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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS


PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM FARMACOLOGIA

RELATRIO PARCIAL DE PS-DOUTORADO JNIOR (PDJ)/CNPq


PROCESSO: 150435/2015-0
COM VISTAS PRORROGAO 2016-2017

Projeto:

Envolvimento do receptor FPR2/ALX na disfuno cardiovascular da sepse

Dra. Vernica Vargas Horewicz

Florianpolis, SC, maio de 2016


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1. DADOS DO PROJETO

Projeto: Envolvimento do receptor FPR2/ALX na disfuno cardiovascular da


sepse

Submetido ao: Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico


(CNPq), na modalidade de bolsa de Pos-doutorado Junior (PDJ)

Processo: 150435/2015-0

Instituicao de Execucao do Projeto:


Universidade Federal de Santa Catarina UFSC CNPJ: 83.899.526/0001-82
Departamento de Farmacologia Centro de Ciencias Biologicas
Trindade - Florianopolis - Santa Catarina - Brasil - CEP 88040-900

Supervisor:
Prof. Dr. Jamil Assreuy
Universidade Federal de Santa Catarina - UFSC - Departamento de
Farmacologia CCB Bloco D Florianopolis-SC
e-mail: jamil.assreuy@ufsc.br
Telefone: (048) 3721-2467

Vigncia:
De 01/07/2015 a 30/06/2016

Dados da ps-doutoranda:
Nome:
Vernica Vargas Horewicz
Formao profissional:
Graduao em Odontologia (Universidade Estadual de Ponta Grossa, 2002),
Mestre em Odontologia, rea de concentrao em Periodontia (Centro de
3

Pesquisas Odontolgicas So Leopoldo Mandic, 2008) e doutora em


Biotecnologia e Biocincias (Universidade Federal de Santa Catarina, 2015).
e-mail: vhorewicz@hotmail.com
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2. RESUMO DA PROPOSTA INICIAL

A sindrome da resposta inflamatoria sistemica quando associada a uma infeccao


pode evoluir para sepse e choque septico, que sao importantes causas de morte
nas unidades de terapia intensiva. Em geral, a morte e causada por colapso
cardiovascular e hipotensao refrataria que aparecem logo no inicio da sepse. A
disfuncao vascular e mais estudada e compreendida que a disfuncao cardiaca,
contudo, a ultima e reconhecida como um importante mediador da disfuncao de
multiplos orgaos na sepse. O estudo da sepse e de novas alternativas
terapeuticas permanecem um desafio devido a complexidade desta sindrome,
cujo principal componente e uma resposta inflamatoria desordenada. O
FPR2/ALX e um receptor acoplado a proteina G pertencente a familia dos
receptores de formil peptdeos, conhecidos pela importancia na defesa do
hospedeiro e na inflamacao. Foi demonstrado que o FPR2/ALX tem a sua
expresso aumentada no foco infeccioso de animais com pneumosepse, e que o
tratamento com o agonista lipdico lipoxina A4 (LXA4) reduz a mortalidade
atravs da diminuio da resposta inflamatria excessiva. No contexto da
disfuno cardiovascular no modelo de pneumosepse, a ativao do FPR2/ALX
com o agonista peptdico WKYMVm reverteu a hiporreatividade fenilefrina e
aumentou a sobrevida em 40%, entretanto, os mecanismos moleculares
envolvidos ainda precisam ser elucidados. Desse modo, o objetivo do presente
trabalho avanar no entendimento do papel do FPR2/ALX na disfuno
cardiovascular que ocorre no modelo de sepse induzida por pneumonia. Para
tanto, utilizaremos camundongos Swiss machos divididos em 4 grupos: 1)
camundongos falso-operados e tratados com WKYMVm, um agonista seletivo
deste receptor; 2) camundongos com sepse e tratados com WKYMVm; 3)
camundongos falso-operados e tratados com veiculo; 4) camundongos com
sepse e tratados com veiculo. Serao feitos experimentos em animais septicos
para avaliacao da funcao cardiaca e da responsividade cardiaca em coracao e
cones cardacos isolados, da presso arterial invasiva e no-invasiva, e da
reatividade vascular em anis de aorta. Em seguida, ser avaliado o
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envolvimento do receptor FPR2/ALX na disfuno cardiovascular sptica.


Finalmente, tcnicas de cultivo celular, imunofluorescncia e imunoeletroforese
sero utilizadas para estudos dos mecanismos moleculares dos efeitos da
estimulacao/bloqueio do receptor FPR2/ALX. Os resultados obtidos com nosso
estudo poderao contribuir para a compreensao acerca de como a modulacao do
FPR2/ALX pode influenciar as alteracoes na fisiologia cardiovascular durante a
sepse e de que forma tais eventos tambem contribuem para a melhora da
responsividade cardiaca e consequentemente da sobrevivencia. Esses achados
podem contribuir para o desenvolvimento de terapias inovadoras na sepse, ou
ate mesmo para a implementacao de estrategias que visem interromper a
sequencia de eventos que levam a hiporresponsividade e morte durante esse
processo inflamatorio generalizado.

3. IDENTIFICAO DA PROPOSTA

A despeito da evoluo do seu conhecimento fisiopatolgico e no


tratamento nas ltimas duas dcadas, a sepse ainda apresenta altas taxas de
mortalidade, que variam entre 20 a 59% (Angus et al., 2006). No Brasil estima-
se uma incidncia de 500.000 casos por ano (Machado & Mazza, 2010). O
estudo BASES (Brazilian Sepsis Epidemiological Study) demonstrou que a taxa
de mortalidade aumenta com a progresso da gravidade, de sepse para sepse
grave e choque sptico (34,7%, 47,3% e 52,2%, respectivamente) (Silva et al.,
2004). Essas taxas de mortalidade so muito superiores s de pases
desenvolvidos (Machado & Mazza, 2010).
Apesar dos grandes avancos na compreensao da fisiopatologia da sepse,
pouco se avancou em relacao ao seu tratamento. A manobra terapeutica
prioritaria tem sido a identificacao e eliminacao do foco infeccioso atraves de
antibioticos e em casos extremos, a sua remocao cirurgica. A manutencao da
pressao arterial e do debito cardiaco atraves de reposicao de liquido e utilizacao
de agentes inotropicos e vasopressores pode ser necessaria devido a
descompensacao hemodinamica (Wheeler & Bernard, 1999).
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O estudo da sepse e de novas alternativas terapeuticas permanecem um


