examinadora

Prof. Dr.________________________ Instituio:___________________

Assinatura:______________________ Julgamento:__________________

Prof. Dr.________________________ Instituio:___________________

Assinatura:______________________ Julgamento:__________________

Prof. Dr.________________________ Instituio:___________________

Assinatura:______________________ Julgamento:__________________

Prof. Dr.________________________ Instituio:___________________

Assinatura:______________________ Julgamento:__________________

Prof. Dr.________________________ Instituio:___________________

Assinatura:______________________ Julgamento:__________________
V

Erguei-vos, Senhor, em vossa potncia !


Cantaremos e celebraremos o vosso poder
Salmo 20
VI

DEDICO este trabalho ao meu

amvel filho Joozinho!!


VII

AGRADECIMENTOS

Deus, pela beno de acompanhar-me nesta caminhada to importante. Graas e


louvores sejam dados sempre e em todo lugar.

Universidade de So Paulo, Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia e


Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos especialmente aos professores
Dr. ED HOFFMANN MADUREIRA e Dr. FLVIO VIEIRA MEIRELLES pelo incentivo
produo cientfica, pelo conhecimento transmitido nesses anos de convvio e
sobre tudo,, pela amizade construda nesses anos.

Aos amigos e professores do Departamento de Reproduo Animal da FMVZ-USP


pelo harmonioso convvio e agradvel convivncia.

Aos professores Dr. JOS ANTONIO VISINTIN e Dr. RENATO CAMPANARUT


BARNABE pelos exemplos de vida que transmitiram para mim desde o mestrado e
pela contribuio que estes profissionais fizeram ao nosso departamento.

Aos profs Dr. MRIO BINELLI, Dra. CLUDIA LIMA LEAL e Dr. RUBENS PAES DE
ARRUDA e Dra. ANNELIESE TRALDI pelas constantes trocas de idias e ajudas
recprocas.

Fazenda So Joo do Araqu, pela colaborao na execuo deste projeto e pelo


companheirismo da Dra. ISABEL A.S. BORDIN e Dr. JOS ORLANDO BORDIN.

Pela equipe de campo da Araqu, Sr. JAIR ALMEIDA, ALEX, RODRIGO,


LEANDRO, GUSTAVO e SANDRO.

empresa INVITROBRASIL, em especial CHRISTINA FERREIRA pela especial


participao neste projeto.

Aos amigos RICARDO DEMTRIO e DER BRANDEBURGO.

Ao Moiss e Estela Kobashigawa pela grande ajuda na anlise estatstica


realizada neste projeto.

Aos tcnicos do VRA e LMMD : MRCIO, ISABEL, GIOVANA, NILTON E ROBERTA

Aos amigos do VRA: especialmente ao Z RODRIGO, PRCIO, CARLINHA,


VANESSA MARQUES, FERNANDO PARDO, FERNANDINHO, CLAUDINHA,
JULIANA, SIMPRO, FELIPE PIRA, SILAS, ANDR, FERNANDO.
VIII

Aos amigos do LMMD: MOSES, FELIPE BEERITA, PAULO, TIAGO, PEDRINHO,


MARCOS, PERECIN, FERNANDO, LIGIA, SLVIA, MARTINI, ADRIANA,
WERUSKA, GIOVANA, PATRCIA e CRISTINA.

Aos meus pais, minha irm e Paula pelo amor dedicado e compreenso na
produo deste doutorado.

FAPESP pelo apoio financeiro (04/03965-8).


IX

RESUMO

ALMEIDA, A. B. Sistema biolgico de aumento da taxa de prenhez. Embries


partenogenticos podem ajudar o reconhecimento materno da gestao.
[Biological system to increase pregnancy rate. Parthenogenetic embryos can help
the maternal recognition of the gestation]. 2008. 88 f. Tese (Doutorado em Medicina
Veterinria) - Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade de So
Paulo, So Paulo, 2008.

Um dos objetivos deste trabalho foi avaliar e comparar a taxa de prenhez de


receptoras bovinas nulparas, aps transferncia de embries fecundados in vitro ou
in vivo, associados ou no a um embrio partenogentico. Um total de 239 novilhas
foram utilizadas, e as mdias das taxas de prenhez aos 30 (TP30d) e 60 dias (TP
60d), foram comparadas em arranjo fatorial 8x2 entre G1 e G2 (fecundados in vitro),
e em anlise fatorial 3x2, entre G3 e G4 (fecundados in vivo). O delineamento
utilizado foi: G1) transferncia de 1 embrio fecundado in vitro (n=86); G2)
transferncia de 1 embrio partenogentico associado a 1 embrio fecundado in
vitro (n=81); G3) transferncia de 1 embrio fecundado in vivo (n=36) e G4)
transferncia de 1 embrio partenogentico associado a 1 embrio fecundado in vivo
(n=36). A taxa de prenhez aos 30 dias para o G1 foi de 31,3% (27/86) e do G2 de
37,0% (30/81); P= 0,28. Para o G3, de 55,5% (20/36) e G4, de 75,0% (27/36);
P=0,09. No houve diferena (P=0,92) para taxa de prenhez aos 60 dias para o G1
em relao ao G2, com taxas de 24,6% (22/86) e 28,2% (23/81); respectivamente.
Tambm no houve diferena (P=0,08) aos 60 dias para o grupo G3 em relao ao
G4, com taxas de 44,4 % (16/36) e 61,1% (22/36), respectivamente. As perdas
embrionrias no perodo foram de 14,81% para o G1, 33,34% para o G2, 25,00%
para o G3 e 18,52% para o G4. As mdias de peso ao nascimento dos animais
pertencentes ao G1 e G2, foram de 26,3 Kg (1,2; n=6) e 28,8 Kg (2,1; n=7)
respectivamente. As mdias dos dias de gestao das receptoras dos grupos G1e
G2 foram de 290 dias (2,1) e 292,8 dias (1,1) respectivamente. Para avaliar o
embrio partenogentico em relao aos embries fecundados in vitro aps 9 dias
de cultivo embrionrio, foi determinado os resultados para as seguintes variveis
dependentes: taxa de clivagem, taxa de blastocisto, taxa de blastocisto eclodido,
nmero de ncleos e freqncia do RNAm do IFN- em 6 sesses de produo
embrionria. Os resultados foram analisados em fatorial 6x2. Foi observada
X

diferena (P<0.05) nas taxas de clivagem, blastocisto e ecloso entre os


tratamentos, houve diferena entre nmero de ncleos, 231 para os fecundados e
156 para os partenogenticos (P=0.001), e para a expresso do gene do IFN- , os
embries partenogenticos expressaram mais o gene do IFN em relao aos
fecundados (P=0.001). Finalmente, Western blots foram realizados para identificar a
protena do IFN- bovino em embries fecundados e partenogenticos aps 12 dias
de cultivo. Bandas correspondente ao IFN- foram encontradas nos meios de cultivo
onde permaneceram os embries fecundados e partenogenticos com peso
molecular mdio de 24 kDa. No se detectou uma banda especfica ao IFN- nos
extratos embrionrios. Tendo em vista o apresentado, conclui-se que apesar dos
embries partenogenticos expressarem o gene e secretarem a protena do IFN-, a
transferncia de um embrio partenogentico, associado a embries fecundados in
vitro ou in vivo, no favoreceu (P<0.05) ao aumento da taxa de prenhez, mas no
prejudicou o desenvolvimento da gestao a termo em bovinos.

Palavras-chave: Partenogenticos. Interferon tau. Reconhecimento materno. Taxa


de prenhez. Bovinos.
XI

ABSTRACT

ALMEIDA, A. B. Biological system to increase pregnancy rate. Parthenogenetic


embryos can help the maternal recognition of the gestation. [Sistema biolgico
de aumento da taxa de prenhez. Embries partenogenticos podem ajudar o
reconhecimento materno da gestao]. 2008. 88 f. Tese (Doutorado em Medicina
Veterinria) - Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade de So
Paulo, So Paulo, 2008.

The aim of this work was to evaluate the bovine pregnancies rate of in vitro and in
vivo produced embryos associated or not to a parthenogenetic embryo in heifers.
Two hundred thirty nine recipients were used. The average of pregnancies rate were
compared between G1 and G2 (in vitro) and between G3 and G4. (in vivo). The
groups were: G1) 1 in vitro fertilized embryo (n=86); G2) 1 parthenogenetic embryo
associated with 1 in vitro fertilized embryo (n=81); G3) 1 in vivo fertilized embryo
(n=36) and G4) 1 parthenogenetic embryo associated with 1 in vivo fertilized embryo
(n=36). Pregnancy rate at day 30 for G1 was 31.3% (27/86) similar to G2 37.0%
(30/81); P=0.28. Group 3 rate was 55.5% (20/36) and also similar to G4, 75.0%
(27/36); P=0.09. There was no difference (P=0.92) to pregnancy rate at day 60 for
G1 compared with G2. The G1 and G2 rates were 26.74% (23/86) and G2 24.69%
(20/81) respectively. Also, there were no difference (P=0.08) between G3 and G4.
The G3 and G4 rates were 44.4 % (16/36) and 61.1% (22/36) respectively. The
embryonic loss in this period was 14.81% for G1, 33.34% for G2, 25.00% for G3 and
18.52% for G4. The calf average weight of these animals from G1 and G2 were
respectively 26.3Kg (1.2; n=6) and 28.8 Kg (2.1; n=7). The average pregnancy
length of the recipients from G1 and G2 were respectively 290 days (2.1) and 292.8
days (1.1). To evaluate the parthenogenetic embryo quality, the cleavage rate,
blastocyts rate, hatching rate, the number of nuclei, immunocitochemistry for IFN-,
and the mRNA frequency of IFN- was determined in 9 days harvesting
parthenogenetic and in vitro fertilized embryos. Difference (P<0.05) was observed in
cleaveage, blastocysts and hatching rates, nuclei counting between fertilized embryo
(n=231) compared to the parthenogenetic embryo (n=156) and the mRNA relative
quantification of the IFN- gene showed that fertilized embryos have lower
expression compared to parthenogenetic embryo (P<0.01). Finally, the western blots
analysis for IFN- protein was performed in 12 days harvested embryos. Bands for
XII

IFN- were found in culture medium from fertilized and parthenogenetic embryos with
average molecular weight of 24 kDa. The IFN- specific protein was not found in the
embryonic extracts. In view of the presented results we conclude that despite the
production and secretion of IFN- the association of the parthenogenetic embryo with
the fertilized embryo do not favored the pregnancy establishment, however do not
interfered in the development of bovine pregnancy to term.

Key word: Parthenogenetic. Interferon tau. Maternal recognition. Pregnancy rates.


