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Guia de Atividades

Prticas em

Biologia Celular

Larissa Fonseca Andrade Vieira


Milene Miranda Praa Fontes
Wellington Ronildo Clarindo

Universidade Federal do Esprito Santo


Centro de Cincias Agrrias
Departamento de Produo Vegetal
SUMRIO

Atividades Prticas Pgina

01 - Microscpio de luz............................................................................................... 1

02 - ptica do microscpio e qualidade da observao..................................... 11

03 - Preparao de lminas e Cortes Histolgicos.............................................. 17

04 - Mtodos Citoqumicos e Organizao Molecular........................................ 25

05 - Clulas Procariotas e Eucariotas...................................................................... 31

06 - A Clula Vegetal................................................................................................... 36

07 - Permeabilidade Seletiva das membranas........................................................ 43

08 - Movimentos Celulares........................................................................................ 49

09 Ncleo................................................................................................................... 55

10 Ciclo Celular Mitose....................................................................................... 59

11 - Meiose.................................................................................................................... 64

12 Microscopia Eletrnica...................................................................................... 70
Normas de Conduta no Laboratrio
Como se comportar no Laboratrio de Biologia Celular

Alguns cuidados devem ser tomados por parte dos professores, tcnicos, monitores e
estagirios durante a utilizao do Laboratrio de Biologia Celular:

1 No fumar.

2 No se alimentar ou conduzir alimentos para o interior do laboratrio.

3 Usar preferencialmente cala comprida.

4 Usar sapatos fechados.

5 Usar jaleco (preferencialmente com comprimento at o joelho).

6 Manter cabelos compridos presos.

7 Estar consciente do que estiver fazendo, ser disciplinado e responsvel.

8 Respeitar as advertncias do professor, do monitor e do tcnico sobre perigos e


riscos.

9 Para utilizar os produtos qumicos ou equipamentos, necessrio autorizao de


professores, tcnicos ou monitores.

10 Manter hbitos de higiene.

11 No permitido aplicar cosmticos dentro do laboratrio.

12 Guardar casacos, pastas e bolsas, nas reas indicadas, e no na bancada onde


podem ser danificados pelos produtos qumicos.

13 Trabalhar em local livre de obstculos ao redor dos equipamentos.

14 Manusear as substncias qumicas com mximo cuidado.

15 No respirar vapores e gases.

16 No provar reagentes de qualquer natureza.

17 Sempre usar material adequado e seguir o roteiro de aula prtica fornecido pelo
professor, nunca fazer improvisaes ou alterar a metodologia proposta.

18 Ao derramar qualquer substncia, providenciar a limpeza imediatamente,


utilizando material prprio para tal.
19 No jogar nenhum material slido ou lquido dentro da pia ou rede de esgoto
comum.

20 No trabalhar com produtos qumicos sem identificao (sem rtulo).

21 Ao aquecer qualquer substncia em tubo de ensaio, segur-lo com pina


voltando a extremidade aberta do tubo para o local onde no haja pessoas.

22 No local de trabalho e durante a execuo de uma tarefa, falar apenas o


estritamente necessrio.

23 Nunca apanhar cacos de vidro com as mos ou pano. Usar escova ou vassoura.

24 Evitar contato dos produtos com pele, olhos e mucosas, utilizar sempre que
solicitado luvas e culos de segurana.

25 No misturar substncias qumicas ao acaso.

26 No usar vidrarias trincadas ou quebradas.

27 O laboratrio deve ser mantido limpo e livre de todo e qualquer material no


relacionado s atividades nele executadas.

28 proibido o manuseio de maanetas, telefones, puxadores de armrios ou


outros objetos de uso comum, por pessoas usando luvas durante a execuo de atividades em
que agentes infecciosos ou material corrosivo estejam sendo manipulados.

29 Sempre aps a manipulao de substncias qumicas e antes de deixar o


laboratrio lavar as mos.

30 Cada equipe responsvel pelo material utilizado na aula prtica, portanto ao


trmino do experimento limpar e guardar os materiais em seus devidos lugares.

31 No caso de quebra ou dano de vidrarias, materiais ou equipamentos, comunicar


imediatamente ao professor ou ao tcnico responsvel.

32 Ao trmino da aula, desligar todos os equipamentos, fechar pontos de gua e


registro de gs.

33 Em caso de acidentes, avisar imediatamente o professor ou tcnico responsvel.

TENHAM UMA EXCELENTE AULA!


1 Microscopia de Luz
Estrutura e Utilizao do Microscpio de Luz

A Biologia Celular tem como objeto de estudo a Clula. As clulas so as menores


unidades morfolgicas e fisiolgicas de todos os seres vivos, sendo pequenas, complexas e
transparentes, portanto, difcil de estudar em termos de organizao, composio e estrutura.
Mais difcil ainda a elucidao do funcionamento dos diversos compartimentos sub-celulares
e o estabelecimento de como as molculas atuam determinando a estrutura e funo celular.
Neste sentido a Biologia Celular depende, mais do que qualquer outro campo da Biologia, do
desenvolvimento de novos instrumentos e tecnologias que permitem entender como funciona
o Universo Celular.

H uma grande variedade de instrumentos e mtodos disponveis para o estudo dos


componentes celulares. Dentre eles, o microscpio ptico pode ser destacado como o mais
importante, pois permitiu aos biologistas descobrir a existncia das clulas. As primeiras
observaes das clulas no sculo XVII foram realizadas com tcnicas bem simples. Com a
necessidade de se obter mais detalhes da estrutura das clulas, diversas metodologias foram
desenvolvidas a partir da aplicao de tcnicas biofsicas e bioqumicas no contexto celular.
Nesta primeira aula iremos estudar os princpios gerais da Microscopia ptica bem como a
estrutura e utilizao do Microscpio de Luz, nosso instrumento de trabalho durante todo o
semestre letivo.