desafio devido a complexidade desta sindrome, cujo principal componente e
uma resposta inflamatoria desordenada. As evidencias obtidas pelo grupo de
pesquisa do laboratrio coordenado pelo supervisor deste projeto indicam que
uma apropriada ativacao do receptor FPR2/ALX pode constituir uma nova
estrategia terapeutica no auxilio do tratamento da sepse (Sordi et al., 2013).
O FPR2/ALX e um receptor acoplado a proteina G (GPCR) pertencente a
familia dos receptores FPR (do ingles, formylpeptide receptor), conhecidos pela
importancia na defesa do hospedeiro e na inflamacao. Em humanos, ha tres
receptores codificados por genes distintos: FPR1, FPR2/ALX e FPR3 (Dufton &
Perretti, 2010; Ye et al., 2009).
O FPR2/ALX possui 351 aminoacidos e 69% de homologia com o FPR1,
o primeiro a ser descrito. Apesar da grande homologia, o FPR2/ALX tem pouca
afinidade pelo peptideo N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMet-Leu-Phe ou
fMLF), o ligante classico do FPR1. Essa familia de receptores e um tanto quanto
promiscua e ja foram descritos aproximadamente 30 agonistas, tanto peptidicos
quanto lipidicos (Dufton & Perretti, 2010). Dentre os ligantes do FPR2/ALX, alem
da lipoxina A4 (LXA4) e seus analogos, estao resolvina D1, anexina-1, peptideo
Ac2-26, proteina beta-amiloide, proteina amiloide serica A, peptideos do
envelope do HIV, peptideos antimicrobianos como LL37, entre outros (Scannell
& Maderna, 2006). Entretanto, o peptdeo WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-
Met-NH2) foi a primeira molcula proposta como agonista seletivo para o
FPR2/ALX. Esse agonista foi selecionado a partir de uma biblioteca de
peptdeos sintticos e contm uma D-metionina na posio 6 que aumenta sua
atividade biolgica (Baek et al., 1996). A ativao do FPR2/ALX pode resultar
em potentes respostas pr ou anti-inflamatrias. Ele est presente
principalmente em clulas mielides, mas tambm foi descrito em clulas no
mielides (Migeotte et al., 2006).
Existem pouqussimas evidncias da participao do FPR2/ALX na
funo de vasos sanguneos. Foi demonstrado que a LXA 4 tem um efeito direto
na regulacao do tnus vascular e e capaz de promover reducao transitoria da
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pressao sanguinea de maneira dependente de endotelio, pela liberacao de oxido


ntrico (NO) (von der Weid et al., 2004). Em um outro estudo, a ativao do
FPR2/ALX com o peptdeo WKYMVm induziu relaxamento dependente de
endotlio em veia omental humana (Berkestedt et al., 2008). No obstante,
esses estudos foram realizados na ausncia de um estmulo inflamatrio, e o
papel do FPR2/ALX vascular no contexto da sepse ainda no foi explorado.
No intuito de investigar uma possvel participao do FPR2/ALX nas
alteraes vasculares induzidas pela sepse, nosso grupo de pesquisa
demonstrou que o tratamento com o agonista seletivo WKYMVm restaurou a
hiporreatividade ao vasoconstritor induzida pela pneumosepse e aumentou a
sobrevida dos animais em 40%. Os resultados in vitro mostram que a ativao
do FPR2/ALX pelo WKYMVm diminui a produo de NO em clulas de msculo
liso vascular e em aortas estimuladas com LPS, mas esse efeito no parece
envolver a regulao da expresso da enzima xido ntrico sintase-2 (NOS-2)
(Horewicz et al., 2014). Esses dados sugerem um importante papel do NO nos
efeitos benficos do WKYMVm observados nas alteraes induzidas por LPS e
sepse, entretanto, os mecanismos celulares e moleculares ainda precisam ser
elucidados. Adicionalmente, outros parmetros inflamatrios que podem
contribuir para a disfuno cardiovascular devem ser avaliados, visto que outros
dois trabalhos mostraram que a ativao do FPR2/ALX na sepse resulta em
diminuio da resposta inflamatria excessiva (Kim et al., 2010; Sordi et al.,
2013).
Nesse contexto, o principal objetivo deste projeto e avancar no
entendimento do envolvimento do FPR2/ALX nas alteraes cardiovasculares
que ocorrem na sepse.
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4. OBJETIVO GERAL E METAS PROPOSTAS INICIALMENTE

4.1 Objetivo geral


Esta proposta de trabalho objetiva estudar o envolvimento do FPR2/ALX
na disfuncao cardiovascular na sepse induzida por pneumonia em
camundongos, bem como se o efeito anti-inflamatrio resultante da estimulao
deste receptor contribui para seus efeitos cardiovasculares.

4.2 Metas
Iniciamos o projeto cumprindo as seguintes metas relacionadas ao estudo
das aes anti-inflamatrias resultantes da estimulao do receptor FPR2/ALX
no modelo de sepse induzida por pneumonia:
Avaliao de alguns efeitos anti-inflamatrios e pr-inflamatrios da
estimulao do receptor (perfil de citocinas, produo de NO e espcies
reativas de oxignio [ERO], etc) para verificao de congruncia temporal
com os efeitos cardiovasculares;
Meta parcialmente atingida (em torno de 80%). Os resultados
esto apresentados nas Figuras de 1-10.
Avaliar quais possveis vias de sinalizao intracelular ativadas pelo
receptor FPR2/ALX explicam suas aes cardiovasculares e se so as
mesmas dos seus efeitos na resposta inflamatria.
Meta parcialmente atingida (em torno de 70%). Os resultados
esto apresentados nas Figuras de 12-16.
Avaliar temporalmente a capacidade contrtil de anis de aorta e de
microvasos no modelo de sepse induzida por pneumonia em
camundongos e os efeitos decorrentes da estimulao/bloqueio do
receptor FPR2/ALX;
Meta parcialmente atingida (50%). O resultado est apresentado
na Figura 11.
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A principal dificuldade tecnica do estudo e a avaliacao da funcionalidade