Bovine.
XIII

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Seqncia dos primers e sondas utilizadas no experimento.... 37

Tabela 2 - Taxas de clivagem, blastocisto e blastocisto eclodido de


embries bovinos submetidos a 6 sesses de produo
embrionria, segundo tratamento in vitro, fecundao (FIV)
ou ativao partenogentica..................................................... 46

Tabela 3 - Nmero de ncleos e expresso relativa do gene do IFN- de


embries bovinos submetidos a 6 sesses de produo
embrionria, segundo tratamento in vitro (fertilizao ou
ativao partenogentica)........................................................ 48

Tabela 4 - Nmero de ncleos dos embries fecundados e


partenogenticos no estdio de blastocisto aps 7 dias de
cultivo...................................................................................... 53

Tabela 5 - Taxas de prenhez (TP 30d e TP 60d) em receptoras bovinas


nuliparas, segundo sesso de PIV e tratamento................................. 55

Tabela 6 - Taxas de prenhez (TP 30d e TP 60d) em receptoras bovinas


nuliparas, segundo sesso de TE e tratamento....................... 57

Tabela 7 - Taxa de prenhez aos 30 (TP 30 D) e 60 dias (TP 60 D) para


o G1 e G2 por sesso de Transferncia de embries (TE)...... 59

Tabela 8 - Raa, sexo, peso e dias de gestao dos animais


correspondentes ao grupo dos embries fecundados in vitro
associados a partenogenticos(G2)......................................... 59
XIV

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Exemplo de anlise da curva de eficincia para cada poo


individual atravs do software LinRegPCR, onde as
linhas azuis do grfico superior indicam intervalo
analisado da curva de amplificao em sua fase
exponencial, e o grfico inferior mostra as eficincias
calculadas............................................................................ 38

Figura 2 - Exemplo do padro racial das receptoras utilizadas na


Fazenda Araqu, Charqueada (SP)..................................... 43

Figura 3 - Efeito do tratamento para taxa de clivagem (F:


fecundao; A: ativao partenogentica) durante 6
sesses de produo embrionria. a,b - colunas com
letras diferentes sobrescritas diferem tratamento dentro da
sesso; 1,2,3 - colunas com nmeros diferentes
sobrescritos diferem sesso dentro de tratamento.............. 47

Figura 4 - Curva padro correspondente aos genes GAPDH (a) IFN-


(b) em diferentes diluies. a) R2 =0,9831; b) R2 =0,9896. 49

Figura 5 - Cultivo embrionrio aos 9 dias. O dimetro do embrio (e)


foi estimado em comparao com o do ocito (setas)
colocado no momento da foto. A) Fecundao in vitro; B)
Ativao partenogentica. Barras representam 100 m...... 50

Figura 6 - Cultivo embrionrio aos 12 dias. O dimetro do embrio


(e) foi estimado em comparao com o do ocito (setas)
colocado no momento da foto. A) Fecundao in vitro; B)
Ativao partenogentica. Barras representam 100 m.
Dentro do crculo um blastocisto de 620 m........................ 50
Figura 7 - Western blotting para deteco da protena do IFN- em
meios de cultivo onde permaneceram seis embries do D9
ao D12. A) Controle negativo; B) Quinze embries FIV
D12; C) Quinze embries partenogenticos D12; D) Meio
de cultivo dos embries FIV; E) Meio de cultivo dos
embries partenogenticos; F) Meio de cultivo com 10%
SFB e G) rIFN-.................................................................... 51

Figura 8. Blastocistos eclodidos aps 9 dias de cultivo. A, B e C:


Fecundados; D, E e F: partenogenticos. As letras
correspondem aos individuos. 1) colorao em Hoesch
(azul) para contagem do nmero de ncleos. 2)
Imunocitoqumica (vermelho) para deteco de clulas
produtoras de IFN-.............................................................. 52

Figura 9 - Blastocistos aps 7 dias de cultivo: a) fecundados


XV

b) partenogenticos.............................................................. 53

Figura 10 - Amplificao relativa do gene do IFN- em relao ao


GAPDH de embrio partenogentico aos 21 dias. A) IFN-
; B) GAPDH........................................................................ 54

Figura 11 - Figura a: Bezerros produzidos in vitro originrios do G1 e


G2 (da esquerda para direita). Figura b: Doadora dos
ocitos com os bezerros. Figura c: Receptora do G1 com
bezerro; Figura d: Receptora do G2 com o bezerro............. 58
XVI

LISTA DE ABREVIATURAS

6-DMAP 6-dimetilaminopurina
ANOVA Anlise de varincia
BSA Albumina srica bovina
BE Benzoato de estradiol
2+
Ca Clcio
cDNA DNA complementar
CIV Cultivo in vitro
CL Corpo lteo
cm2 Centmetro quadrado
CO2 Dixido de carbono
COX-2 Cicloxigenase
CT Ciclo do threshold
D Dias
DNA cido desoxirribonuclico
DNTPs Trifosfato de desoxinucleosdeos
DPBS Dulbeccos soluo salina com tampo fosfato
eCG Gonadotrofina corinica equna
FIV Fecundao in vitro
FRET Fluorescence resonance energy transfer
FSH Hormnio folculo estimulante
G Gauge
GAPDH Gliceraldedo-3-fosfato dehidrogenase
GVBD Ruptura da vescula germinativa
HPLC High performance liquid chromatography

IFN- Inteferon gama

IFN- Interferon tau


Interferon tau bovino
bIFN-
Interferon tau ovino
oIFN-
Interferon tau recombinante
rbIFN-
Imunoglobulina G
IgG
Intra muscular
IM
XVII

kDa Quilo Daltons


Kg Quilogramas
LH Hormnio luteinizante
MII Metfase II
MAP Protena ativada por mitgeno
Mg2+ Magnsio
mg Miligramas
ml Mililitros
MHz Mega Hertz
MIV Maturao in vitro
MOET Mltipla ovulao e transferncia de embrio
mmHg Milmetros de mercrio
MPF Fator promotor de metfase
NaCl Cloreto de sdio
NaHCO3 Bicarbonato de sdio
ng/ml Nanogramas por mililitros
parteno partenogentico
PCR Reao em cadeira da polimerase
PGF2 Prostaglandina F2
PHE Penicilamina, hipotaurina e epinefrina
PI Prfase I
PBS Soluo salina com tampo fosfato
PIV Produo in vitro
PVA lcool polivinlico
PVDF Difluorido de polivinilideno
PVP Polivinil pirrolona
RNA cido ribonuclico
RNAm RNA mensageiro
rpm Rotaes por minuto
RT-PCR Transcrio reversa - PCR
SAS Statistical Analysis System
SFB Soro fetal bovino
SOF Fluido sinttico de oviduto
XVIII

TALP Tyrodes Albumin Lactate and Pyruvate


TCM199 Tissue Culture Medium
TE Transerncia de embries
TETF Transferncia de embries em tempo fixo
TP 30d Taxa de prenhez aos 30 dias
TP 60d Taxa de prenhez aos 60 dias
UI Unidade internacional
C Graus Celsius
g Micrograma
l Microlitro

M micromolar
XIX

SUMRIO

1 INTRODUO......................................................................................... 22
2 OBJETIVOS .......................................................................................... 24
3 HIPTESE .............................................................................................. 25
4 REVISO DE LITERATURA ................................................................. 26
4.1 MATURAO E CULTIVO EMBRIONRIO......................................... 26
4.2 ATIVAO ARTIFICIAL OU PARTENOGENTICA............................. 27
4.3 DESENVOLVIMENTO EMBRIONRIO................................................ 28
4.4 RECONHECIMENTO MATERNO DA GESTAO.............................. 28
4.4.1 Interferon-......................................................................................... 28
4.4.2 Mecanismos de ao do IFN- .......................................................... 29

4.4.3 Estimativas da expresso do IFN- no embrio................................. 29

4.5 TAXA DE PRENHEZ DE EMBRIES IN VIVO X IN VITRO................. 30


4.5.1 Progesterona ..................................................................................... 30
4.5.2 Estratgias para aumento da taxa de prenhez................................... 31
5 MATERIAL E MTODOS ....................................................................... 32
5.1 LOCAIS DAS ATIVIDADES................................................................... 32
5.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL..................................................... 32
5.3 PRIMEIRA ETAPA................................................................................ 33
5.3.1 Maturao in vitro (MIV)..................................................................... 33
5.3.2 Fecundao in vitro (FIV)................................................................... 34

5.3.3 Ativao oocitria e produo de embries partenogenticos......... 34

5.3.4 Cultivo in vitro (CIV)............................................................................ 35


5.3.5 Estimativa de tamanho dos embries D9 e D12................................ 35
5.3.6 Avaliao e contagem do nmero de ncleos dos embries
fecundados e partenogenticos aps 9 dias de cultivo.................... 35

5.3.7 Transcrio reversa............................................................................ 36


5.3.8 Avaliao do gene do IFN- pela PCR em Tempo Real de
blastocistos eclodidos FIV e Partenogenticos ............................... 36

5.3.9 PCR em tempo real........................................................................... 37


XX

5.3.10 Anlise estatstica da PIV, contagem do nmero de ncleos e


expresso relativa do gene do IFN- de embries FIV e
partenogenticos.......................................................................... 38
5.3.11 Imunocitoqumica para observao da presena do IFN- em
embries eclodidos........................................................................ 39
5.3.12 Eletroforese unidimensional e Western blotting............................... 40
5.4 SEGUNDA E TERCEIRA ETAPAS....................................................... 41
5.4.1 Sincronizao do ciclo estral das receptoras de embries................ 41
5.4.2 Aspirao folicular in vivo guiada por ultra-sonografia....................... 41
5.4.3 Superovulao e colheita de embries fecundados in vivo................ 42
5.4.4 Transferncia dos embries (TE)....................................................... 42
5.4.5 Diagnstico de prenhez e avaliao das perdas embrionrias.......... 43
5.4.6 Anlise estatstica das taxas de prenhez........................................... 43
5.4.7 Colheita de concepto partenogentico aos 21 dias de gestao....... 44
6 RESULTADOS......................................................................................... 45
6.1 PRIMEIRA ETAPA................................................................................ 45
6.1.1 Taxas de clivagem, taxas de blastocisto, taxas de blastocisto
eclodido, contagem de nmero de ncleos e expresso relativa do
gene do IFN- de embries fecundados in vitro e partenogenticos 45
6.1.2 Estimativa do dimetro de embries fecundados e
partenogenticos.............................................................................. 49

6.1.3 Imunocitoqumica............................................................................... 51

6.1.4 Identificao do IFN- pela tcnica do Western blotting..................... 51


6.1.5 Nmero de ncleos dos embries fecundados e partenogenticos
53
no 7 dia de cultivo...........................................................................
6.1.6 Expresso relativa do gene do IFN- de embrio partenogentico
54
colhido aos 21 dias de gestao......................................................
54
6.2 SEGUNDA ETAPA................................................................................
6.2.1 Taxas de prenhez aos 30 dias (TP 30d) e aos 60 dias (TP 60d)
para embries fertilizados in vitro, associados ou no a um
54
embrio partenogentico..................................................................
56
6.3 TERCEIRA ETAPA...............................................................................
6.3.1 Taxas de prenhez aos 30 dias (TP 30d) e aos 60 dias (TP 60d)
XXI

para embries fertilizados in vivo, associados ou no a um


embrio partenogentico.................................................................. 56
6.4 NASCIMENTOS DE BEZERROS PRODUZIDOS IN VITRO................ 58
7 DISCUSSO............................................................................................ 60
8 CONCLUSES........................................................................................ 66
9 ANEXOS.................................................................................................. 67
REFERNCIAS....................................................................................... 78
22

1 INTRODUO

Em funo dos avanos tecnolgicos alcanados, os pecuaristas passaram a


aplicar a tecnologia de Fecundao in vitro (FIV) para produo de embries
bovinos. A aplicao da FIV com boa taxa de recuperao de ocitos e taxa
bastante razovel de produo de blastocistos demandam um grande nmero de
receptoras aptas inovulao.
Embora bem preparadas, receptoras inovuladas com embries produzidos in
vitro (PIV) produzem taxas de gestao mais baixas comparados com os embries
produzidos por Mltipla Ovulao e Transferncia de Embries (MOET).
Atualmente, laboratrios comerciais aplicando diversos processos de
produo in vitro de embries bovinos tm obtido taxas de blastocistos viveis de
30-40%. As condies de cultivo in vitro (CIV) tm sido determinantes para no
afetar o potencial de desenvolvimento embrionrio (SIRARD e BLONDIN, 1996).
Os embries produzidos in vitro diferem dos in vivo em vrios aspectos
(MASSIP et al., 1995; WRIGHT e ELLINGTON, 1995), tais como citoplasma mais
escuro e menor densidade (POLLARD e LEIBO, 1994), maior quantidade de
triglicerdeos e menos lipdeos (EL RAZEC et al.,2000), aumento do tamanho dos
blastmeros e menor nmero de clulas da massa celular interna (VAN SOOM et al.,
1992), zona pelcida mais frgil (DUBY et al., 1997), diferenas nas junes
intercelulares (BONI et al., 1999) e maior incidncia de anormalidades
cromossomais (VIUFF et al., 1999; SLIMANE et al., 2000). Todas estas diferenas
contribuem para a baixa taxa de sobrevivncia embrionria e, conseqentemente
para uma baixa taxa de concepo dos embries in vitro.
Em bovinos, at aproximadamente o 42 dia de prenhez, o desenvolvimento
da fase embrionria compreende processos como ativao do genoma do embrio,
compactao, formao de blastocele, elongao do trofoblasto, secreo de
interferon-tau (IFN-) e incio da implantao.
O IFN- uma protena que secretada pelo trofectoderma do concepto,
responsvel pela sinalizao da prenhez, atravs da preveno da lutelise (EALY
et al., 1998; BAZER et al., 1997 e TATCHER et al., 1997). O IFN- secretado pelo
trofectoderma quando o embrio atinge o estdio de blastocisto e nesse perodo o
23

RNAm pode ser extrado e a protena detectada em meios de cultura (KUBISCH et


al., 2001).
A primeira resposta do endomtrio ao IFN-, a down regulation , nas
concentraes de receptores para ocitocina e estrgeno (SPENCER et al., 1995) e
inibio da COX-2 (BINELLI et al, 2000).
Falhas do concepto em produzir a quantidade adequada ou endomtrio em
responder ao IFN- podem acarretar em perdas embrionrias (ROBERTS, 1991). A
transcrio do gene IFN- bem como a secreo da protena pode ser afetada por
fatores genticos ou fatores ambientais (JOHNSON, 2006).
Foi confirmado por microscopia eletrnica e reao em cadeia da polimerase,
que embries partenogenticos produzem mais IFN- que embries produzidos in
vitro (KUBISCH et al., 2003). Desta maneira, o objetivo deste trabalho foi avaliar o
efeito na prenhez de bovinos com a transferncia de embries partenogenticos
juntamente com embries produzidos in vitro ou com embries in vivo. Este estudo
foi desenvolvido com a hiptese de que embries partenogenticos favoream o
aumento da produo de IFN- e, consequentemente, levem a uma melhoria na
sinalizao da sobrevivncia embrionria.
24

2 OBJ ETIVOS

Determinar e comparar a freqncia do RNA mensageiro, do gene do


IFN-, em embries fecundados in vitro e partenogenticos, no 9 dia de
cultivo embrionrio.

