FISH (Hibridao in situ fluorescente)

1. Confeco da sonda
- marcao com fluorocromos
- marcao com compostos reprteres
2. Preparo dos cromossomos
3. Desnaturao da sonda e dos cromossomos
4. Hibridao
5. Lavagem para remoo do excesso de sonda
6. Deteco da sonda
- deteco direta
- deteco indireta
7. Diferentes aplicaes conforme o tipo de sonda
8. Fiber-FISH: uma variante de FISH
 Hibridao in situ fluorescente

(FISH: Fluorescence In Situ Hybridization)

Luciana Bolsoni Loureno

Viso geral da tcnica de FISH
1. Marcao do DNA Construo da sonda
Marcadores

fluorocromos (marcao direta)
- fluorescena (FITC 506;529)
- Texas red (595;620)
- Rodamina B (560;584)
- Spectrum orange (559;588)

compostos reprteres (marcao indireta)

- biotina
- digoxigenina

Mtodos de marcao

Nick translation

Random priming

PCR
Marcao de DNA por nick translation

5 3
3 5
DNase I

5 3
3 5

DNA polimerase I dNTP + dUTP*

5 3
3 5

Sonda de DNA
Marcao do DNA por random priming

desnaturao e anelamento
dos primers

Fragmento Klenow
+
dNTP e dATP*

desnaturao
 NICK TRANSLATION
RANDOM PRIMING

todas as cadeias so marcadas
apenas uma das fitas marcada

fragmentos entre 200 e 500 pb
fragmentos entre 100 e 5000 pb

maior quantidade de DNA total

 Ciclo 2

Ciclo 1 Ciclo 3

Marcao do DNA por PCR

mov
2. Preparo dos cromossomos

- tratamento com RNase A

- desidratao

Etanol Etanol Etanol

50% 75% 100%
3. Desnaturao do DNA por alta temperatura

-sonda: 95oC

-cromossomo: 70oC

Formamida se liga aos grupos NH2 livres da adenina

e previne a formao de pontes de hidrognio
Preparo dos cromossomos

- tratamento com RNase A

Confeco da sonda

- desnaturao
Desnaturao

4. Hibridao
5. Lavagem para remoo de excesso de sonda

McaL1

Microtus cabrerae M. cabrerae - fmea

Lavagem em alta estringncia Lavagem em baixa estringncia
5. Lavagem para remoo de excesso de sonda

6. Deteco da sonda
 6. Deteco direta da sonda

espaador

Fluorescena

Cumarina

Rodamina
 6. Deteco direta da sonda

Microscpio de epifluorescncia

529 nm
529 nm

488-506 nm
506 nm
6. Deteco indireta da sonda

Composto fluorescente

Anticorpo (ou avidina)

Composto marcador (ex.: digoxigenina,
ou biotina)
 Amplificao do sinal

Anti-avidina
biotinilada

avidina
FITC
biotina

1 ciclo de amplificao 2 ciclos de amplificao 3 ciclos de amplificao

Sonda com 1.4 kb
 Tipos de sondas

segmentos cpia nica

segmentos repetitivos

segmentos cromossmicos

cromossomos

genomas
Sondas de DNA ribossomal 18S+28S

FISH com DNAr 28S

Paratelmatobius sp.
FISH detecta NORs
e permite reconhecer stios impregnados por Prata no correspondentes a NORs
 Arachis hypogaea cv. Tatu

Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia UFP

DNAr 5S

DNAr 28S
Engystomops petersi
Sonda Centromrica
Sonda centromrica especfica
 Comparao entre caritipos
humano (2n=46), chimpanz (2n=48),

gorila (2n=48) e orangotango (2n=48)

Telmeros - Centrmeros
 Sondas
subtelomricas
Sistema mecnico de microdisseco

Sistema de microdisseco a laser

Isolamento de um segmento cromossmico

(5CCGACTGCAGNNNNNNATGTGG3)

Microdeleo Xp22.3
Isolamento de um segmento cromossmico

Microdeleo Xp22.3
Microdeleo Xp22.3
Microdisseco de um cromossomo inteiro

(5CCGACTGCAGNNNNNNATGTGG3)
 Sonda cromossmica
(chromosome painting)

Cromossomo 4 humano
 Sonda cromossmica
(chromosome painting)
Flow sorting
Flow sorting
Flow sorting
Flow sorting
2
4
3 1
5
6
X 7
8
13 12 10
9 11
14
18 15
Y 20 16
21 17
22 19

5 fluorocromos
25=32
SKY (Spectral Karyotyping)

4 4
X

X
(Nature 409: 860-921, 2001)
Zoo-FISH

Sondas (crs. de camundongo)

Caritipo humano hibridado

com sondas cromossmicas de camundongo
Sonda genmica (GISH: genomic in situ hybridization)

DNA da sp. A: vermelho

DNA da sp. B: verde

Hbrido (AAB)
CGH (Comparative Genome Hybridization)

Cot 1 DNA
DNA referncia (de mulher): vermelho
DNA em teste: verde (normal)
DAPI
DNA em teste
DNA de referncia
DNA de referncia (mulher): vermelho
DNA em teste: verde

Amplificao 1q
 Deleo

CGH - Limite de sensibilidade: 2.000-20.000 kb

 Fiber-FISH

limite de resoluo de cerca de 10kb

Fiber-FISH

Arroz Cheng et al. 2004