cardiaca em camundongos. Um experimento piloto foi realizado para avaliar a
funcao cardiaca de camundongos atraves da tecnica de coracao perfundido de
Langendorff, mas no obtivemos sucesso. H possibilidade de realizar essa
avaliao atravs de ecocardiografia transtorcica, entretanto, esse experimento
est sendo planejado pois requer o deslocamento para Ribeiro Preto, que o
local onde encontra-se o equipamento. Dessa forma, as seguintes metas ainda
no foram atingidas e encontram-se dentro do planejamento e cronograma para
o perodo de prorrogao:
Avaliar temporalmente a atividade cardiaca basal e estimulada no modelo
de sepse induzida por pneumonia em camundongos e os efeitos
decorrentes da estimulao/bloqueio do receptor FPR2/ALX;
Avaliar temporalmente a presso arterial invasiva e no invasiva no
modelo de sepse induzida por pneumonia em camundongos e os efeitos
decorrentes da estimulao/bloqueio do receptor FPR2/ALX.
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5. RESULTADOS

5.1 Efeito da estimulao do receptor FPR2/ALX na sobrevida apos a


inoculacao de Klebsiella pneumoniae

A Figura 1 mostra a taxa de sobrevida dos animais aps a instilao


intratraqueal (i. t.) da bacteria Klebsiella pneumoniae. Os animais controle, os
quais receberam a inoculacao de PBS i.t. e foram tratados com o peptdeo
agonista do FPR2/ALX, sobreviveram. Os animais que foram inoculados com 1 x
109 UFC de K. pneumoniae apresentaram uma taxa de mortalidade em torno de
60%. Confirmando dados prvios (Horewicz et al., 2014), o estmulo do
FPR2/ALX com o peptdeo WKYMVm aumenta em 40% a sobrevida dos animais
com sepse induzida por pneumonia.

Figura 1. Efeito da estimulao do receptor FPR2/ALX pelo agonista WKYMVm


na sobrevida de camundongos apos a inoculacao de Klebsiella pneumoniae. Os
animais foram inoculados (i.t.) com 1 x 109 UFC de K. pneumoniae e receberam
duas doses de WKYMVm (4 mg/kg, s.c.; 2 h e 14 h ps-sepse; crculos azuis) ou
veiculo (PBS; crculos vermelhos) apos a inducao da sepse. Os animais controle
receberam a inoculacao do mesmo volume de PBS e receberam duas doses de
WKYMVm (4 mg/kg, s.c.; 2 h e 14 h ps-instilao; crculo aberto). A sobrevida
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foi avaliada por ate 5 dias. Os resultados foram expressos como porcentagem
de sobrevivencia. A analise estatistica utilizada foi o teste de log rank. * p < 0,05
(controle versus PS) e # p < 0,05 (PS versus PS + WKYMVm). n = 8 por grupo.

Todos os animais submetidos a inoculacao de 1 x 109 UFC de K.


pneumoniae apresentaram os sinais classicos de sepse como piloerecao,
letargia, taquipneia e secreo sanguinolenta ocular (dados no mostrados).
Esses sinais apresentaram-se muito menos evidentes nos animais spticos que
foram tratados com o peptdeo agonista do FPR2/ALX.

5.2 Marcadores de dano de orgaos

Para uma melhor compreensao do efeito da estimulacao do receptor


FPR2/ALX na patognese da sepse no modelo de sepse induzida por
pneumonia, foi realizada a avaliacao de alguns marcadores plasmaticos de
disfuncao de orgaos: aspartato aminotransferase (AST; marcador de dano
hepatico e renal) e alanina aminotransferase (ALT; marcador de dano hepatico e
muscular). Pode ser observado na Figura 2 a presenca de disfuncao hepatica
evidenciada pelo aumento dos niveis plasmaticos de AST em 6 e 24 h aps a
induo da sepse (A e B, respectivamente) e ALT em 24 h (D). Ja as
concentracoes plasmaticas de ALT em 6 h (C) nao diferiram entre os grupos
experimentais. A infeccao por K. pneumoniae tambem levou a um possivel dano
renal agudo pelo aumento dos niveis de AST em 6 e 24 h apos a infeccao (A e
B, respectivamente). Vinte e quarto horas aps a infeco, os animais que foram
tratados com o peptdeo WKYMVm, agonista seletivo para o receptor
FPR2/ALX, tiveram os valores desses marcadores semelhantes aos dos animais
controle (B e D). Esses dados esto de acordo com o trabalho de Gobbetti et al.
(2014), que tambm encontraram elevados nveis de AST e ALT no plasma de
animais com sepse polimicrobiana (modelo de CLP ligadura e perfurao do
ceco).
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Figura 2. Dosagem de marcadores de danos de orgaos em camundongos


inoculados com K. pneumoniae. Seis e 24 h apos a inoculacao (i.t.) dos animais
com 1 x 109 UFC de K. pneumoniae, os camundongos foram sacrificados e as
amostras de plasma foram obtidas e ensaiadas para dosagem de aspartato
aminotransferase (AST; A e B) e alanina aminotransferase (ALT; C e D). Os
resultados representam a media erro padrao da media de 8 animais por grupo.
*p < 0,05 em relacao ao grupo Naive e # p < 0,05 em relacao ao grupo PS
(ANOVA de uma via seguida pelo post hoc de Tukey).
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5.3 Determinacao quantitativa da atividade da creatinafosfoquinase (CK) no