Avaliar e comparar a taxa de prenhez de receptoras bovinas nulparas,


aps transferncia de embries fecundados in vitro ou in vivo, associados
ou no a um embrio partenogentico.
25

3 HIPTESES

Embries partenogenticos, semelhana dos fecundados in vitro,


possuem a capacidade de expressar o gene do IFN- no 9 dia de
cultivo embrionrio.

Embrio partenogentico produzido in vitro, transferido junto com um


embrio fecundado produz um aumento na taxa de prenhez, durante o
perodo do reconhecimento materno da gestao em bovinos,
provavelmente mediante aumento da produo de IFN-.
26

4 REVISO DE LITERATURA

4.1 MATURAO E CULTIVO EMBRIONRIO

A maturao oocitria o processo da retomada da meiose da primeira


diviso meitica (Prfase I - PI) at a metfase da segunda diviso (Metfase II
MII) sendo caracterizada por ruptura da vescula germinativa (GVBD),
desaparecimento do nuclolo, condensao dos cromossomos, extruso do primeiro
corpsculo polar, formao do segundo fuso meitico e expanso das clulas do
cumulus (GORDON, 1994, HE et al., 1997).
In vivo este processo inicia-se com o pico pr-ovulatrio do hormnio
luteinizante (LH) e in vitro como os ocitos aspirados so bastante heterogneos
devido ao tamanho e estdio do folculo dependendo da fase do ciclo estral em que
se encontra a doadora, os ocitos devem ser submetidos maturao in vitro (MIV)
com meios suplementados de hormnios, fontes proticas e energticas para que
alcancem o estdio de MII (AVELINO, 2000; FARIN et al., 2001).
A maturao divide-se em nuclear e citoplasmtica, a primeira mais
facilmente atingida, visto que ocorre espontaneamente aps a liberao do ocito do
interior do folculo (RICHARD e SIRARD, 1996), j a maturao citoplasmtica
envolve redistribuio das organelas intracelulares como a migrao das
mitocndrias para localizao perinuclear e dos grnulos corticais para a periferia da
clula (GORDON, 1994; HE et al., 1997).
Os ocitos maturados so mantidos no estdio de MII de vido presena do
fator promotor de Metfase (MPF) e da protena ativada por mitgeno (MAP)
promovendo a ruptura da membrana nuclear e manuteno da cromatina
condensada (MEIJER e PONDAVEN, 1988; VERLHAC et al., 1994; YANG et al.,
1994; HOMA, 1995) e para que o ocito em MII retome seu desenvolvimento,
necessrio que alteraes morfolgicas e bioqumicas ocorram na presena do
espermatozide (fecundao) ou por estmulo artificial, conhecido como ativao
partenogentica (KPKER et al., 1998).
A fecundao e a ativao partenogentica promovem alteraes na
concentrao de clcio intracelular e diminuio da atividade do MPF e da MAP,
culmina com exocitose dos grnulos corticais, endurecimento da zona pelcida,
27

formao dos proncleos e incio das mitoses (WHITE e YUE, 1996; KPKER et al.,
1998).
Em bovinos, cerca de 60-70% dos ocitos maturados in vitro no progridem a
blastocisto, e o estdio em que os embries param de se desenvolver varivel,
mas ocorre, geralmente, no momento da transio materno-zigtica, ou seja, no
quarto ciclo celular ou estdio de oito clulas (MEIRELLES et al., 2004).
O bloqueio do desenvolvimento pode ser causado por vrios fatores, tais
como, condies inadequadas de cultivo, anormalidades cromossmicas, stress
oxidativo (BETTS e KING, 2001), choque trmico (RIVERA et al., 2004), presena de
glicose e fosfato inorgnico no meio de cultivo (SCOTT e WHITTINGHAM, 2002),
transcritos e protenas do ciclo celular, como p27 (CIVICO et al., 2002), e protenas
da cascata de apoptose, como p57 e p66 (FAVETTA et al., 2004).

4.2 ATIVAO ARTIFICIAL OU PARTENOGENTICA

Vrios tratamentos artificiais de ativao j foram descritos e atuam por


mecanismos diversos, alguns promovem o aumento de clcio intracelular, como
estrncio e a ionomicina (CUTHBERTSON et al., 1981), enquanto outros inibem a
fosforilao protica, como 6-dimetilaminopurina (6-DMAP; SUSKO-PARRISH et al.,
1994), porm nenhum tratamento artificial capaz de mimetizar todos os eventos
desencadeados pela fecundao (NAKAD A e MIZUNO, 1998).
O estrncio se comporta de maneira mais fisiolgica, promovendo pulsos
mltiplos de clcio (BOS MIKICH et al., 1997), enquanto o 6-DMAP pode
comprometer o desenvolvimento embrionrio (ALBERIO et al., 2001).
Nos embries partenogenticos no h separao das cromtides e o
proncleo formado diretamente a partir da descondensao dos cromossomos em
MII, acarretando a diploidia (MO, 2002), entretanto apresentam falhas na
expresso de alguns genes, principalmente dos genes imprinted devido presena
exclusiva de material gentico de origem materna (URANGA e ARECHAGA, 1997;
VAN DE VELDE et al., 1999).
Embries partenogenticos produzidos pelo tratamento com ionomicina e 6-
DMAP apresentaram desenvolvimento at o 35 dia da gestao, mas a falta de
28

cromossomos paternos impossibilita a formao da placenta, momento em que


ocorre a morte embrionria dos partenogenticos (MO, 2005).

4.3 DESENVOLVIMENTO EMBRIONRIO

Em bovinos, o desenvolvimento da fase embrionria compreende processos


complexos como ativao do genoma do embrio, compactao, formao de
blastocele, elongao do trofoblasto, secreo de IFN- para manuteno do corpo
lteo, diferenciao dos tecidos da placenta e implantao. At aproximadamente o
42 dia de vida do embrio, todos estes processos podem no ocorrer devido
alguma falha intrnseca no embrio (HANSEN, 2002).

4.4 RECONHECIMENTO MATERNO DA GESTAO

4.4.1 Interferon-

Interferons produzidos pelos conceptos de bovinos apresentavam atividades


peculiares aos IFN tipo I e foram nomeados de IFN- por sua origem trofoblstica,
sendo produzido em quantidades suficientes para a manuteno do corpo lteo (CL)
entre o 15 e 17 dia da gestao, (THATCHER, 1989).
Essa sinalizao potencializada medida que o embrio aumenta de
tamanho, e quantidades inadequadas de IFN- para bloquear a produo de
prostaglandina F2 (PGF2 ) no tero, levam a interrupo da gestao (LEUNG,
2000).
O IFN- atua na inibio da proliferao celular e como todos IFN tipo I, o IFN-
tambm se liga a receptores dos quais ativam fatores de transcrio (ALEXENKO
et al., 1997; BINELLI et al., 1998) induzindo expresso de diversos genes (OTT et
al., 1998).
Mltiplos genes que codificam IFN- so transcritos durante o perodo inicial
da gestao, com 12 isoformas de IFN- j conhecidas (ALEXENKO et al., 2000)
29

produzindo protenas com atividades biolgicas diferentes (EALY et al., 1998; EAL Y
et al., 2001; WINKELMAN et al., 1999).

4.4.2 Mecanismos de ao do IFN-

O mecanismo geral pelo qual o IFN- inibe a regresso do CL a supresso


da liberao pulstil de PGF2 endometrial. O IFN- atua inibindo a sntese de PGF2
(BAZER et al., 1991 e BINELLI et al., 2000).
O IFN- atenua a secreo de PGF2 em clulas epiteliais, consideradas fonte
primria desse tipo de prostaglandina, atravs da regulao negativa de RNAm para
Cicloxigenase 2 (COX-2), enquanto nas clulas estromais, o IFN- notadamente
estimula a expresso de COX-2 (XIAO et al., 1998).

4.4.3 Estimativas da expresso do IFN- no embrio

A expresso de IFN- pode ser mensurada utilizando-se diversos mtodos


capazes de identificar esta protena em meios de cultura ou fluidos biolgicos, ou
mesmo a expresso de seu RNAm em tecidos e clulas.
A transcrio do RNAm para a diferenciao inicial e funcional das clulas do
trofoblasto importante para que ocorra o dilogo entre as clulas do trofectoderma
do concepto e as clulas do endomtrio para a manuteno do CL e a sobrevivncia
embrionria. O sistema de cultura e a fonte de suplementao protica afetam a
freqncia da expresso do gene do IFN- (WRENZYCKI et al., 1999).
Mtodos como o teste de imunodifuso baseia-se na reao de precipitao
do antgeno e anticorpo em meios lquidos, e foi utilizada para identificar IFN-
bovino e ovino (HELMER et al., 1987).
Tcnicas como a cromatografia lquida de alta performance (HPLC high
performance liquid chromatography) tambm foram utilizadas para purificar bIFN-
recombinante (rbIFN-) e determinar a produo dessa protena por cepas da
levedura Pichia pastoris (SINHA et al.,2003).
Um radioimunoensaio para deteco do bIFN- foi desenvolvido (TAKAH ASHI
et al., 2005; NAGAYA et al., 2004 e EAL Y et al., 1998). Outros utilizaram a tcnica
30

de Western blotting para deteco do bIFN- e oIFN- (GUILLOMOT et al., 1998).


Vrios estudos relacionados a aspectos do reconhecimento materno da
gestao foram desenvolvidos utilizando ensaios de atividade antiviral como
indicativo da secreo de IFN- (Rubinstein et al., 1981). Utilizando esse mtodo, a
secreo de IFN- produzida por embries obtidos in vivo ou produzidos in vitro foi
comparada (STOJKOVIC et al., 1999).
Embries que desenvolveram mais rapidamente at o estdio de blastocisto
produziram maiores quantidades de IFN- em relao ao grupo que demorou mais a
atingir o mesmo estdio (KUBISCH et al., 2003, WRENZYCKI et al., 1999).
Porm, em estudo com trs isoformas recombinantes de bIFN- no foi
observada relao entre atividade antiviral relatada e a capacidade em modular a
sntese de PGF2 observada em clulas epiteliais e estromais endometriais
(PARENT et al., 2003).
Vrios trabalhos tm mostrado os fatores que interferem a produo de IFN-
em blastocistos bovinos (KUBISCH et al., 1998; LARSON e KUBISCH, 1999;
WRENZYCKI et al., 1999).

