UNIVERSIDAD NACIONAL DEL

ALTIPLANO PUNO

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AGRONOMICA

Practica N 1

CURSO:
Fitopatologa
DOCENTE: Ing. Betsabe len ttacca
PRESENTADO POR:

Daniel flores cahuana

 Diagnstico de una enfermedad de planta
I. INTRODUCCION

las enfermedades de las plantas ocasionadas por microorganismos infecciosos como hongos,
bacterias, nematodos y protozoarios flagelados y agentes como virus y viroides son el producto
de la infeccin dinmica entre un patgeno un hospedante y el medio ambiente. el primer paso
para el manejo correcto de una enfermedad conocer su verdadera etiologa . existen varios
procedimientos para determinar la etiologa de enfermedades de plantas tales como la
observacin directa del agente causante al microscopio compuesto tcnicas inmuno-enzimticas
bioqumicas y moleculares y microscopia electrnica . para un diagnstico correcto se debe
disponer de laboratorios adecuados de diagnstico fitosanitario , a los cuales deben enviarse
muestras frescas y representativas de plantas que presentan sntomas tipos dela enfermedad para
poder conocer con exactitud su etiologa el diagnstico es el fundamento tcnico y cientfico
para adoptar medidas de manejo rpido y oportuno

II. OBJETIVOS
Conocer los diferentes sntomas y signos de rganos de plantas enfermas
Conocer los pasos para realizar un diagnstico de una enfermedad
III. MATERIALES Y METODOS
OBSERVACIONES DE SINTOMAS
colectar muestras frescas , respectivamente de plantas enfermas , o o partes de
ella como : races ,tallo,hojas , flores o frutos
una muestra optima debe mostrar el tejido de la planta realmente enfermo
la muestra colectada debe tener tejido sano y enfermo , es decir todos los
estados de desarrollo de la enfermedad , mostrando los sntomas iniciales y
finales de la enfermedad
revise la presencia de lesiones , agallas , cancros (heridas) u otros sntomas que
puedan tener las races, tallos, ramas o frutos para escoger las partes de la planta
que presenten los sntomas caractersticos dela enfermedad finalmente revise la
presencia de signo de la muestra . si sospecha que es un hongo el que esta
causando la enfermedad , cerciorese de que este esporulado sobre el tejido
vegetal , para realizar un montaje observar e el microscopio .
cumpliendo estas cracteristicas, cada alumno debera dar a conocer los tipos de
sntomas y signos ( segn las clases tericas desarrollas ) de la muestra
colectada

PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES DE

PLANTAS
3.1 clave para el diagnostico de agentes causantes de enfermedades
Una secuencia para iniciar el diagnostico consiste en seguir la clave de french y hebert
(1982)

A1 Manchas y chancros

B1signos de patgenos visibles al microscopio estereoscpico

C1 signo de hongos :realice preparaciones microscpicas de las estructuras con

tincin cuando sea apropiado.. I
 C2 signos de bacterias (exudado o manchas hmedas ) . realice preparaciones
microscpicas para observar flujo bacterial en campo oscuro , luego efectue tincin
de gram.II

B2 Ausencia de signos de patgenos

C1 incube la muestra en cmara hmeda y luego regresa a A1 .III

C2 mosaicos , moteados u otros sntomas virales posibles

C3 decoloracin y otros sntomas de desnutricin

A2 Marchites

B1 sistema radical afectado

C1 presencia de nematodos o sus sntomas

C2 pudricion radical, tratar como A1

B2 sistema vascular descolorado

C1prueba de flujo bacterial en agua , luego efectue tincin de gram II

C2 ausencia de flujo , hacer corte para observar hongos .. I

A3 pudriciones

B1 tallo o raz, tratar como A1

B2 organos de reserva (tuberculos , raices)