plasma

O comprometimento da funcionalidade de alguns orgaos e sistemas


(Figura 2) ilustra a relevancia e a gravidade deste modelo, o que nos leva a
acreditar que com a quantidade de bacteria que inoculamos, este pode ser
considerado um modelo de sepse grave e choque septico.
Inserida na miriade de alteracoes organicas induzidas pela inflamacao
sistemica no paciente septico, a disfuncao miocardica, tambem denominada
miocardiopatia septica (Muller-Werdan et al., 2006), esta entre as principais
causas de obitos de pacientes com sepse grave/choque septico (Kumar et al.,
2011).
A avaliacao da atividade plasmatica da creatinafosfoquinase (CK), dentre
outros marcadores, tem demonstrado uma correlacao positiva entre a ocorrencia
de choque septico, o aumento desta na circulacao e a ocorrencia de maiores
taxas de mortalidade em seres humanos (Arlati et al., 2000). A CK esta presente
no cerebro, musculo esqueletico e no musculo cardiaco e existem tres isoformas
compostas de duas subunidades cada: a CK-BB que esta associada a lesao
cerebral e pulmonar, CK-MM que esta associada a lesoes de musculo
esqueletico e a CK-MB, associada a lesoes cardiacas. Neste trabalho foi
avaliada a atividade plasmatica de CK-MB, cuja elevacao indica lesao de celulas
cardiacas. Como observado na Figura 3, no tempo de 6 h, a atividade da CK-MB
no plasma dos animais nao diferiu entre os grupos experimentais (A). Ja em 24
h apos a infeccao houve um aumento significativo da atividade da CK-MB no
plasma dos animais septicos (B). Interessantemente, 24 h apos a infeccao, o
estmulo do FPR2/ALX com o peptdeo agonista reduziu a atividade plasmtica
de CK-MB nos animais pneumospticos (B).
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Figura 3. Atividade plasmatica de creatinafofoquinase isoforma MB (CK-MB).


Seis e 24 h apos a inoculacao (i.t.) de 1 x 10 9 UFC de K. pneumoniae, os
camundongos foram sacrificados e as amostras de plasma foram obtidas. Cada
barra representa a media erro padrao da media, n = 8. * p < 0,05 em relacao
ao grupo Naive e # p < 0,05 em relao ao grupo PS (ANOVA de uma via
seguida pelo post hoc de Tukey).

Considerando todos os parametros avaliados anteriormente (AST, ALT e


CK-MB), as principais alteracoes na patogenese da sepse frente a estimulacao
do receptor FPR2/ALX foram observadas no tempo de 24 h apos a infeccao.
Sendo assim, os estudos para avaliar o envolvimento do receptor FPR2/ALX na
disfuno cardiovascular da sepse foram realizados neste tempo.

5.4 Avaliao da expresso proteica do receptor FPR2/ALX no corao de


camundongos spticos

A expresso proteica do receptor FPR2/ALX no corao de camundongos


foi avaliada por Western blot. Como pode ser observado na Figura 4, o receptor
FPR2/ALX est expresso constitutivamente no tecido cardaco de camundongos
saudveis e a induo de sepse aumenta de forma significante a expresso
desse receptor. A estimulao do FPR2/ALX com o peptdeo WKYMVm no
altera a expresso do receptor induzida pela pneumosepse. Recentemente, foi
relatado um aumento na expresso do mRNA do FPR2/ALX em tecido cardaco
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de camundongos com sepse induzida por CLP (24 h ps-sepse) (Gobbetti et al.,
2014).

Figura 4. Avaliacao da expressao proteica do receptor FPR2/ALX em


camundongos inoculados com K. pneumoniae. Vinte e quatro horas apos a
instilao intratraqueal de 1 x 109 UFC de K. pneumoniae, os animais foram
sacrificados e o coracao coletado. Painel A: Imunoeletroforese representativa
para FPR2/ALX. Painel B: densitometria. Cada barra representa a media erro
padrao da media, n = 4. * p < 0,05 em relacao ao grupo Naive (ANOVA de uma
via seguida pelo teste de Tukey).

5.5 Dosagem de citocinas por citometria de fluxo

A presenca de citocinas na circulacao e um importante marcador da


inflamacao sistemica que ocorre na sepse, sendo as principais citocinas pro-
inflamatorias a IL-1, o TNF e a IL-6. Essas citocinas tambm esto envolvidas
na disfuno miocrdica da sepse. Sendo assim, avaliamos a presenca de
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citocinas pro- e anti-inflamatorias nas amostras de soro e do corao dos


animais.
Inicialmente, as citocinas seriam avaliadas por ELISA (Enzyme Linked
Immuno Sorbent Assay). Entretanto, como a quantificacao de citocinas atraves
desse mtodo demanda grande quantidade de amostra e tempo para sua
realizacao, optamos ao longo do desenvolvimento do estudo por utilizar o kit
CBA (Cytometric Bead Array) para quantificacao de citocinas por citometria de
fluxo.
Foi utilizado o BD CBA Mouse Inflammation kit (IFN-,TNF, IL-12p70,
MCP-1, IL-6, e IL-10) e realizada a citometria de fluxo (FACSCanto II, BD
Biosciences, San Jose, CA, EUA). Em resumo, os sobrenadantes e os padroes
das citocinas (provenientes do kit) foram incubados com microesferas de
captura, as quais foram recobertas com anticorpos especificos para as
respectivas citocinas e tambem com o anticorpo de deteccao marcado com
ficoeritrina (do ingles, phycoerythrin, PE). Apos incubacao por 2 h, em ambiente
protegido da luz e em temperatura ambiente, foram adicionados 500 L da
solucao de lavagem (proveniente do kit) e realizada a centrifugacao por 5
minutos, a 1200 g. O sobrenadante foi desprezado e o pellet foi suspendido com
200 L da solucao de lavagem. Em seguida, as amostras foram avaliadas no
citmetro de fluxo FACSCanto II (BD Biosciences). Os resultados obtidos
foram analisados pelo software FCAP Array (BD Biosciences) e expressos em
picogramas por mililitro (pg/ml) de plasma ou picograma por miligrama (pg/mg)
de protena total do corao.
Conforme pode ser observado na Figura 5, os nveis sricos e cardacos
das citocinas IL-12p70 (A e B), IFN-(C e D) e IL-10 (K e L) no apresentaram
diferenas significativas entre os grupos. Uma maior quantidade de TNF foi
encontrada no soro dos animais pneumospticos (E), entretanto, no corao, os
nveis de TNF permaneceram iguais entre os grupos (F). Nveis mais altos de
MCP-1 foram encontrados no soro e no corao dos animais spticos (G e H).
De forma interessante, a quantidade de IL-6 aumentou no soro e no corao dos
animais spticos e o estmulo do receptor FPR2/ALX com o peptdeo agonista
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bloqueou o aumento da IL-6 induzido pela pneumosepse (I e J). Essa