4.5 TAXA DE PRENHEZ DE EMBRIES IN VIVO X IN VITRO

4.5.1 Progesterona

Fmeas que falham na concepo apresentam menores concentraes de


progesterona em relao quelas que se tornam gestantes (LUKASZEWSKA e
HANSEL,1980; LAMMING et al., 1989) e a baixa concentrao de progesterona na
fase luteal de novilhas foi correlacionada com embries considerados
subdesenvolvidos para o 16 dia de gestao (WATHES et al., 1998).
31

4.5.2 Estratgias para aumento da taxa de prenhez

Estudos voltados preveno da mortalidade embrionria com a utilizao de


hormnios exgenos vm sendo cada vez mais utilizados como estratgias anti-
luteolticas e tm apresentado resultados variveis (PETERS, 1996).
Em 2001, a equipe de Binelli citaram estratgias para impedir o mecanismo
luteoltico desencadeado pela liberao de prostaglandina F2, como o aumento do
tamanho e da taxa de crescimento do corpo lteo, o incremento das concentraes
plasmticas de progesterona durante o diestro e tal como a reduo da ao do
folculo dominante durante os 15 e 17 do ciclo estral.
Implantes auriculares de norgestomet foram utilizados no dia da TE de
embries produzidos in vitro, e as taxas de prenhez foi de 51,9% para o grupo que
recebeu implante e de 49,6% para o grupo no tratado, e no observaram diferenas
nas concentraes plasmticas de progesterona no dia precedente a inovulao
entre as receptoras que emprenharam daquelas que retornaram ao cio (SMITH et
al., 1996).
A utilizao de 500 UI da eCG no 5dia aps a colocao de implantes
contendo progesterona tem por finalidade aumentar o efeito do dimetro do corpo
lteo no ovrio ipsilateral transferncia de embries conforme estudos realizados
na Holanda (GARCIA e SAL AHEDDINE, 2000), nos Estado Unidos (SPELL et al.,
2001) e no Brasil (BARUSELLI et al., 2000; MARQUES,2001)

]
32

5 MATERIAL E MTODOS

5.1 LOCAIS DAS ATIVIDADES

As atividades laboratoriais foram desenvolvidas no Laboratrio de


Morfofisiologia Molecular e Desenvolvimento (LMMD), no Departamento de Cincias
Bsicas, da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, da Universidade de
So Paulo (FZEA) e em colaborao com Laboratrio de Fisiologia e Endocrinologia
Molecular (LFEM), do Departamento de Reproduo Animal, da Faculdade de
Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade de So Paulo (FMVZ).
As atividades a campo contaram com a participao do Laboratrio de
Fisiologia e Endocrinologia da Reproduo (LFER), do Departamento de
Reproduo Animal, da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, da
Universidade de So Paulo (FMVZ), junto com o laboratrio InVitro Brasil, Mogi
Mirim (SP) e em colaborao com a Fazenda So Joo do Araqu, Charqueada
(SP).

5.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

O trabalho foi dividido em trs etapas. A primeira, composta exclusivamente


pelas atividades laboratoriais, responsvel pela produo in vitro de embries
fecundados e partenogenticos, quantificao relativa do RNAm do gene do IFN-,
Western blotting para deteco da protena do IFN- e imunocitoqumica, para
observao da presena do IFN- em embries eclodidos.
Embries FIV e partenogenticos foram comparados para as seguintes
variveis: taxa de clivagem, taxa de blastocisto, taxa de blastocisto expandido,
nmero de ncleos e expresso relativa do gene do IFN-.
Foram realizadas 6 sesses de produo in vitro (PIV), nas quais foram
utilizados, por sesso, 2 tratamentos: fertilizao ou ativao partenogentica.
Os ocitos foram distribudos, aleatoriamente, para receber um dos
tratamentos, FIV ou ativao partenogentica, num delineamento prospectivo
33

inteiramente casualizado, dentro de cada sesso. Entretanto, para as anlises


estatsticas considerou-se um arranjo fatorial do tipo 6 x 2 (6 sesses de PIV x 2
tratamentos).
Na segunda etapa, o experimento apresentou um delineamento inteiramente
casualizado, com 2 grupos distintos (G1 e G2): G1) transferncia de 1 embrio
fecundado in vitro (n=86); G2) transferncia de 1 embrio partenogentico,
associado a 1 embrio fecundado in vitro (n=81), organizados em esquema fatorial
8x2 (8 sesses de PIV x 2 tratamentos).
A terceira etapa foi composta por mais dois grupos (G3 e G4). G3)
transferncia de1 embrio fecundado in vivo (n=36) e G4) transferncia de 1
embrio partenogentico associado a 1 embrio fecundado in vivo (n=36)
organizados em esquema fatorial 3x2 (3 sesses de TE x 2 tratamentos).

5.3 PRIMEIRA ETAPA

A produo in vitro (PIV) de embries consistiu na aquisio de ocitos


viveis para maturao, fecundao com espermatozides capacitados e o
desenvolvimento do zigoto at o estdio de blastocisto.

5.3.1 Maturao in vitro (MIV)

Os ocitos foram maturados em meio TCM199, com sais de Earles


(Invitrogen), glutamina e NaHCO3, suplementado com 10% de SFB, piruvato
(22g/mL), gentamicina (50g/mL), 0,5 g/mL de FSH, 50g/mL de LH e 1,0 g/ml
de estradiol em microgotas de 90L de meio de maturao, cobertas com leo
mineral e levados incubadora, em atmosfera com 5% de CO2, em ar, 38,5C,
durante 22 a 24 horas.
34

5.3.2 Fecundao in vitro (FIV)

Aps o perodo de maturao, os ocitos foram submetidos fecundao in


vitro, em microgotas de 100l de meio TALP, suplementado com heparina (10g/ml),
piruvato (22g/ml), gentamicina (50g/ml), BSA sem cidos graxos (6mg/ml) e
soluo de PHE (2M de penicilamina, 1M de hipotaurina e 0,25M de epinefrina).
As palhetas de smen foram descongeladas em banho 35C, durante 30 segundos
e seu contedo centrifugado em gradiente de Percoll (45 e 90%), para obteno dos
espermatozides mveis, remoo do diluidor e do plasma seminal. Os ocitos
foram transferidos para as microgotas (30 ocitos/gota), junto com os
espermatozides, concentrao de 2x106 clulas/mL, onde permaneceram sob
incubao, em atmosfera com 5% de CO2, em ar, 38,5C, durante 20 horas.A e, ,

5.3.3 Ativao oocitria e produo de embries partenogenticos

A produo do embrio partenogentico foi realizada aps 24 horas de


maturao in vitro, quando os ocitos foram desnudados e selecionados para o
tratamento de ativao.
As clulas do cumulus dos ocitos foram removidas por incubao, em meio
PBS, livre de clcio, com 0,1% PVA e 0,2% de hialuronidase, 38,5C por 5
minutos, seguida por movimentos repetidos de pipetagem, durante 3 a 5 minutos.
Os ocitos de citoplasma homogneo foram lavados 3 vezes, em meio TCM
199 Hepes (3 mg/ml de BSA) e incubados em gotas de 100l, com 5 M de
ionomicina, em TALP livre de Ca2+ e Mg2+ (1mg/ml de BSA), por 5 minutos, em
temperatura ambiente e, posteriormente, incubados em gotas de 100l, com 2,0mM
de 6-DMAP, em meio TALP-FIV, livre de Ca2+ e Mg2+, por 3 horas, 38,5C e 5% de
CO2. Aps o trmino do tratamento de ativao, os ocitos foram cultivados da
mesma maneira que os embries fecundados in vitro, como descrito a seguir.
35

5.3.4 Cultivo in vitro (CIV)

Aps os processos de MIV, FIV ou ativao, os zigotos foram cultivados in


vitro em meio CR2aa/SOF, suplementado com 2% de SFB e 5mg/ml de BSA, em
presena de monocamada de clulas da granulosa, onde permaneceram sob
incubao, em atmosfera com 5% de CO2, em ar, 38,5C durante 7 a 12 dias.

5.3.5 Estimativa de tamanho dos embries D9 e D12

Aps 9 e 12 dias de cultivo embrionrio, de cada sesso de PIV, foram


realizadas fotos digitais, no microscpio estereoscpico, para comparao do
tamanho dos embries fecundados e partenogenticos, em relao aos ocitos
existentes na placa. Foi considerado o tamanho mdio de um ocito de 100 m.

5.3.6 Avaliao e contagem do nmero de ncleos dos embries fecundados e


partenogenticos aps 9 dias de cultivo

A qualidade dos embries produzidos foi estimada mediante contagem de


ncleos dos embries fecundados e partenogenticos, nos estdios de blastocisto,
aps 9 dias de cultivo (n=72). Os embries foram transferidos do meio de cultivo
para uma soluo contendo paraformaldedo 3,7%, acrescido de 10% de TRITON
100X, onde foram fixados durante 1 hora. Posteriormente, foram lavados em
soluo de PBS, com 0,3% de BSA, por mais 1 hora. Sob soluo de glicerol
acrescida de Hoechst 33342 (1g/mL), os embries foram colocados entre lmina e
lamnula e observados em microscpio de epifluorescncia, sob excitao de
comprimento de onda de 380nm. Para o clculo dos ncleos corados foi utilizado o
programa computacional ImageJ (Java, 2005).
36

5.3.7 Transcrio reversa

Sessenta e seis blastocistos eclodidos D9 (33 fecundados in vitro e 33


partenogenticos) foram individualmente submetidos sntese de DNA
complementar (cDNA), por transcrio reversa (RT-PCR), utilizando o kit ImProm-
TM
II (Reverse Trascriptase Promega, Madison, WI, EUA).
Cada embrio foi incubado durante 5 minutos, 70C , com 1L de oligo(dT)
(0,5g/L) e 1L de gua livre de RNAse, e imediatamente resfriado 4C, para
adio de 5L de tampo de reao 5x, 1L de enzima transcriptase reversa
(Improm-II, Promega, EUA), 1L de dNTPs (10mM cada), 1L de RNAse OUT
(1U/L Invitrogen), em um volume final de 20 L. As amostras foram aquecidas
42C, por 1 hora, seguido de 70C, por 15 minutos e utilizadas, em seguida, na
reao de PCR em tempo real. O restante do cDNA foi armazenado -20C.

5.3.8 Avaliao do gene do IFN- pela PCR em Tempo Real de blastocistos


eclodidos FIV e partenogenticos

As amplificaes foram realizadas em termociclador para PCR em tempo real


(Applied Biosystems, 7500 Real Time PCR System). Nas reaes para quantificao
do gene do IFN- foi utilizada a colorao TaqMan Universal PCR Master Mix
(Applied Biosystems, Foster City, C A, EU A).
O GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) foi utilizado como
gene constitutivo, para normalizao dos dados. Os oligonucleotdeos iniciadores e
sondas utilizadas para mensurar a freqncia dos transcritos do GAPDH e do IFN-
esto apresentados na tabela 1.
37

Tabela 1. Seqncia dos primers e sondas utilizadas no experimento.

Gene Seqncia de primers

GAPDH F: 5'--3' AAGGCCATCACC ATCTTCC A

R: 5'--3' CCACTAC ATACTC AGC ACCAGC AT

S: 5'--3' VIC-AGCGAGATCCTGCCAAC ATC AAGTGG-TAMRA

IFN- F: 5'--3' CCT TCG TGC TCT CTC TAC TGA TG

R: 5'--3' CAG GTA AC A ACC CAG AGA TCG TC

S: 5'--3' FAM-CCG TAG CTG ACC AGC ACC-NFQ

Para a realizao da PCR em tempo real utilizaram-se 0,25 M da sonda


TaqMan e 0,9M de cada oligonucleotdeo iniciador, em reao de 20L, para
cada gene.
A reao te ve incio com incubao 50C, por 2 mi nutos, seguida de
desnaturao 95C, por 10 minutos e 55 ciclos de 95C, por 30 segundos e 60C,
por 45 segundos. Para as amplificaes por PCR do GAPDH e IFN- foram
utilizados 3L da soluo de cDNA total, de cada embrio, para cada tubo de
reao. Cada amostra foi avaliada em duplicata e toda reao de PCR continha um
controle livre de amostra.

5.3.9 PCR em tempo real

Para o clculo da eficincia da reao da PCR, foi utilizado o software


LinRegPCR (RAMAKERS et al., 2003), baseado na curva de amplificao
individual de cada tubo (Rn).
Foram estabelecidos os limites inferior e superior (janela de linearidade), em
que as amostras estejam em fase logartmica, mnimo de 4 pontos includos na
regresso e alta correlao (Figura 1). A partir deste intervalo, foram calculados a
eficincia e o threshold, que o ponto mdio dos limites determinados.
Utilizando-se o threshold calculado para cada gene, determinaram-se os
valores dos CTs de cada amostra no programa 7500 System SDS Software. A
38

quantificao final da expresso relativa dos genes de interesse foi realizada


utilizando-se a comparao dos CTs, de acordo com a eficincia individual de cada
reao (SCHEFE et al., 2006). Os clculos foram baseados na diferena dos CTs do
gene alvo (IFN-) e do gene controle endgeno (GAPDH), com normalizao dos
dados, realizada com os transcritos do gene GAPDH, e calibrado com um indivduo
(sesso 4).