C1 realice preparaciones microscpicas y observe para hongos , con tincin cuando

sea indicado ..I

C2 haga preparaciones para observar bacterias en campo oscuro 8 micrscopio de

contraste de fase ) luego realice la tincin de gram .. II

C3inocule tegidos sanos con los afectados cuandola pucricion es avanzada ; luego
observe como C1 y C2 ..IV

secuencia para realizar un diagnostico correcto

para realizar un diagnstico correcto se recomienda seguir la secuencia propuesta por
rubert streets (1972)
a. identifique la planta hospedante, adicionando el nombre de la variedad
b. sntomas en el campo . utilice su propia informacin o use la proporcionada por quien
enva la muetra
c. condiciones de cultivo. Informacin del tipo de suelo ,practicas de riego fertilizaciom
y aplicacin de plaguicidas
d. sntomas en detalle. observacin de manchas , aublo foliar , pudricin de semillaso
frutos, cancros en las ramas o tallos , pudricin o agallas en las races. Etc
e. observacin en un aumento bajo. Observacin con una lupade alto aumento en el
campo o un esteroscopio en laboratorio de la superficie de las leciones o tejidos
muertos ; esto permitir observarla presencia de esporas , cuerpos fructferos de hongo
o exudados bacteriales
f. observacionde aumento alto. Observacin a travs del microscopio ncompuesto para
detallar las estructuras anteriores
 g. aislamiento . aislar el microscopio sospechosdo en condiciones aspticas de
laboratorio
h. patogenidad. Si el patgeno observado es el causante de la enfermedad pero no
existeninformes previos entonces se debe recurrir a los postulados de Robert koch
establecidos en 41876
i. diagnostico. Si el patgeno en observacin es identificado con malnuales
especializados o p cuandpo los postulados son demostrados el patgeno aislado es el
responsable de la enfermedad
IV RESULTADOS
4.1 DESCRIBIR LAS MUESTRAS QUE SE OBSERVO EN LABORATORIO SEGN LA
CLASIFICACION DE SINTOMAS Y SIGNOS

MUESTRA N01 Arberja

SINTOMA
SEGN EL AREA QUE Localizado
OCUPA
SEGN EL TAMAO Macroscpico
S.R. AL PATOGENO Primario
SEGN EL TIPO Moos blanco
SIGNO No tiene
MUESTRA N2 Hoja de avena
SINTOMA
SEGN EL AREA QUE Localizado
OCUPA
SEGN EL TAMAO Macroscpico
S.R. AL PATOGENO Primario
SEGN EL TIPO Necrtico
SIGNO H.avenae
MUESTRA N3 Tubrculo .papa
SINTOMA
SEGN EL AREA QUE Localizado
OCUPA
SEGN EL TAMAO Macroscpico
S.R. AL PATOGENO Primario
SEGN EL TIPO tumores
SIGNO No tiene
MUESTRA N4 Hoja de alfalfa
SINTOMA
SEGN EL AREA QUE Localizado
OCUPA
SEGN EL TAMAO Macroscpico
S.R. AL PATOGENO Primario
SEGN EL TIPO Manchas necroticas
SIGNO Botritis babae
MUESTRA N5 Raz papa
SINTOMA
SEGN EL AREA QUE Localizado
OCUPA
SEGN EL TAMAO Macroscpico
S.R. AL PATOGENO Primario
SEGN EL TIPO tumores
SIGNO No tiene
MUESTRA N6 Hoja quinua
SINTOMA
SEGN EL AREA QUE Localizado
OCUPA
SEGN EL TAMAO Macroscpico
S.R. AL PATOGENO Primario
SEGN EL TIPO Manchas necroticas
SIGNO mildium
MUESTRA N7 Fruto de manzano
SINTOMA
SEGN EL AREA QUE Localizado
OCUPA
SEGN EL TAMAO Macroscpico
S.R. AL PATOGENO Primario
SEGN EL TIPO pudrision
SIGNO No tiene
MUESTRA N8 Tubrculo papa
SINTOMA
SEGN EL AREA QUE Localizado
OCUPA
SEGN EL TAMAO Macroscpico
S.R. AL PATOGENO Primario
SEGN EL TIPO esclereotes
SIGNO No tiene
MUESTRA N9 Fruto de manzano
SINTOMA
SEGN EL AREA QUE Localizado
OCUPA
SEGN EL TAMAO Macroscpico
S.R. AL PATOGENO Primario
SEGN EL TIPO Moos negro
SIGNO No tiene
MUESTRA N10 Hoja de haba
SINTOMA Mancha chocolate
SEGN EL AREA QUE Localizado
OCUPA
SEGN EL TAMAO Macroscpico
S.R. AL PATOGENO Primario
SEGN EL TIPO Mancha negra
SIGNO No tiene
MUESTRA N11 Espiga de trigo
SINTOMA
SEGN EL AREA QUE Localizado
OCUPA
SEGN EL TAMAO Macroscpico
S.R. AL PATOGENO secundario
SEGN EL TIPO Polvo negro
SIGNO carbones
 MUESTRA N12 Hoja alfalfa
SINTOMA
SEGN EL AREA QUE Localizado
OCUPA
SEGN EL TAMAO Macroscpico
S.R. AL PATOGENO Primario
SEGN EL TIPO
SIGNO
MUESTRA N13 Tallo de haba
SINTOMA
SEGN EL AREA QUE Localizado
OCUPA
SEGN EL TAMAO Macroscpico
S.R. AL PATOGENO Primario
SEGN EL TIPO necrotico
SIGNO Mancha cholcolate
MUESTRA N14 Naranjo
SINTOMA
SEGN EL AREA QUE Localizado
OCUPA
SEGN EL TAMAO Macroscpico
S.R. AL PATOGENO Primario
SEGN EL TIPO Moos negro
SIGNO No tiene