modulao na produo de IL-6 frente a estimulao do FPR2/ALX com o
peptdeo WKYMVm embasa a nossa hiptese de que a ativao desse receptor
previne a disfuno cardaca que ocorre na sepse.
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Figura 5. Dosagem de citocinas pro e anti-inflamatorias no soro e no coracao de


camundongos inoculados com K. pneumoniae. Vinte e quarto horas apos a
inoculacao (i.t.) de 1 x 109 UFC de K. pneumoniae, os camundongos foram
sacrificados e as amostras de soro (A, C, E, G, I e K) e corao (B, D, F, H, J e
L) foram obtidas e ensaiadas para dosagem de IL-12p70 (A e B), IFN-(C e D),
TNF (E e F), MCP-1 (G e H), IL-6 (I e J) e IL-10 (K e L) por citometria de fluxo.
Cada barra representa a media erro padrao da media, n = 5. * p < 0,05 em
relacao ao grupo Naive e # p < 0,05 em relacao ao grupo PS (ANOVA de uma
via seguida pelo post hoc de Tukey).

5.6 Avaliacao da expressao proteica das enzimas oxido nitrico sintases


(NOS) e da producao de oxido nitrico

Outro importante marcador da sepse e a producao de oxido nitrico (NO)


pelas enzimas NOS, principalmente, pela isoforma induzida (NOS-2). Assim,
avaliamos o perfil de expressao proteica das tres isoformas das NOS (NOS-1,
neuronal; NOS-2, induzida; NOS-3, endotelial) nas amostras de coracao, bem
como quantificamos o NO (nitrito + nitrato) no plasma dos animais.
Como podemos observar, houve o aumento da expressao da isoforma
NOS-2 nas amostras de coracao (Figura 6) dos animais septicos 24 h apos a
infeccao, entretanto, o estimulo do receptor FPR2/ALX com o peptideo agonista
nao alterou a expressao da NOS-2 induzida pela pneumosepse. Em relacao a
expressao das enzimas NOS-1 (Figura 7) e NOS-3 (Figura 8) nos coracoes dos
animais, nao houve diferenca estatistica entre os grupos avaliados.
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Figura 6. Avaliacao da expressao proteica da enzima NOS-2 em camundongos


inoculados com K. pneumoniae. Vinte e quatro horas apos a instilacao
intratraqueal de 1 x 109 UFC de K. pneumoniae, os animais foram sacrificados e
o coracao coletado. Painel A: Imunoeletroforese representativa para NOS-2.
Painel B: densitometria. Cada barra representa a media erro padrao da media,
n = 4. * p < 0,05 em relacao ao grupo Naive (ANOVA de uma via seguida pelo
teste de Tukey).
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Figura 7. Avaliacao da expressao proteica da enzima NOS-1 em camundongos


inoculados com K. pneumoniae. Vinte e quatro horas apos a instilacao
intratraqueal de 1 x 109 UFC de K. pneumoniae, os animais foram sacrificados e
o coracao coletado. Painel A: Imunoeletroforese representativa para NOS-1.
Painel B: densitometria. Cada barra representa a media erro padrao da media,
n = 4.
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Figura 8. Avaliacao da expressao proteica da enzima NOS-3 em camundongos


inoculados com K. pneumoniae. Vinte e quatro horas apos a instilacao
intratraqueal de 1 x 109 UFC de K. pneumoniae, os animais foram sacrificados e
o coracao coletado. Painel A: Imunoeletroforese representativa para NOS-3.
Painel B: densitometria. Cada barra representa a media erro padrao da media,
n = 4.

Coincidindo com o aumento da expressao da NOS-2 nas amostras de


coracao dos animais septicos, detectamos elevados niveis de NO no plasma dos
animais 24 h apos a infeccao. Interessantemente, o estimulo do FPR2/ALX com
o peptdeo agonista diminuiu os nveis plasmticos de NO nos animais
pneumospticos (Figura 9).
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Figura 9. Dosagem de nitrato + nitrito (NOx) no plasma de camundongos


inoculados com K. pneumoniae. Vinte e quarto horas apos a inoculacao (i.t.) dos
animais com 1 x 109 UFC de K. pneumoniae, os camundongos foram
sacrificados e as amostras de plasma foram obtidas e processadas para a
quantificacao de NOx pelo metodo de Griess. Cada barra representa a media
erro padrao da media, n = 8. * p < 0,05 em relacao ao grupo Naive e # p < 0,05
em relao ao grupo PS (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Tukey).

Do ponto de vista das alteracoes estruturais como pecas-chave para a


disfuncao cardiaca da sepse, Celes et al. (2007) sugeriram, com base no
aumento da expressao da NOS-2 e elevacoes do peroxinitrito em coracoes de
camundongos septicos, que o estresse oxidativo pode desempenhar papel
importante no aumento da permeabilidade do sarcolema, rompimento dos
filamentos de actina e miosina e na deiscencia dos discos intercalares dos
cardiomiocitos, comprometendo o acoplamento eletroquimico e a funcionalidade
cardiaca. Resultados similares foram encontrados em um estudo histologico e
imunohistoquimico em coracoes humanos de pacientes com choque septico e
disfuncao miocardica, o qual tambem demonstrou aumento na expressao da
enzima NOS-2 e do peroxinitrito, alem da nitrotirosina, estando esses achados
associados a presenca de ruptura dos filamentos actina e miosina (Rossi et al.,
24

2007). Assim, apesar da estimulao do FPR2/ALX com o peptdeo WKYMVm


no alterar a expresso da NOS-2 induzida pela sepse, a ativao do receptor
pode estar modificando a atividade da enzima, visto que a produo sistmica
de NO foi reduzida. Dessa forma, esses dados embasam a hiptese de que o
mecanismo de preveno da miocardiopatia sptica frente a ativao do
FPR2/ALX envolve a modulao da produo local de NO. Para confirmar essa
hiptese, sero realizados os ensaios utilizando sondas fluorescentes para a
deteco intracelular de NO (bem como de nion superxido e peroxinitrito) nos
cardiomicitos.