Figura 1. Exemplo de anlise da curva de eficincia para cada poo individual


atravs do software LinRegPCR, onde as linhas azuis do grfico
superior indicam intervalo analisado da curva de amplificao em sua
fase exponencial, e o grfico inferior mostra as eficincias calculadas

5.3.10 Anlise estatstica da PIV, contagem do nmero de ncleos e


expresso relativa do gene do IFN- de embries FIV e
partenogenticos.

Os resultados foram analisados com o auxlio do programa computacional


Statistical Analysis System (SAS, 2001). A normalidade dos resduos e a
homogeneidade das varincias entre os tratamentos foram previamente verificadas
39

pelo Teste de Shapiro-Wilk (PROC UNIVARIATE) e Teste de Hartley (OTT, 1983),


respectivamente.
Obedecendo-se s premissas estatsticas citadas, os dados foram submetidos
anlise de varincia pelo General Linear Model (PROC GLM). Quando observada
diferena significativa entre as sesses (P<0,05), as suas mdias foram comparadas
pelo teste de Tukey, e diferenas entre os tratamentos pelo teste F, a um nvel de
significncia de 5%.
As variveis respostas: taxa de clivagem, taxa de blastocisto, taxa de
blastocisto eclodido, nmero de ncleos e expresso relativa do gene do IFN- foram
submetidas s anlises descritas acima.
O modelo matemtico utilizado para o clculo de cada varivel dependente foi
a soma do efeito da sesso com o efeito do tratamento e o efeito da interao entre
ambos (sesso x tratamento).

5.3.11 Imunocitoqumica para observao da presena do IFN- em embries


eclodidos

Aps 9 dias de cultivo, embries fecundados in vitro (n=33) e


partenogenticos (n=33) foram inicialmente lavados em gotas de 100 l de PBS com
0,1% de PVP (10ml/0,01g) e fixados posteriormente a 3,7% de paraformaldedo.
Em seguida foram lavados novamente e permeabilizados com 0,5% de Triton
100X, 0,1% de citrato de sdio em PBS a 0,1% PVP por 1 hora temperatura
ambiente, lavados novamente e pr-incubados com tampo de bloqueamento
(2%BSA, 0,2% leite em p desnatado, 2% soro de cabra e 0,8%Triton X-100 em
PBS a 0,1% de PVP) tambm por 1 hora.
Aps esse perodo, foi feita a primeira incubao com anticorpo de coelho
anti-IFN- em PBS (1:100). Todos foram lavados e incubados com o anticorpo
secundrio (anti-IgG de coelho) na mesma concentrao do anticorpo primrio.
Todas as incubaes foram realizadas por uma hora temperatura ambiente e as
lavagens em trs gotas de soluo PBS a 0,1% PVP.
40

5.3.12 Eletroforese unidimensional e Western blotting

Para deteco da protena do IFN-, por Western b lotting, foram produzidos


in vitro tanto embries fecundados, quanto partenogenticos. No 9 dia de cultivo
embrionrio (D9), os blastocistos eclodidos foram transferidos aleatoriamente para
gotas de 35L, com meio SOF, suplementado com 10% de SFB e cultivados em
grupos de seis embries at o 12 dia (D12).
Quinze embries fecundados D12, quinze partenogenticos D12, 10 L do
meio de cultivo 10% SFB do grupo fecundado , 10 L do meio de cultivo 10% do
grupo partenogentico e meio de cultivo sem embries foram submetidos
eletroforese unidimensional em gel de poliacrilamida 12% (SDS-PAGE).
As amostras foram submetidas eletroforese unidimensional em gel de
poliacrilamida 12% e as protenas transferidas durante uma hora para uma
membrana de difluorido de polivinilideno (PVDF; H ybond-P, GE Healthcare UK Ltd,
Little Chalfont, Buckinghamshire HP7 9NA, UK) pelo mtodo semi-seco. Incubou-se
cada membrana com soluo bloqueadora (leite em p desnatado 5% em soluo
tampo de Tris-salina 10 mM Tris, 0,16 Molar NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,6; TBST)
por 8 a 12 horas em mesa refrigerada 4C. Em seguida, cada membrana foi
incubada por duas horas, com um anticorpo anti-bIFN- diludo a 1:2000, em soluo
bloqueadora, doado gentilmente pelo Dr. Michael Roberts (Universidade do Missouri,
USA). Aps lavagem com TBST, procedeu-se a incubao com anticorpo secundrio
diludo a 1:33.000 em TBST por uma hora. A deteco do bIFN- foi feita pela
incubao das membranas com os reagentes do kit de deteco de
quimiluminescncia ECL-Plus (GE Healthcare UK Ltd, Little Chalfont,
Buckinghamshire HP7 9NA, UK) e e xposio a filmes radiogrficos.
As imagens digitalizadas dos filmes radiogrficos foram submetidas anlise
densitomtrica pelo software ImageMaster 1D v.4.10 (Pharmacia Biotech Inc., USA)
para determinao das densidades pticas das bandas proticas detectadas e o
clculo dos seus pesos moleculares.
41

5.4 SEGUNDA E TERCEIRA ETAPAS

5.4.1 Sincronizao do ciclo estral das receptoras de embries

Para as transferncia dos embries (TE) da segunda e terceira etapas, foram


utilizadas 239 fmeas nulparas, provenientes de cruzamento ( zebu e europeu),
com no mnimo 350 kg de peso vivo e com exames de brucelose e tuberculose
negativos, mantidas em sistema de pastagem, formada por Brachiaria brizanta var
marandu, com suplementao mineral e gua ad lib itum.
Para a sincronizao do ciclo estral das fmeas, foram utilizados agentes
farmacolgicos que possibilitaram a transferncia dos embries em tempo fixo
(TETF), isto , sem a necessidade de observao do cio.
Os animais receberam implantes auriculares silsticos (Crestar), contendo 3
mg de norgestomet, associados a uma injeo intramuscular com 2 mg de benzoato
de estradiol (BE) para obteno de uma nova onda folicular.
As fmeas permaneceram com os implantes, durante um perodo de 8 dias e,
no dia da remoo dos implantes (D8), todos os animais receberam uma aplicao
intramuscular de 7,5 mg de luprostiol (Prosolvin), para assegurar a lutelise e, 24
horas depois, receberam uma dose intramuscular de 1,0 mg de BE, como agente
sincronizador das ovulaes.

5.4.2 Aspirao folicular in vivo guiada por ultra-sonografia

A aspirao folicular in vivo foi realizada utilizando um aparelho de ultra-


sonografia, modelo Aloka SSD 500, equipado com transdutor setorial intravaginal de
5MHz e dispositivo-guia para puno folicular. Foi realizada anestesia epidural nas
doadoras (lidocana 2%) e os folculos, com dimetro superior a trs milmetros,
foram identificados e puncionados, utilizando-se agulhas 18G e presso de vcuo de
80 mmHg, (aproximadamente 14ml de gua/minuto). O lquido folicular aspirado foi
inicialmente recuperado em tubos de 50ml, contendo de 10 a 15 ml de DPBS,
acrescido de 10% de soro fetal bovino e 10UI/ml de heparina e os ocitos foram
posteriormente separados em filtro de coleta de embries (75m).
42

5.4.3 Superovulao e colheita de embries fecundados in vivo

Para obteno dos embries fecundados in vivo, doadoras das raas Nelore e
Gir foram superovuladas no 10 dia do ciclo estral com FSH (Pluset, Serono
Veterinria) na dosagem de 350 UI, fracionada em oito doses, administradas a cada
12 horas, por via IM. Cada fmea recebeu duas doses IM de 1,0 mg de PGF2 , aps
60 e 72h do incio da superovulao e foi submetida a duas inseminaes artificiais.
Os embries foram coletados no stimo dia aps a IA, em meio DPBS, e
foram eqitativamente distribudos e inovulados nas receptoras, associados ou no
com embries partenogenticos.

5.4.4 Transferncia dos embries (TE)

De acordo com a classificao da Sociedade Internacional de Transferncia


de embries (IETS, 1998), os embries graus 1 e 2 foram transferidos para as
fmeas nulparas aptas inovulao.
Para proporcionar uma diviso eqitativa entre os grupos, as receptoras
(figura 2) foram divididas em funo do escore de condio corporal, conforme
(RICHARDS et al., 1986) e em funo da atividade ovariana, utilizando-se a
classificao de 1, 2 ou 3 (MADUREIRA et al.,1987).

1) Fmeas ciclando, com ovrios com comprimento acima de 30mm, macios


com presena de CL ou tero com turgidez acentuada denotando a presena de
folculos grandes (> 10mm).

2) Fmeas que possuem ovrios com comprimento entre 15-30 mm, ausncia
de CL e turgidez no tero. Incluem-se, nesta categoria, fmeas cujos folculos
atingem a fase de dominncia ( 8,5mm) mas no ovulam.

3) Fmeas que possuem ovrios pequenos, duros e lisos. Nesta categoria


so includas fmeas cujos folculos no chegam at a divergncia.
43

Figura 2. Exemplo do padro racial das receptoras utilizadas na Fazenda Araqu,


Charqueada (SP).

5.4.5 Diagnstico de prenhez e avaliao das perdas embrionrias

Aps 23 28 dias da data da TE, foi realizado o diagnstico de gestao, via


retal, mediante exame ultra-sonogrfico, com utilizao do aparelho ALOKA SSD
500 e um transdutor linear (5MHz), para verificao da presena do concepto e
batimento cardaco. Entre 53 e 60 dias de gestao, foi realizada novamente a ultra-
sonografia, para avaliao das perdas embrionrias ocorridas no perodo.

5.4.6 Anlise estatstica das taxas de prenhez

A comparao das taxas de prenhez entre G1 e G2, e entre G3 e G4, foram


analisadas com o auxlio do programa computacional Statistical Analysis System
(SAS, 2001). A normalidade dos resduos e a homogeneidade das varincias entre
os tratamentos foram previamente verificadas pelo Teste de Shapiro-Wilk (PROC
UNIVARIATE) e Teste de Hartley (OTT, 1983), respectivamente.
Obedecendo-se s premissas estatsticas citadas, os dados foram submetidos
anlise de varincia pelo General Linear Model (PROC GLM). Quando observada
diferena significativa entre as sesses (P<0,05), as suas mdias foram comparadas
pelo teste de Tukey, e diferenas entre os tratamentos pelo teste F, a um nvel de
significncia de 5%.
44

As variveis respostas: taxas de prenhez aos 30 dias e taxas de prenhez aos


60 dias foram submetidas s anlises descritas acima para cada grupo experimental.

5.4.7 Colheita de concepto partenogentico aos 21 dias de gestao

Sete novilhas inovuladas com 2 embries partenogenticos foram abatidas


aps 14 dias da data da TE, para confirmao da sobrevivncia do concepto
partenogentico. As novilhas tiveram seus teros recolhidos ps abate e levados ao
LMMD 4C.
45

6 RESULTADOS

A seguir, sero apresentados os resultados da primeira, segunda e terceira


etapas.

6.1 PRIMEIRA ETAPA

6.1.1 Taxas de clivagem, taxas de blastocisto, taxas de blastocisto eclodido,


contagem de nmero de ncleos e expresso relativa do gene do IFN-
de embries fecundados in vitro e partenogenticos.

Os resultados da produo in vitro dos embries bovinos so apresentados na


tabela 2, segundo tratamento (fecundao ou ativao partenogentica) e dia da
sesso de produo embrionria, bem como da interao entre ambos, porque
constituem os resultados diretamente ligados ao objetivo do presente estudo.
Para a taxa de clivagem, houve interao entre sesso embrionria e
tratamento (P=0,004). Assim, nas sesses 2, 4 e 5, houve efeito de sesses de
produo embrionria dentro do tratamento para os embries fecundados, mas no
houve efeito de sesso dentro do tratamento para os embries partenogenticos,
As taxas de clivagem, resultantes do tratamento para os embries fecundados
in vitro e partenogenticos, foram de 69,7% e 58,8%, respectivamente.
46

Tabela 2 - Taxas de clivagem, blastocisto e blastocisto eclodido de embries bovinos


submetidos a 6 sesses de produo embrionria, segundo tratamento
in vitro: fecundao (FIV) ou ati vao partenogentica.