4.2 REALIZAR EL DIAGNOSTICO DE LA MUESTRA VEGETAL ENFERMA QUE

TRAJO PARA LAS PRACTICAS UTILIZANDO LAS CLAVE DE FRECH HEBERT (1982)

Fruto de manzano

A1 Manchas y chancros

B1signos de patgenos visibles al microscopio estereoscpico

C2 signos de bacterias (exudado o manchas hmedas ) . realice preparaciones

microscpicas para observar flujo bacterial en campo oscuro , luego efectue tincin
de gram.II
IV. CONCLUCIONES
PRIMER OBJETIVO
Los signos que se encontraron fueron esclerote, oidiosis ,micelio, mildiu,
carbn, quiste, roya , son los signos comunes que se encuentran el los cultivos y
acontinuacion pondre su sisnificado :

ESCLEROTE Esta enfermedad, causada por Sclerotinia sclerotiorum, afecta la papasobre todo en las
zonas tropicales fras y en las zonas templadas. Puede causar daos importantes en la papa cuando el
cultivo de rotacin incluye hortalizas susceptibles - frjol, lechuga, tomate, apio, coliflor y repollo. El
tiempo fro y hmedo favorece la enfermedad.2

OIDIOSIS Su principal sntoma es el hecho de que las hojas se cubren, principalmente en la parte axial,
con una capa algodonosa de micelio grisblancuzco a blanco en forma de estrella. En un ataque fuerte las
hojas se ponen amarillas y posteriormente se secan.

El hongo se manifiesta inicialmente en plantas aisladas pudiendo cubrir posteriormente todo el cultivo

MICELIO es la masa de hifas que constituye el cuerpo vegetativo de un hongo.1Dependiendo de su

crecimiento se clasifican en reproductores (areos) o vegetativos. Los micelios reproductores crecen hacia
la superficie externa del medio y son los encargados de formar los orgnulos reproductores (endosporios)
para la formacin de nuevos micelios. Los micelios vegetativos se encargan de la absorcin de nutrientes,
crecen hacia abajo, para cumplir su funcin

MILDIU es el resultado del crecimiento de pequeas hifas fngicas sobre plantas o materia orgnica
como madera, papel o cuero. El mildiu afecta de manera considerable el rendimiento de los cultivos,
diferencindose entre dos tipos de mildius patgenos de plantas segn si es causado por hongos del
ordenErysiphales, o por protistas fungoides del orden Oomycota de la familiaPeronosporaceae

QUISTES es un estado de reposo o inactividad de un microorganismo, usualmentebacterias o protistas o

raramente un animal invertebrado, que ayuda al organismo a sobrevivir a condiciones ambientales
desfavorables. Puede considerarse como un estado de animacin suspendida en el cual los procesos
metablicos de la clula son ralentizados y cesan actividades como la alimentacin y locomoci
SEGUNDO OBJETIVO
mediante el uso del microscopio y las presentacin en aula se pudo observar y
entender los signos y sntomas y entre otras caractersticas de la plata y sus partes
como raz tallo hoja y fruto