5.7 Mensuracao dos niveis intracelulares das especies reativas de oxigenio

Uma das propriedades mais descritas do peptdeo WKYMVm e a sua


capacidade de induzir a producao de especies reativas de oxigenio (EROs),
como o anion superoxido (Cattaneo et al., 2013). Sabendo que o anion
superoxido pode reagir com o NO e formar peroxinitrito (quando quantidades
estequiometricas destas especies sao geradas), avaliamos a producao de EROs
induzida pela ativao do FPR2/ALX em clulas de msculo liso de aorta de
ratos (clulas A7r5). Como esperado (Figura 10), o estmulo das clulas com
LPS/IFN induziu a formao de EROs. O peptdeo WKYMVm per se tambm
induziu a formao de EROs, entretanto, o resultado do estmulo concomitante
com LPS/IFN e WKYMVm no apresentou diferena quando comparado aos
outros grupos. Esse resultado ser confirmado com um ensaio de mensurao
de peroxinitrito e, mais importante, ser realizado tambm em cultura de
cardiomicitos.
25

Figura 10. Efeito do agonista WKYMVm sobre a producao de EROs em celulas


do musculo liso vascular. Celulas da linhagem A7r5 foram carregadas com a
sonda fluorescente DCF-DA (5 M) por 30 min, lavadas, e entao expostas ou
nao (veiculo) ao LPS (1 g/ml) e IFN- (200 U/ml). WKYMVm (1 M) foi
adicionado as celulas logo apos o estimulo com LPS/IFN. Celulas nao
estimuladas com LPS/IFN tambm foram tratadas com WKYMVm (1 M) e a
intensidade de fluorescncia foi quantificada em multileitora de placas. Cada
barra representa a media erro padrao da media, n = 3. * p < 0,05 em relacao
ao grupo veculo (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Tukey).

5.8 Efeito da estimulacao do FPR2/ALX na resposta contratil a fenilefrina


em aorta isolada de camundongos septicos

Dentre as principais caracteristicas do choque septico estao hipotensao e


hiporreatividade a agentes vasoconstritores. Podemos observar na Figura 11
que 24 h apos a inoculacao da K. pneumoniae, os anis de aortas dos animais
apresentaram uma resposta reduzida ao agente vasoconstritor fenilefrina. J os
anis de aortas dos animais spticos que foram tratados com o peptdeo
WKYMVm apresentaram uma resposta contrtil similar aos anis de aortas dos
animais naive.
26

Figura 11. Curvas concentracao-resposta para fenilefrina em aneis de aorta com


endotelio de camundongos. Aneis de aorta toracica dos grupos naive,
pneumosepticos (PS) e pneumosepticos tratados com WKYMVm
(PS+WKYMVm) foram submetidos a curva concentracao-efeito para fenilefrina
(10-9 10-4 mol/L). Os pontos representam a media erro padrao da media, n=4.
ANOVA de duas vias seguido pelo teste de Bonferroni. * p < 0,05 comparado ao
Naive e # p < 0,05 comparado ao grupo PS.

5.9 Investigao das vias de sinalizao intracelular ativadas pelo


mecanismo de ao anti-inflamatria induzido pela estimulao do
receptor FPR2/ALX com o peptdeo WKYMVm

5.9.1 Avaliao da ativao da via do fator de transcrio nuclear kappa B


(NFB)
O NFB regula a transcricao de mais de 150 genes, particularmente os
relacionados a atividade pro-inflamatoria, como o tnf, il-6 e nos-2. O
reconhecimento do lipopolissacardeo bacteriano por receptores presentes na
membrana das clulas induz a translocacao nuclear do NFB. A Figura 12
mostra a expressao proteica citoplasmatica do NFB, e a diminuicao na
densidade das bandas no grupo sptico indica, de forma indireta, a ativao e
translocao nuclear do fator. O agonismo do receptor FPR2/ALX com o
27

peptdeo WKYMVm no bloqueou a diminuio da expresso do NFB induzida


pela pneumosepse.

Figura 12. Avaliacao da expressao proteica do fator de transcricao nuclear


kappa B (NFB) em camundongos inoculados com K. pneumoniae. Vinte e
quatro horas apos a instilacao intratraqueal de 1 x 109 UFC de K. pneumoniae,
os animais foram sacrificados e o coracao coletado. Painel A: Imunoeletroforese
representativa para NFB. Painel B: densitometria. Cada barra representa a
media erro padrao da media, n = 6. * p < 0,05 em relacao ao grupo Naive
(ANOVA de uma via seguida pelo teste de Tukey).
28

5.9.2 Avaliao da expresso da protena Rho-A

A funcao da via Rho-A/Rho-cinase tem sido pouco estudada na sepse.