Interaes
Sesso Tratamento Clivagem Blastocisto Eclodido
(%) (%) (%)
1 FIV (n=135) 65,1 37,0 23,7
1 ATIVAO (n=145) 62,0 31,0 17,9
a
2 FIV (n=130) 83,8 45,3 30,0
2 ATIVAO (n=92) 63,0 b 25,0 14,1
3 FIV (n=201) 64,1 32,3 17,4
3 ATIVAO (n=188) 63,8 34,0 15,9
4 FIV (n=125) 80,0 m 36,0 18,4
n
4 ATIVAO (n=133) 53,3 36,0 14,2
x
5 FIV (n=151) 66,2 38,4 20,5
5 ATIVAO (n=143) 52,4 y 26,5 13,9
6 FIV (n=168) 64,8 43,4 20,8
6 ATIVAO (n=140) 58,5 41,4 16,4
Efeitos principais
1 (n=280) 63,5 33,9 20,7
2 (n=222) 75,1 36,9 23,4
3 (n=389) 64,0 33,1 16,7
4 (n=258) 66,2 36,0 16,2
5 (n=294) 59,5 32,6 17,3
6 (n=308) 62,0 42,5 18,8
FIV (n=910) 69,7 38,4a 21,4a
ATIVAO (n=841) 58,8 32,8b 15,5b
Probabilidades
Sesso 0,024 0,116 0,447
Tratamento 0,001 0,005 0,001
Sesso x Trat 0,004 0,074 0,406
47

100
2 1,2
a
80 a
2,3 1 3 1 2,3 3
CLIVAGEM (%)

1 1
a a b a a 1 a 1 a
60 a
b b F
A
40

20

0
1 2 3 4 5 6
SESSES

Figura 3 - Efeito do tratam ento para taxa de clivagem (F: fecundao; A: ati vao
partenogentica) durante 6 s ess es de produo em brionria. a,b -
colunas com letras diferentes s obres critas diferem tratam ento dentro da
s esso; 1,2,3 - colunas com nm eros diferentes s obres critos diferem
s esso dentro de tratam ento.

Para taxa de blas tocis to, no houve interao envolvendo as variveis ,


s esso em brionria e tratamento (P=0,074), no houve efeito de s esso (P=0,116) e
houve efeito de tratam ento. As taxas de blas tocis to foram de 38,4% para os
fecundados , e de 32,8% para os partenogenticos (P=0,059).
Para a taxa de eclos o, no houve interao envolvendo as variveis ,
s esso em brionria e tratamento (P=0,406), no houve efeito de s esso (P=0,447) e
houve efeito de tratam ento. As taxas de blas tocis to eclodido foram de 21,4 % para
os fecundados , e de 15,5 % para os partenogenticos (P=0,001).
Os resultados da contagem do nm ero de ncleos e express o relativa do

gene do IFN- dos em bries fecundados in vitro e partenogenticos s o


apres entados na tabela 3.
48

Tabela 3 - Nmero de ncleos e express o relativa do gene do IFN- de em bries


bovinos s ubm etidos a 6 sess es de produo em brionria, segundo
tratam ento in vitro (fertilizao ou ativao partenogentica).

Interaes
Sesso Tratamento Nmero de Expresso relativa
ncleos do gene IFN-
1 FIV (n=6) 219,3 26,5 -2,200 0,90
1 AT IVAO (n=6) 186,5 61,8 -0,900 0,05
2 FIV (n=6) 259,5 44,9 -1,680 0,77
2 AT IVAO (n=6) 146,8 26,3 -1,098 0,21
3 FIV (n=6) 205,1 45,7 1,020 0,44
3 AT IVAO (n=6) 142,6 39,6 1,700 0,22
4 FIV (n=6) 240,8 74,5 0,060 0,01
4 AT IVAO (n=6) 143,3 58,0 0,120 0,88
5 FIV (n=6) 217,3 47,0 1,300 0,76
5 AT IVAO (n=6) 172,1 92,5 1,760 0,61
6 FIV (n=6) 244,1 79,8 1,300 0,87
6 AT IVAO (n=6) 136,0 27,3 1,580 0,98
Efeitos principais
c
1 (n=12) 202,9 44,1 -1,550 0,47
c
2 (n=12) 203,1 35,6 -1,389 0,49
a
3 (n=12) 173,8 42,6 1,360 0,33
b
4 (n=12) 192,0 66,2 0,090 0,44
a
5 (n=12) 194,7 69,7 1,530 0,68
a
6 (n=12) 190,0 53,5 1,440 0,92
a x
FIV (n=36) 231,0 53,0 -0,033 0,62
b y
AT IVAO (n=36) 156,0 50,9 0,527 0,48
Probabilidades
Sesso 0,220 0,001
Tratam ento 0,001 0,001
Sesso x Trat 0,102 0,074
49

Para a varivel dependente, nm ero de ncleos , no houve interao


envolvendo as variveis , s ess o embrionria e tratamento (P=0,102). No houve
efeito de s esso (P=0,220), mas houve efeito de tratam ento, com mdias de 231
53 ncleos para os em bries fecundados , e de 156 50 ncleos para os
partenogenticos (P=0,001).

Para com parao das m dias da express o relativa do gene do IFN- entre
embries fecundados in vitro e partenogenticos , no houve interao envolvendo
as variveis , s esso em brionria e tratam ento (P=0,074). Houve efeito de sess o
(P=0,001), e tambm houve efeito de tratam ento (P=0,001), com m dias de

express o gnica de (-0,033 ) para os fecundados , e de (0,527 ) para os


partenogenticos .
2
Para determ inar a curva padro e o clculo do R (Figura 5), foram realizadas

diluies s eriadas de cDNA, tanto para o gene GAPDH quanto para o gene do IFN-

a b
Figura 4. Curva padro correspondente aos genes GAPDH (a) IFN- (b) em
2 2
diferentes diluies . a) R =0,9831; b) R =0,9896

6.1.2 Estimativa do dimetro de embries fecundados e partenogenticos.

Com o resultados com plem entares aos objetivos diretos no pres ente trabalho,
foi realizada a es timativa do tam anho do dim etro de embries fecundados e
partenogenticos .
No nono dia de cultivo em brionrio, conform e a figura 6, verificou-se que os
embries fecundados tm dim etro mdio de 160 25 m , enquanto os
partenogenticos , mdia de 170 37 m , e es tes dimetros no diferiram (P>0,05).
50

Aps doze dias de cultivo, conform e a figura 7, as m dias dos embries


fecundados e partenogenticos , foram de 530 30 m e 520 33 m
respectivamente, e tambm no houve diferena entre os dim etros (P>0,05).

a b

Figura 5. Cultivo em brionrio aos 9 dias . O dim etro do em brio (e) foi es tim ado em
comparao com o do ocito (s etas ) colocado no m omento da foto. A)
Fecundao in vitro; B) Ati vao partenogentica. Barras repres entam 100
m .

a b

Figura 6. Cultivo em brionrio aos 12 dias . O dim etro do em brio (e) foi es timado
em com parao com o do ocito (s etas ) colocado no mom ento da foto. A)
Fecundao in vitro; B) Ativao partenogentica. Barras representam 100
m . Dentro do crculo um blas tocis to de 620 m .
51

6.1.3 Imunocito qumica

Conform e a figura 8, a presena de clulas produtoras de IFN- foi detectada,


pela tcnica de imunocitoqum ica, tanto nos embries fecundados in vitro, quanto
nos partenogenticos .

6.1.4 Identificao do IFN- pela tcnica do Western blotting

Uma banda com 24kDa foi detectada nas amos tras dos m eios de cultivo
embrionrio dos em bries fecundados e nos meios dos partenogenticos , mas no
foi detectado nas am os tras que continham os em bries (Figura 9).

24 kDa

19 kDa

A B C D E F G
Figura 7. Western b lotting para deteco da protena do IFN- em m eios de cultivo
onde perm aneceram s eis em bries do D9 ao D12. A) Controle negativo;
B) Quinze em bries FIV D12; C) Quinze em bries partenogenticos D12;
D) Meio de cultivo dos em bries FIV; E) Meio de cultivo dos em bries
partenogenticos ; F) Meio de cultivo com 10% SFB e G) rIFN-.
52

a1 b1 c1

a2 b2 c2

d1 e1 f1

d2 e2 f2

Figura 8. Blas tocis tos eclodidos aps 9 dias de cultivo. A, B e C: Fecundados ; D, E e


F: partenogenticos . As letras corres pondem aos indivduos . 1) colorao
em Hoes ch (azul), para contagem do nmero de ncleos . 2)
Im unocitoqumica (verm elho), para deteco de clulas produtoras de IFN-
.
53

6.1.5 Nmero de ncleos dos embries fecundados e partenogenticos no 7


dia de cult ivo.

Na Tabela 4 es t apresentada o nm ero de ncleos dos embries fecundados

e partenogenticos , no 7 dia de cultivo.

Tabela 4. Nm ero de ncleos dos em bries fecundados e partenogenticos , no


es tdio de blas tocis to, aps 7 dias de cultivo.

Gru po Ncleos totais ( DP)

109,0 25,2
FIV (n=20) a

98,7 59,2
Partenogenticos (n=20) b

.
b

Figura 9. Blas tocis tos aps 7 dias de cultivo: a) fecundados b) partenogenticos


54

6.1.6 Expresso relativa do gene d o IFN- de embrio partenogentico colhid o


aos 21 dias de gestao

A e xpress o relativa do gene do IFN-, de em brio colhido aos 21 dias de


ges tao, es t apres entada na figura 10. Em relao ao gene endgeno GAPDH, o
partenogentico express ou o gene do IFN- aos 21 dias de des envolvim ento.

A
B

Figura 10. Amplificao relativa do gene do IFN- em relao ao GAPDH de em brio


partenogentico aos 21 dias . A) IFN- ; B) G APDH.

6.2 SEGUNDA ETAP A

6.2.1 Taxas de prenhez aos 30 dias (TP 30d) e aos 60 dias (TP 60d), para
embries fecundados in vitro, associados ou no a um embrio
partenogentico.

Os res ultados das TP 30 dias e TP 60 dias so apres entados na tabela 5,

s egundo sess o de trans ferncia de embries e tratamento, bem como da interao

entre am bos , porque se cons tituem nos resultados diretam ente ligados ao objetivo

do pres ente es tudo.


55

Tabela 5 - Taxas de prenhez (TP 30d e TP 60d) em receptoras bovinas


nulparas , s egundo s ess o de PIV e tratam ento.
Interaes
Sesso Tratamento TP 30d (%) TP 60d (%)

1 G1 (n=09) 22,2 11,1


1 G2 (n=09) 11,1 11,1
2 G1 (n= 07) 14,2 14,2
2 G2 (n=07) 14,2 14,2
3 G1 (n= 05) 60,0 60,0
3 G2 (n=05) 20,0 20,0
4 G1 (n=05) 60,0 60,0
4 G2 (n=05) 40,0 40,0
5 G1 (n=16) 40,0 13,3
5 G2 (n=15) 12,5 12,5
6 G1 (n=15) 31,2 25,0
6 G2 (n=16) 66,6 46,6
7 G1 (n=08) 57,1 42,8
7 G2 (n=07) 62,5 62,5
8 G1 (n=21) 35,2 17,6
8 G2 (n=17) 23,8 19,0
Efeitos principais
b b
1 (n= 18) 16,6 11,1
b b
2 (n=14) 14,2 14,2
3 (n=10) 40,0 a,b 40,0 a,b
4 (n=10) 50,0 a,b 50,0 a,b
b b
5 (n=31) 25,8 12,9
6 (n=31) 48,3 a,b 35,4 a,b

a b
7 (n=15) 60,0 52,6
a,b
8 (n=38) 28,9 18,4 a,b
G1 (n=86) 31,3 24,6
G2 (n=81) 37,0 28,2
Probabilidades
Sesso 0,033 0,003
Tratamento 0,281 0,924
Sesso x Trat 0,195 0,463
G1) inovulao com 1 embrio fecundado in vitro; G2) inovulao com 1 embrio
fecundado in vitro, associado a 1 embrio partenogentico.
56

Para a taxa de prenhez aos 30 dias , no houve interao (P=0,195) entre


s esso de PIV e tratam ento (inovulao com 1 embrio fecundado in vitro, ou
inovulao com 1 em brio fecundado in vitro, ass ociado a 1 em brio
partenogentico.
Houve efeito da s esso da PIV (P=0,033) e no houve diferena s ignificativa
entre as TP 30 dias , res ultantes da inovulao de apenas 1 em brio fertilizado in
vitro, ou associado a um em brio partenogentico.
A taxa de prenhez aos 30 dias , para o G1 foi de 31,3% e, para o G2, de
37,0% (P=0,281).
Para a taxa de prenhez aos 60 dias , no houve interao (P=0,463) entre
s esso de PIV e tratam ento.
Houve efeito da sess o da PIV (P=0.003), e no houve diferena s ignificativa
entre as TP 60 dias , res ultantes da inovulao de apenas 1 em brio fertilizado in
vitro, ou associado a um em brio partenogentico (P=0,924).
As taxas de prenhez aos 60 dias para o G1 e G2 foram 24.6% e 28.2%,
respectivamente.