VI.BIBLIOGRAFIA

Agrios, G. N. (2005). Plant pathology. 5th ed. Nueva York: Elsevier Academic Press. 424 pg.
French, E. R. & Hebert, T.T. (1982). Mtodos de investigacin fitopatolgica. San Jos, Costa
Rica: IICA 85 pg.
Limusa Grupo Noriega Editores. 1998.
Harlow E, Lane D, editors. Immunoassays. En: Antibodies. A laboratory manual. New York:
Cold Spring Harbor Laboratory; 1998. p.553-612
VII.CUESTIONARIO

PARA QUE SIRVE LAS TCNICAS DE INMUNO ENZIMTICAS

Y DESCRIBA LA METODOLOGA ?

La interaccin antgeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si una

planta tiene una infeccin o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnstica, posee
diversas limitaciones que conviene conocer:

En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa

necesariamente que la planta est enfermo. La planta que ha estado enferma y que ya se ha
recuperado puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originara un falso positivo.

En segundo lugar, hay plantas producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que estos
pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sera el
caso
En tercer lugar, pueden aparecer falsos negativos cuando se da inespecificidad entre
antgeno-anticuerpo.

En estos casos de diagnstico de enfermedad, es recomendable la eliminacin (mediante

centrifugacin) de clulas. Tambin, debemos tener en cuenta que cuando se trata de
diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada
poblacin es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha poblacin, es
necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro mtodo de diagnstico
independiente. Normalmente,
DESCRIBA EN FORMA RESUMIDA TRES TECNICAS
BIOQUIMICAS Y MOLECULAR PARA IDENTIFICAR PATOGENOS
DE PLANTAS?

a).- Tcnicas basadas en hibridacin de ADN

Estas tcnicas se desarrollaron a partir del conocimiento de que dos cadenas sencillas de cido
nucleico que tengan secuencias complementarias se pueden unir o hibridar para formar una
cadena doble. Las cadenas sencillas pueden ser de ADN o ARN, o bien una de ADN y otra de
ARN. Dentro de las tcnicas de hibridacin mas utilizadas esta los fragmentos de restriccin de
longitud polimrfica (RFLPs).

RFLPs. Esta tcnica est basada en hibridacin de ADN. Consiste en extraer ADN de un cultivo
puro de un microorganismo o bien de una muestra infectada y digerir el ADN con enzimas de
restriccin (enzimas que cortan el ADN en sitios especficos), posteriormente estos fragmentos
de ADN son separados en un gel de agarosa utilizando electroforesis. El ADN est cargado
negativamente, por lo tanto, en un campo elctrico el ADN migrara del polo negativo hacia el
polo positivo a travs de la matriz de un gel. La friccin entre el fragmento y la matriz ocasiona
que fragmentos pequeos migren ms rpido que fragmentos grandes. En esta tcnica el ADN
separado de la forma antes descrita en la gel, es transferido a un soporte slido (membranas de
nylon o nitrocelulosa), acto seguido se hibridiza el ADN de la membrana con una sonda de
ADN especifica (fragmento de ADN de cadena sencilla de 150 a 300 nucletidos) del
microorganismo que se quiere identificar. La sonda va a unirse en el fragmento del ADN que
tenga su complemento. La sonda para la deteccin tiene que ser marcada en forma radioactiva
(P32) o no radioactiva (digoxigenina). La sonda puede ser aislada del genoma nuclear, del
genoma mitocondrial o bien de ADN que codifica para protenas (ADNc) del microorganismo.
Esta metodologa es muy especfica. Sin embargo, no es muy rpida ni muy sensible (se
requiere 103 a 106 copias de la molcula o secuencia de inters para dar un resultado confiable),
adems de que se requiere utilizar radioactividad (si no es empleada adecuadamente y
bajo condiciones especiales de laboratorio, se pueden tener riesgos de salud del analista,
contaminaciones de instalaciones o del medio ambiente).