Sabe-se que arterias mesentericas de ratos endotoxemicos tem um aumento na
expressao da Rho-A e Rho-cinase, o que leva ao aumento dos niveis de miosina
fosfatase. Porem, isso nao induziu a maior contratilidade de aneis de arterias
mesentericas, provavelmente porque essa reposta e inibida pelos maiores niveis
de GMPc, que nesse caso estariam modulando negativamente a via Rho-A/Rho-
cinase (Da Silva-Santos et al. 2009). Outro trabalho demonstrou que a ativao
do FPR2/ALX com LXA4 induz o aumento da expresso proteica da Rho-A e
vasoconstrio em anis de aorta de ratos (na ausncia de sinais inflamatrios).
Ainda, a vasoconstrio induzida pela LXA4 foi bloqueada frente utilizao de
um inibidor da via Rho-A/Rho-cinase (Wenceslau et al., 2014). Contrariamente
aos achados da literatura, nossos dados mostram uma importante reduo na
quantidade da protena Rho-A no corao dos animais spticos, e o estmulo do
FPR2/ALX com o peptdeo WKYMVm no bloqueia esse efeito (Figura 13).
Embora no tenha sido avaliada a expresso proteica da Rho-A em aortas de
camundongos spticos, o estmulo do FPR2/ALX com o peptdeo WKYMVm
reverte a hiporreatividade fenilefrina in vitro (causada pelo LPS) e in vivo
(causada pela sepse) (Horewicz et al., 2014). Mais estudos so necessrios
para elucidar a participao dessa via nos efeitos anti-inflamatrios
cardiovasculares induzidos pela ativao do FPR2/ALX durante a sepse
induzida por pneumonia.
29

Figura 13. Avaliacao da expressao proteica da Rho-A em camundongos


inoculados com K. pneumoniae. Vinte e quatro horas apos a instilacao
intratraqueal de 1 x 109 UFC de K. pneumoniae, os animais foram sacrificados e
o coracao coletado. Painel A: Imunoeletroforese representativa para Rho-A.
Painel B: densitometria. Cada barra representa a media erro padrao da media,
n = 6. * p < 0,05 em relacao ao grupo Naive (ANOVA de uma via seguida pelo
teste de Tukey).

5.9.3 Avaliao da expresso proteica da SERCA

sabido que o ion calcio e o principal agente responsavel pela cinetica


de contracao e relaxamento do miocardio e, desta forma, diversos trabalhos ao
longo dos ultimos anos procuraram demonstrar que as alteracoes das moleculas
30

relacionadas com a cinetica do trafego deste cation nos cardiomiocitos sao as


principais causadoras da disfuncao miocardica durante a sepse (Figura 14)
(Rudiger e Singer, 2007).

Figura 14. Principais estruturas envolvidas no trafego de ion calcio nos


cardiomiocitos e provaveis sitios de modulacao por moleculas produzidas
durante a sepse. L: canal de calcio voltagem-dependente do tipo L (lento),
responsavel pela entrada de calcio extracelular mediante despolarizacao do
potencial de membrana; NOS-3: enzima oxido nitrico sintase 3 ou neuronal; RS:
reticulo sarcoplasmatico, principal estoque intracelular de ion calcio; RyR:
receptor de rianodina, responsavel pela liberacao de ions calcio do RS para o
citoplasma a partir de estimulo por calcio; NOS-1: enzima oxido nitrico sintase 1
ou endotelial; SERCA: transportador de calcio do RS dependente de ATPase,
responsavel pela recaptacao do calcio liberado pelo RyR; Ph: fosfolambana,
proteina reguladora negativa da atividade da SERCA. Modificado de Rudiger &
Singer (2007).

H evidncias de que a ativao do FPR2/ALX pelo WKYMVm resulta em


influxo de clcio, entretanto, os nveis de expresso proteica da SERCA no
corao apresentaram-se iguais em todos os grupos experimentais avaliados
(Figura 15). Um estudo mais aprofundado devera ser conduzido para avaliar os
31

efeitos da estimulacao/bloqueio do FPR2/ALX nas estruturas envolvidas no


trafego de ion calcio nos cardiomiocitos de animais septicos.

Figura 15. Avaliacao da expressao proteica da SERCA em camundongos


inoculados com K. pneumoniae. Vinte e quatro horas apos a instilacao
intratraqueal de 1 x 109 UFC de K. pneumoniae, os animais foram sacrificados e
o coracao coletado. Painel A: Imunoeletroforese representativa para SERCA.
Painel B: densitometria. Cada barra representa a media erro padrao da media,
n = 6.
32

5.9.4 Investigao da participao da GRK2

Existem evidencias demonstrando que a hiporresponsividade


cardiovascular observada em algumas patologias e regulada pelas cinases de
receptores acoplados a proteina G (GRKs), as quais fosforilam, dentre outros, os
receptores adrenergicos acoplados a essa proteina (GPCRs). Uma vez
fosforilado, ha um aumento na afinidade desses receptores as arrestinas,
proteinas que internalizam GPCRs, tornando-os, portanto, indisponiveis para a
ligacao com os agonistas (Penn et al., 2000). Existem tambem evidencias que
as GRKs medeiam a hiporresponsividade de receptores -adrenergicos
cardiacos (Rockman et al., 1998). Dados previos do nosso laboratorio mostram
que a expressao da GRK2 esta aumentada nos tecidos cardacos e na aorta de
camundongos septicos, podendo contribuir para uma rapida internalizacao dos
receptores e -adrenergicos, levando a hiporresponvidade cardiovascular
grave observada durante a sepse. Alem disso, foi demonstrado tambem que
este aumento da expressao da GRK2 e significantemente prevenido no
miocardio e na aorta de animais septicos tratados com o inibidor seletivo da
NOS-2 (1400W) (Dal-Secco et al., dados no publicados). Corroborando com
esses dados, a Figura 16 mostra um aumento da expresso proteica da GRK2
no corao de animais com pneumosepse, entretanto, a ativao do FPR2/ALX
com o peptdeo agonista no bloqueia o aumento induzido pela infeco. Esse
um dado intrigante que vai contra a hiptese de que o peptdeo WKYMVm
estaria inibindo a atividade da NOS-2 no corao dos animais spticos. Mais
estudos esto sendo realizados para elucidar esse mecanismo.
33

Figura 16. Avaliacao da expressao proteica da GRK2 em camundongos


inoculados com K. pneumoniae. Vinte e quatro horas apos a instilacao
intratraqueal de 1 x 109 UFC de K. pneumoniae, os animais foram sacrificados e
o coracao coletado. Painel A: Imunoeletroforese representativa para GRK2.
Painel B: densitometria. Cada barra representa a media erro padrao da media,
n = 6. * p < 0,05 em relacao ao grupo Naive (ANOVA de uma via seguida pelo
teste de Tukey).
34