6.3 T ERCEIRA ET AP A

6.3.1 Taxas de prenhez aos 30 dias (TP 30d) e aos 60 dias (TP 60d), para
embries fecundados in vivo, associados ou no a um embrio
partenogentico.

Os res ultados das TP 30 dias e TP 60 dias so apres entados na tabela 6,


s egundo s esso de trans ferncia de em bries e tipo de tratam ento, bem com o da
interao entre ambos , porque s e cons tituem os res ultados diretamente ligados ao
objetivo do presente es tudo.
57

Tabela 6 - Taxas de prenhez (TP 30d e TP 60d) em receptoras bovinas nuliparas ,


s egundo s ess o de TE e tratam ento.

Interaes
Sesso Tratamento TP 30d ( %) TP 60d ( %)
1 G3 (n=19) 68,4 61,1
1 G4 (n=19) 68,4 66,6
2 G3 (n=12) 50,0 25,0
2 G4 (n=12) 75,0 50,0
3 G3 (n=05) 20,0 10,0
3 G4 (n=05) 100,0 75,0
Efeitos principais
1 (n=38) 68,4 65,7
2 (n=24) 62,5 37,5
3 (n=10) 60,0 40,0
a x
G3 (n=36) 55,5 44,4
b y
G4 (n=36) 75,0 61,1
Probabilidades
Sesso 0,824 0,064
Tratam ento 0,007 0,084
Sesso x Trat 0,056 0,535
G3) inovulao com 1 embrio fecundado in vivo; G4) inovulao com 1 em brio
fecundado in vivo ass ociado a 1 embrio partenogentico .

Para a taxa de prenhez aos 30 dias , no houve interao (P=0,056) entre


s esso de TE e tratamento.
No houve efeito da sess o da TE (P=0.824) e houve diferena s ignificativa
entre as TP 30 dias resultantes da inovulao de apenas 1 embrio fertilizado in vivo
ou ass ociado com um embrio partenogentico .
A ta xa de prenhez aos 30 dias para os anim ais do G3 foi de 55,5% e, para o
G4 de 75,0%(P=0,007).
Para a taxa de prenhez aos 60 dias , no houve interao (P=0,535)
envolvendo as variveis , sess o de TE e tratam ento.
58

No houve efeito da sess o da TE (P=0,064), e no houve diferena


s ignificativa entre as TP 60 dias , res ultantes da inovulao de apenas 1 em brio
fertilizado in vivo, ou associado a um em brio partenogentico (P=0,084).
As taxas de prenhez aos 60 dias para os anim ais do G3 e G4 foram 44,4% e
61,1%, res pectivam ente.

6.4 NAS CIM ENT OS DE BEZ ERROS P RO DUZIDOS IN VITRO

Foi m onitorado o nas cimento dos dois primeiros nas cim entos pertencentes a
es te trabalho, o prim eiro bezerro pertencente ao G1, e nas ceu aos 287 dias com 28
kg, e o s egundo bezerro, originrio do G2, nas ceu aos 296 dias com 34 kg (Figura
12).

a b

c d

Figura 11. Figura a: Bezerros produzidos in vitro originrios do G1 e G2 (da


esquerda para direita). Figura b: Doadora dos ocitos com os bezerros .
Figura c: Receptora do G1 com bezerro; Figura d: Receptora do G2 com
o bezerro.
59

Nas tabelas 7 e 8 es to apres entados raa, s exo, pes os e dias de ges tao dos
anim ais nas cidos pertencentes ao G1 e G2.

Tabela 7. Raa, s exo, pes o e dias de ges tao dos animais corres pondentes ao
grupo dos em bries fecundados in vitro (G1)

Gru po Raa Sexo Peso (Kg) Dias de Gestao


G1 Gir Macho 28 287
G1 Gir Fm ea 22 284
G1 Gir Fm ea 25 288
G1 Gir Macho 25 290
G1 Girolando Macho 27 296
G1 Girolando Macho 31 297
Mdia 26,3 1,2 290,3 1,1

Tabela 8. Raa, s exo, pes o e dias de ges tao dos animais corres pondentes ao
grupo dos em bries fecundados in vitro associados a
partenogenticos (G2)

Grupo Raa Sexo Peso (Kg) Dias de Gestao


G2 Gir Macho 34 296
G2 Gir Macho 30 299
G2 Gir Fm ea 25 290
G2 Gir Fm ea 26 288
G2 Girolando Macho 31 297
G2 Girolando Macho 29 296
G2 Girolando Fm ea 27 284
Mdia 28,8 2,1 292,8 2,1

As mdias do peso ao nas cim ento dos animais pertencentes ao G1 e G2


foram de 26,3 Kg 1,2 e 28,8 Kg 2,1 (P=0,41) respectivam ente. As mdias dos
dias de ges tao das receptoras dos grupos G1 e G2 foram de 290 dias 1,1 e
292,8 dias 2,1 (P=0,34) respectivamente.
60

7 DIS CUSSO

Na prim eira etapa experimental, foram realizadas tcnicas que perm itissem
comprovar que o em brio partenogentico seria capaz de express ar o gene e

s ecretar a protena do IFN-.


Na s egunda e terceira etapas , o objetivo foi avaliar o efeito na taxa de
prenhez de receptoras bovinas nulparas , aps trans ferncia de em bries
fecundados in vitro, ou in vivo, ass ociados ou no a um em brio partenogentico.
Na primeira etapa, os resultados obtidos foram apres entados para as mdias
das taxas de clivagem , de blas tocis to, de blas tocis to eclodido, de nmero de ncleos
e express o relativa do gene do IFN-, e indicam que podem exis tir diferenas entre
embries fecundados e partenogenticos , dependendo da varivel analisada.
Es tas diferenas podem exis tir em funo da s ess o de produo
embrionria, j que os res ultados das variveis acim a citadas , foram calculados em
funo do dia, em que s e iniciava uma s ess o de produo in vitro de em bries , e o
delineamento pros pectivo utilizado des ta etapa trabalho foi realizado em arranjo
fatorial 6x2.
Com parou-s e a m dia das taxas de clivagem entre os tratam entos , e ao final
das s eis s ess es de produo em brionria, houve diferena entre as mdias de
clivagem , e es tes resultados es to de acordo com os res ultados de Kubish et al,
2003.
A diferena na taxa de clivagem , entre em bries fecundados e
partenogenticos ocorreu nas sess es 2, 4 e 5 (P<0,001), e no houve diferena
nas sess es 1, 3 e 6 (P>0,05).
Ao analis ar os res ultados de cada tratam ento, as taxas de clivagem dos
embries fecundados diferiram no decorrer das s ess es , enquanto para os em bries
partenogenticos , no s e obs ervou diferena no nm ero de em bries clivados entre
as s esses .
Houve tambm diferenas nas taxas de blas tocis to (P=0,005) e blas tocis to
expandido (P=0,001), entre os em bries fecundados e partenogenticos , diferenas
tam bm encontradas por Kubish et. al, 2003.
Para avaliar os em bries partenogenticos , foram realizadas as contagens
dos nm eros de ncleos , no 9 dia de desenvolvim ento, e comparadas com os
embries fecundados in vitro (P=0,001).
61

Os resultados obtidos nes te trabalho, es to de acordo com Uranga e


Arechaga (1997), Van de Velde et al. (1999), Kubis ch et al. (2003), que o em brio
partenogentico poss ui m enor nmero de clulas , com parado ao em brio produzido
por fecundao in vitro.
Em relao aos res ultados apres entados para a express o relativa do gene

do IFN-, para os em bries fecundados e partenogenticos , no houve interao


entre as variveis (P=0,074), mas observou-se que houve efeito da sess o de
produo em brionria (P=0,001), e houve tam bm efeito de tratamento. Os

embries partenogenticos express aram s ignificativam ente m ais o gene do IFN-,


em relao aos em bries fecundados in vitro no 9 dia (P=0,001).
Nes te trabalho, o efeito principal da rotina de produo dos embries ,
influenciou a express o do gene do IFN-, tanto para os partenogenticos , quanto os
fecundados in vitro. Is to sugere que os embries produzidos in vitro podem

express ar de maneira dis tinta o gene do IFN-, de acordo com a s ess o em que
es tes embries foram produzidos .
Outro ponto a s er dis cutido, o s exo dos em bries fecundados in vitro em

relao produo de IFN-. Em 2001, Larson et al. afirm aram que blas tocis tos
fm eas produzem um a concentrao m aior de protenas de IFN-, em relao
produo dos blas tocis tos m achos , cultivados nas m esm as condies . Os autores
s ugeriram que a expresso do gene do IFN- no afetada pela falta do
cromoss om o paterno.
Em outros trabalhos , os autores com pararam a concentrao em meios de

cultura de INF- de em bries partenogenticos e fecundados e tam bm concluram


que os em bries partenogenticos secretaram uma quantidade s im ilar de IFN- em
relao aos embries do s exo fem inino, e o dobro em relao aos em bries do s exo
m as culino (KUBISCH et al., 2003; RAS MUSSEN e JOHNSON, 2003).
No pres ente trabalho, em bries fecundados e partenogenticos , cultivados
por 12 dias , e os m eios de cultivo onde perm aneceram os em bries , foram

s ubm etidos tcnica de Western-blotting para deteco da protena do IFN-. Foi


detectada um a banda com 24kDa, nas am os tras dos meios de cultivo em brionrio
dos em bries fecundados , e nos m eios dos partenogenticos , m as no foi
obs ervado es ta banda nos extratos em brionrios .
62

Es tes resultados sugerem que os em bries s ecretam a protena do IFN-, e


no a arm azenam em quantidades s uficientes , para ser detectadas pelo mtodo
aplicado nes ta tese.
O rIFN- apres entou um pes o molecular de 19kDa, condizente com outros
relatos (Michael et al., 2006). Verificou-se que a banda protica correspondente ao
IFN-, encontrada nos m eios de cultivo, onde perm aneceram os em bries
fecundados e nos meios dos partenogenticos , apres entaram um pes o molecular
m dio de 24 kDa, m esmo res ultado de outros trabalhos (Bartol et al., 1985; Godkin
et al., 1988).
Conform e as equipes de Bartol (1985); Geis ert (1988) e Kubis ch (2003), as

clulas do trofoblas to iniciam a secreo da protena do IFN- a partir do dcim o dia


de des envolvim ento, atingindo o pico mxim o entre os dias 17 e 22 de ges tao.
Com o res ultados com plem entares aos objetivos diretos no pres ente
trabalho, ainda na prim eira etapa experimental, detectaram -s e as clulas produtoras
de IFN-, mediante im unocitoqumica dos embries fecundados in vitro e
partenogenticos no es tdio de blas tocis to eclodido.
Segundo Johns on et al. (2006), as clulas do trofoblas to, res pons veis pela

produo do IFN-, es to localizadas em m aior concentrao adjacente m ass a


celular interna. Os autores realizaram a m icros copia confocal de um blas tocis to
fecundado in vitro no 7 dia, e obtiveram um a im agem que permitiu chegar a ess a

concluso, em bora foi obs ervada pres ena de clulas produtoras de IFN- em toda
extens o do em brio.
No presente trabalho, foi es tim ado o dim etro de blas tocis tos
partenogenticos e fecundados in vitro. Aps 9 dias de cultivo, no houve diferena
(P>0,05) entre os dim etros dos em bries partenogenticos e fecundados , e no 12
dia de cultivo os dim etros es tavam m aiores em relao ao nono dia, porm ,
tam bm no houve diferena entre o dim etro dos em bries (P>0,05).
Dess a form a, no h diferena do tam anho do em brio partenogentico em
relao aos fecundados in vitro at o 12 dia de des envolvim ento, e com o a inibio
da lutelis e es t relacionada com a produo de IFN-, e es ta inibio depende da
rea do endom trio ocupada pelo concepto, em bries menos des envolvidos tm
m enor chance de s obrevivncia (BINELLI et al., 2001).
63