Una variante de RFLP`s se ha diseado para la deteccin de Listeria. Esta consiste en fijar en un
microtubo una sonda de ADN complementaria a una regin del RNA ribosomal de la bacteria.
El RNA completo de la muestra es extrado y colocado en el microtubo con la sonda, la cual se
unir al RNA ribosomal, posteriormente se agrega otra sonda de ADN complementaria a otra
regin del RNA ribosomal la cual est marcada con florescencia posteriormente se detecta la
presencia del microorganismo por un anticuerpo con anti-florescencia (Giese, 2001).

b).- Tcnicas basadas en PCR

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) o la amplificacin enzimtica in vitro de un

segmento de ADN especfico del microorganismo blanco. Esta es la tcnica ms utilizada para
la deteccin de microorganismos, se basa principalmente en realizar millones de copias de un
segmento de ADN especfico de un microorganismo. En esta tcnica la cadena doble de
ADN es separada en dos cadenas sencillas sometindola a temperaturas mayores a 92 grados
centgrados despus se hibridiza o alineen dos pequeos segmento de ADN
complementarios uno a una cadena y el otro a la otra. Estos pequeos segmentos son llamados
iniciadores, los cuales deben de ser diseados de tal manera que solo hibridisen con el ADN
del microorganismo que se desee y su tamao generalmente va de 18 a 25 bases. Una vez que
los iniciadores estn unidos a las cadenas complementarias se adiciona a la reaccin una ADN
polimerasa la cual va a formar la nueva cadena tomando como bases la cadena sencilla y uno de
los extremos del iniciador (3). Despus de este primer ciclo, si se parti de una sola cadena
doble de ADN se tendran dos cadenas dobles. Esta amplificacin se incrementa en forma
geomtrica a medida que se repite el numero de ciclos, as despus de dos ciclos tendramos
cuatro cadenas dobles de ADN, y despus de tres, ocho y as sucesivamente, despus de treinta
ciclos tendramos una gran cantidad de ADN amplificado para ser visualizado a simple vista.
Las ventajas de PCR sobre otras tcnicas de deteccin se han reportado en varias ocasiones. La
deteccin de C. trachomatis por PCR resulto ser mas precisa, con sensibilidad de 90-100% y
especificidad mayor al 97% que la deteccin por ELISA (Louie y col., 2000). As mismo la
PCR ha ayudado a identificar microorganismos infecciosos relacionados a enfermedades
previamente identificadas como de origen no infeccioso.

La tcnica de PCR se ha utilizado para la identificacin de virus, bacterias hongos,

fitoplasmas nematodos etc. Un ejemplo es el mtodo desarrollado por Ayala y colaboradores
2004, para la identificacin de la bacteria Clavibacter michiganensis subs. nebraskensis, la cual
es causante de la enfermedad conocida como marchites bacteriana del maz, en este caso se
disearon iniciadores especficos a un segmento entre los genes de rRNA 16 S y 23S. Dichos
iniciadores se compararon con las secuencias de ADN reportadas en los bancos de genes para
comprobar que solo se alinearan a la secuencia de Clavibacter
michiganensis subsp nebraskensis. La precisin y reproducibilidad de los ensayos de PCR
depende de la experiencia tcnica y experiencia de analista. La especificidad de la prueba puede
ser afectada por la contaminacin de la muestra durante su procesamiento. Si los iniciadores no
son especficos o si las condiciones de la PCR no son optimas, se pueden amplificar productos
no especficos (Louie y col., 2000). Lo anterior puede guiar a la deteccin de falsos negativos,
de la misma manera la contaminacin de la muestra con inhibidores (cidos hmicos,
polifenoles, carbohidratos, etanol, etc) de la enzima polimerasa puede ocasionar tambin falsos
negativos. Sin embargo esto se puede solucionar incorporando siempre controles positivos. La
contaminacin de la muestra con otro ADN o RNA, puede conducir a la deteccin de falsos
positivos, esto se soluciona agregando siempre un control negativo (Ayala y col., 2004). La
identificacin de microorganismos directamente de alimentos utilizando PCR presenta algunas
retos como es la baja sensibilidad provocada por la inhibicin debida a la matriz del alimento,
esto puede ser parcialmente restablecida con una etapa de enriquecimiento pero se alarga el
tiempo para el diagnostico (Grant y col., 1993). Aun con estas desventajas, la flexibilidad,
automatizacin, rapidez y confiabilidad de las tcnicas moleculares basadas en PCR son las
tcnicas moleculares con ms aceptacin en la actualidad para la deteccin de
microorganismos en general