6. CONCLUSES

Os principais achados do presente estudo podem ser resumidos da


seguinte forma: i) o estmulo do FPR2/ALX previne a resposta inflamatria
exacerbada da sepse atravs da reduo dos nveis de xido ntrico e de
citocinas pr-inflamatrias; ii) esse efeito anti-inflamatrio contribui para a
preveno da disfuno de mltiplos rgos (fgado e rim) e pode ter um
importante efeito benfico na miocardiopatia sptica que ainda ser avaliada; iii)
o efeito cardiovascular da estimulao do receptor FPR2/ALX com o peptdeo
WKYMVm parece envolver a regulao da atividade da enzima NOS-2, visto que
a expresso proteica da enzima no foi alterada no corao dos animais
spticos; iv) o peptdeo WKYMVm per se induz a formao de espcies reativas
de oxignio em clulas do msculo liso vascular - esse efeito precisa ser melhor
investigado pois pode representar um dos mecanismos de ao intracelular da
ativao do FPR2/ALX.
35

7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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37

8. ATIVIDADES ACADMICAS DESENVOLVIDAS DURANTE O PERODO DE


VIGNCIA DA BOLSA

8.1 Orientao em andamento

Thiele Osvaldt Rosales. Contribuio das cinases de receptores acoplados a


protena G (GRKs) na reatividade do leito renal na sepse. Incio: 2015.
Dissertao (Mestrado; Programa de Ps-Graduao em Farmacologia) -
Universidade Federal de Santa Catarina, Coordenao de Aperfeioamento de
Pessoal de Nvel Superior. (Co-orientadora).

8.2 Participao em eventos

First International Symposium on Inflammatory Diseases. Ribeiro Preto, SP.


2015.

XIII Frum Internacional de Sepse. So Paulo, SP. 2016. Thiele Osvaldt


Rosales, Daniela Dal-Secco, Vernica Vargas Horewicz, Jamil Assreuy
Involvement of G protein-coupled receptor kinases (GRKs) in renal vascular
reactivity in septic shock.

8.3 Organizao de evento

XIII Curso de Inverno de Farmacologia, Programa de Ps-Graduao de


Farmacologia (PPGFMC), Centro de Cincias Biolgicas, Universidade Federal
de Santa Catarina (UFSC). Perodo: 24 a 30 de julho de 2016.

8.4 Participao em bancas de trabalhos de concluso

Participao em banca de Danillo Macdo Gomes. O efeito vasorrelaxante


induzido por extrato de Euterpe edulis Mart. envolve mltiplas vias de
38

transduo endoteliais. 2016. Dissertao (Mestrado em Farmacologia) -


Universidade Federal de Santa Catarina.

Participao em banca de Mariana Dalagnol. Desenvolvimento de sistemas de


liberao nano- e/ou microestruturados contendo sinvastatina para a liberao
colnica visando o tratamento do cncer colorretal. 2016. Tese (Doutorado em
Nanotecnologia Farmacutica) - Universidade Federal de Santa Catarina.

8.5 Projetos de pesquisa em colaborao

Caracterizao dos perfis muscular e pulmonar na pneumosepse induzida por


Klebsiella pneumoniae: um estudo de carter temporal dos mediadores
inflamatrios. Coordenador: Deborah de C. Hizume Kunzler. Integrantes: Kelly
Cattelan Bonorino, Dbora Melissa Petry, Gisele Henrique Cardoso, Jssica
Jorge Probst, Lucas Santos da Silveira, Adair Roberto Soares dos Santos,
Franciane Bobinski e Vernica V. Horewicz.

Anlise dos efeitos do exerccio fsico aerbio sobre a inflamao e estresse


oxidativo pulmonares em um modelo experimental de pneumosepse induzida
por Klebsiella pneumoniae em diferentes concentraes. Coordenador: Deborah
de C. Hizume Kunzler. Integrantes: Alice Henrique dos Santos Sumar, Kelly
Cattelan Bonorino, Gisele Henrique Cardoso, Jssica Jorge Probst, Ariany
Marques Vieira, Vernica Vargas Horewicz, Franciane Bobinski, Daniel
Fernandes Martins.

8.6 Artigo aceito para publicao

Livia H. Yamashiro, Carolina Eto, Marina Soncini, Veronica Horewicz, Magno


Garcia, Aline Schlindwein, Edmundo Grisard, Darcita Rovaris and Andre Bafica.
IL-1 and TNF produced through Mycobacterium tuberculosis sensing
39

cooperate with active isoniazid to enhance pathogen killing in a human


granuloma model. European Journal of Immunology. May, 2016.

8.7 Artigo submetido para publicao

Flvia Regina Greiffo, Brbara Fortkamp, Gabriel Ribeiro de Freitas, Juliana


Keller Nascimento, Thayse R. Bruggemann, Leonardo C. M. vila, Adenir Perini,
Franciane Bobinski, Morgana Duarte da Silva, Fernanda da Rocha Lapa,
Rodolfo de Paula Vieira, Vernica V. Horewicz, Adair Roberto Soares Santos,
Kelly Cattelan Bonorino, Deborah de C. Hizume Kunzler. Aerobic exercise
decreases lung inflammation by IgE decrement in an OVA mice model. Medicine
& Science in Sports & Exercise. Jan. 2016.

8.8 Artigos em fase de finalizao

M C Gonalves, V Horewicz, D Luckemeyer, A Prudente and J Assreuy.


Severity score of sepsis associated to mortality and bacterial spreading: bacterial
load and inflammatory profile of different tissues.

Lucas B Souza; Daniela Dal-Secco; Vernica V Horewicz; Fernando Q Cunha


and Jamil Assreuy. Hydrogen sulfide improves vascular hyporesponsiveness
during sepsis via a G-protein receptor kinase (GRK)-2 expression-dependent
mechanism.

Janaina Kieling Frhlich, Taciane Stein, Vernica Horewicz, Jamil Assreuy,


Carlos Rogrio Tonussi, Elenara Lemos-Senna. Characterization and
optimization of pegylated lipid nanocarriers containing dichloromethane fraction
from Jatropha isabellei (Mll Arg) for intravenous administration.