Com relao contagem do nm ero de ncleos no 7 dia, o objetivo foi


comprovar que os em bries partenogenticos eram viveis de s er trans feridos
juntam ente com os em bries fecundados , pelo m enos com nmero m nimo de
clulas que jus tificass e a inovulao.
Es pera-s e que nos embries partenogenticos , os genes de express o
m aterna comportem -s e de maneira s emelhante aos fecundados in vitro ou in vivo, e

dess a form a, expressem o gene do IFN- e incrementem as taxas de prenhez,


embora com um m enor nm ero de clulas , em relao aos fecundados , no dia da
inovulao.
Porm , na segunda etapa do pres ente experim ento, no foram observadas
diferenas es tats ticas nas taxas de prenhez aos 30 e 60 dias de ges tao, do total
de 167 receptoras bovinas nulparas , que foram inovuladas com 1 em brio
fecundado in vitro, ou inovuladas com 1 embrio fecundado in vitro, associado a 1
embrio partenogentico, m as houve efeito s ignificativo da s ess o de PIV.
Dess a form a, no houve diferena para as taxas de prenhez, m as ao final do
perodo de 60 dias , houve um increm ento de 14,6% na taxa de prenhez, quando um
embrio fecundado in vitro foi trans ferido junto com partenogentico, e ess e
resultado, em se tratando que a tcnica de Fecundao in vitro, uma biotecnologia
aplicada em anim ais de alto valor gentico, um aumento de 14,6% na taxa de
prenhez, pode representar um ganho financeiro cons idervel dependendo do
acas alam ento des ejado.
Na terceira etapa des te trabalho, foram comparadas as m dias das taxas de
prenhez de 72 receptoras bovinas nulparas aps inovulao com 1 em brio
fecundado in vivo, ou inovulao com 1 embrio fecundado in vivo, ass ociado a 1
embrio partenogentico.
Nes te experimento, as inovulaes dos em bries foram realizadas em trs
dias diferentes , e para a TP 30 dias , houve diferena (P=0,007) na taxa de prenhez
quando um em brio fecundado in vivo foi trans ferido junto com um partenogentico.
No foi observada diferena para a varivel TP 60 dias (P=0,08), mas com um
valor prxim o de s er cons iderado s ignificativo, j que a diferena de 38.8% na taxa
de prenhez aos 60 dias , quando um embrio partenogentico foi ass ociado com
embrio fertilizado in vivo, torna-s e vivel a utilizao dess a es tratgia como um a
ferramenta im portante para aum ento da taxa de prenhez de bovinos .
64

Em relao s perdas em brionrias ocorridas no perodo de 30 a 60 dias da


ges tao, observaram -se valores de 14,8% para o G1, 33,3% para o G2, 25,0% para
o G3 e 18,5% para o G4. Dess a form a, quando os em bries fecundados foram
inovulados sozinhos , houve perda embrionria de 18,5% e quando foram ass ociados
a um partenogentico foi de 25,9%.
Com o os partenogenticos no poss uem cromoss om os paternos , e es tes s o
fundam entais para formao da placenta em rum inantes , s er que a perda do
embrio partenogentico ao redor dos 35-40 dias , prejudica o microambiente uterino
determ inante ao des tino da ges tao e o des envolvimento do embrio fecundado?
Conform e Leiser e Kaufm ann (1994), em bovinos , caprinos , ovinos e
cervdeos a placentao cons iderada temporalm ente tardia e um process o
relativamente no-invasivo. A placenta cons tituda por s eis cam adas teciduais
(endotlio m aterno, tecido conjuntivo m aterno, epitlio m aterno, trofoblas to, tecido
conjuntivo em brionrio e endotlio em brionrio) que s eparam as circulaes fetal e
m aterna, sendo inicialmente diferenciadas partir do 42 dia de ges tao.
As s im , at o 42 dia de ges tao, o des envolvim ento dos bovinos conhecido
como perodo em brionrio, e a partir de ento, como perodo fetal, e no h relatos
que os em bries partenogenticos des envolvam -s e aps ess a data. No
freemartinismo, as anas tom oses dos vasos placentrios iniciam -s e a partir do 39
dia de ges tao (DOMINGUEZ et al., 1990).
Sabe-s e que em bries partenogenticos no progridem a termo, m as h
relatos de prolongamento da durao do ciclo es tral de bovinos de 32 dias ,
(SUSKOPARRISH et al., 1994) at 48 dias (FUKUI et al., 1992) aps inovulao de
embries partenogenticos .
De acordo com Mo, (2005) fetos e m embranas fetais de partenotos bovinos ,
ativados por ionom icina e 6-DMAP, apres entaram des envolvimento at os 35 dias de
ges tao, porm de tam anho inferior a um em brio controle.
As equipes de Fukui (1992) e Loi (1998), cons tataram um a prenhez aos 35
dias de em brio partenogentico, porm no foram detectados batim entos
cardacos , e declararam que o tam anho do tero gravdico era m enor em relao ao
anim al controle, que foi insem inado artificialmente.
Por s ua vez, Hagemann et al. (1998) recuperaram fetos ovinos
partenogenticos aos 21 dias de ges tao, e declararam tambm apres entar
65

tam anho inferior em relao aos fetos decorrentes de monta natural, m as poss uam
s emelhana em tam anho e m orfologia das m embranas fetais .
Ess es autores s us tentaram a hiptese des te presente trabalho que, s e h
des envolvimento at o 35 dia de ges tao, o em brio partenogentico cons eguiu
inibir a lutelis e durante o perodo crtico do reconhecim ento m aterno.
Ainda na prim eira etapa experim ental, foi coletado o tero de um anim al
prenhe de em brio partenogentico, aos 21 dias de des envolvim ento, e dess a
form a, tambm conseguiu-s e afirm ar que o em brio partenogentico ultrass ou o 17
dia de ges tao, dia crtico de reconhecimento m aterno da ges tao.
O tem po de ges tao de bezerros s ubmetidos ass ociao com
partenogenticos , no m om ento da inovulao, no diferiram em dias de ges tao e
pes o ao nas cimento. O primeiro nas cim ento pertencia ao G1 e nas ceu aos 287 dias
com 28 kg, e o s egundo bezerro originrio do G2, nas ceu aos 296 dias com 34 kg,
ambos do s exo mas culinos , e pertencentes raa Gir leiteiro.
Portanto, no houve com prometim ento do des envolvim ento fetal do embrio
fecundado in vitro, quando ass ociado a um em brio partenogentico no mom ento da
inovulao.
Como o reconhecim ento materno em brionrio, no perodo de peri-
implantao, pode repres entar de 30 a 40% das perdas nas ges taes de fm eas
bovinas (DISKIN e SREENAN 1980; ROCHE et al., 1981; HUMBLOT 2001;

SANTOS et al., 2004), torna-se cada vez m ais im portante o es tudo do gene do IFN-
para diminuio das perdas financeiras dos pecuaris tas .
66

8 CO NCL US ES

Os em bries partenogenticos expressam o gene do IFN- e s ecretam a


protena do IFN-, no 9 dia de desenvolvim ento em brionrio.

A trans ferncia de um em brio partenogentico ass ociado a em bries


fecundados in vitro (P=0,924) ou in vivo (P=0,084), no favoreceu
es tatis ticam ente ao aum ento da taxa de prenhez aos 60 dias de ges tao,
porm no prejudicou o des envolvimento das ges taes a term o em
bovinos .

Perspectivas :

Apes ar de no obs ervar vantagens na aplicao do partenogentico no

aum ento da taxa de ges tao, a diferena obs ervada na expresso do IFN- pode
indicar que exis te um efeito da s esso de PIV s obre a express o e produo da

protena do IFN-. Seria ento im portante um a continuidade des te trabalho com


inovulaes de em bries express ando m aior quantidade de RNAm do IFN-.
67

9 ANEX OS

Anexo 1. Ultra-s onografia do tero de novilha inovulada com 1 embrio fecundado in


vitro ass ociado a 1 em brio partenogentico. As s etas indicam a
pres ena de 2 ves culas am niticas aos 28 dias

a b

Anexo 2. Ultra-s onografia do tero de novilha do G2 aos 56 dias de ges tao.


Figura a: +) comprim ento do cordo um bilical = 0.8 cm . Figura b: +)
comprim ento Crown-Rump = 4.6 cm .
68

a b

Anexo 3. Ultra-s onografia do tero de um a novilha aos 36 dias de ges tao. Figura
a: +) comprim ento crnio-caudal da ves cula am nitica = 3.0 cm e x)
comprim ento dors o-ventral da ves cula am nitica = 1.09cm . Figura b: +)
comprim ento crnio-caudal do em brio = 1.7cm e x) com primento dors o-
ventral do embrio = 1.1 cm .

a b
Anexo 4. Ultra-s onografia do tero de um a novilha aos 64 e 75 dias dias de
ges tao. Figura a: +) comprim ento Crown-Rum p aos 64 dias (6.1cm );
Figura b: +) comprim ento Crown-Rump aos 75 dias (6.8 cm ).
69

a b
Anexo 5. Ultra-s onografia do tero de um a novilha aos 64 dias de ges tao. Figura
a: +) dim etro do cordo um bilical (0.8cm ). Figura b: ilus trao do cordo
umbilical.

a b
Anexo 6 . Ultra-s onografia do tero de uma novilha aos 75 dias de ges tao. Figuras
a e b: +) dimetro do cordo um bilical (1.1 cm ).
70

a b

Anexo 7. Ultra-s onografia do tero de uma novilha aos 75 dias de ges tao. Figura
a: As s etas indicam a form ao do cordo umbilical na parte m aterna.
Figura b: +) dim etro do cordo um bilical (1.0 cm ).

a b
Anexo 8. Ultra-s onografia do tero de uma novilha aos 83 dias de ges tao. Figuras
a e b: +) dimetro do cordo um bilical (1.3 cm ).
71

a b
Anexo 9. Ultra-s onografia do tero de uma novilha aos 97 dias de ges tao. Figura
a: +) dim etro do cordo um bilical (1.7 cm ). Figura b: A s eta indica o
enovelam ento do cordo um bilical.
72

a b

c d

Anexo 10. Ultra-s onografia do tero de uma novilha aos 104 dias de ges tao.
Figura a: +) dim etro do cordo um bilical (1.7 cm ). Figuras b, c e d:
Ilus trao do cordo umbilical.
73

a b

c d

Anexo 11 Im agem ultra-sonogrfica do tero de um a novilha dos 64 aos 104 dias de


ges tao. Figura a: +) Com primento Inter-orbital aos 64 dias (1.4 cm ).
Figura b: +) Comprim ento Inter-orbital aos 83 dias (2.3 cm ). Figura c: +)
Com primento Inter-orbital aos 90 dias (3.5 cm ) Figura d: +) Com prim ento
Inter-orbital aos 104 dias (4.2 cm ).
74

a b

c d

Anexo 12 Acom panham ento do desenvolvim ento fetal dos 64 aos 83 dias de
ges tao. As s etas indicam a pres ena do tubrculo genital prxim o ao
cordo umbilical aos 64 dias (figura a), aos 74 dias (figuras b e c) e aos
83 dias de ges tao (figura d).
75

a b

c d

e f

Anexo 13. Acom panhamento do des envolvimento fetal dos 64 aos 83 dias de
ges tao. As s etas indicam os placentnios aos 64 dias (figura a) e aos
83 dias de ges tao (figuras b, c, d e f).
76

a b

c d

e f

g h

Anexo 14. Acom panhamento do des envolvimento fetal aos 90 dias de ges tao.
As s etas indicam os placentnios .
77

a b

c d

e f

g h

Anexo15. Acom panham ento do desenvolvim ento fetal dos 97 aos 104 dias de
ges tao. As s etas indicam a pres ena de placentnios aos 97 dias
(figuras a, b, c e d) e aos 104 dias de ges tao (figuras e, f, g e h).
78

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