Princpios da Microscopia ptica

A microscopia se desenvolveu desde o sculo XV com o advento dos microscpios


simples, ou seja, com uma nica lente, que denominamos de lupa. A lupa uma lente
convergente que possibilita uma maior aproximao do objeto ao olho e, por conseguinte, o
aumento da imagem que se formar na retina, quando comparada com o tamanho real do
objeto observado sem uso da lupa. O emprego da lupa manual e a imagem formada
depende do posicionamento do olho prximo a uma das faces da lente da lupa e da
aproximao da mesma em relao ao objeto at que sua imagem fique ntida. Logo, a
imagem ampliada do objeto, formada na retina, depender da distncia do objeto ao olho,
sendo denominada distncia focal. O aumento (A) fornecido pela lupa dado pela razo
entre a distncia do objeto ao olho, convencionada em 25 cm (d) e a distncia focal (f) da
lente:
A = d/f
Apesar de a lupa ser um instrumento muito utilizado at hoje, principalmente para
observaes de organismos de maiores dimenses e em condies de campo, ela no produz
aumento suficiente para observaes citolgicas. As clulas, que em geral possuem de
dimetro variando de 5 a 20 m necessitam ser observadas a partir de instrumentos mais
complexos, que permitem alm do aumento do objeto de estudo, a observao detalhada de

1
estruturas que so indistintos vista humana. Analisando a frmula do aumento apresentada
acima possvel concluir que para a obteno de maior aumento do objeto, com mais nitidez,
a, distncia focal (f) deve ser diminuda. Este fato implica na diminuio do dimetro da lente
utilizada na observao e, conseqentemente, na maior aproximao da lente com o olho.
Desta forma, entre os sculos XVI e XVII foram desenvolvidos os microscpios compostos que
apenas no sculo XIX atingiram padro de qualidade adequado para os estudos citolgicos.
Logo, o microscpio ptico, ou de luz, que conhecemos hoje fruto de avanos no
conhecimento das propriedades da luz e das lentes. Consiste em um microscpio composto
com um conjunto de lentes que, combinadas com uma fonte de luz, so capazes de gerar
uma imagem ampliada do objeto de estudo.

A Estrutura do Microscpio de Luz

O microscpio de luz composto, basicamente, por dois sistemas: o ptico (lentes) e


o mecnico (estruturas que sustentam as lentes) como ser descrito e detalhado a seguir.

A) PARTE MECNICA:

1 P ou Base: o suporte do microscpio, pea que sustenta todas as outras.

2 Estativo ou Brao: a pea que liga a base parte superior do microscpio.

3 Platina ou Mesa: uma pea de formato retangular disposta paralelamente a


base do microscpio. Esta pea destina-se recepo da lmina contendo o material para
estudo. No centro da platina existe uma abertura para passagem da luz. Associada a platina
encontra-se uma pea composta de dois controles cuja funo movimentar a lmina nos
eixos X e Y.

4 Cabeote: a parte superior do microscpio onde se localizam dois tubos,


sendo que em suas extremidades encaixam-se as lentes oculares. Entre os dois tubos localiza-
se a escala de ajuste de distncia interpupilar. No tubo esquerdo encontra-se o anel de ajuste
de dioptrias. O cabeote uma pea frgil que no deve ser usada como apoio e em hiptese
alguma ser utilizado para transportar o microscpio.

5 Revlver ou Porta-objetiva giratria: uma pea circular que permite a


troca e a fixao das objetivas. O disco negro do revlver possui ranhuras para que o
observador possa gir-lo para mudana das objetivas. No se deve tocar nas objetivas para
mudana das mesmas.

6 Controles macromtrico e micromtrico: botes giratrios, encaixados um


ao outro, que permitem movimentos, mais amplos (macromtrico) ou mais delicados
(micromtrico), da platina em direo s objetivas ou vice-versa. Localizam-se lateralmente na
coluna do microscpio. O macromtrico utilizado na focalizao inicial do material em
estudo, enquanto o micromtrico atua no ajuste final da focalizao do material em estudo.

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7 Alavanca de pr-focalizao: na lateral esquerda do brao, entre o controle
macromtrico e o brao do microscpio, encontra-se uma alavanca que impede que a lente
frontal da objetiva toque a superfcie da lmina ou lamnula. Depois de focalizar a amostra
com a ajuda do macromtrico, esta alavanca deve ser girada no sentido horrio para
estabelecer o limite superior do ajuste macromtrico. Essa pea extremamente frgil e deve
ser movimentada com um toque leve, no sendo necessrio o uso de fora por parte do
usurio.

B) PARTE PTICA:

8 Oculares: sistema de lentes prximas ao olho do observador. As oculares


aumentam a imagem do objeto j aumentada pelas objetivas. As oculares so formadas por
duas lentes, a superior (ocular) e a inferior (lente de campo ou colrica). Nas oculares so
encontradas as seguintes informaes: 10x indica o aumento da lente ocular; 20x nmero
de campo, este valor utilizado para calcular o dimetro do campo de viso e est associado
com o aumento de cada objetiva. Por exemplo, se a objetiva de 40x estiver encaixada, para
calcular o dimetro do campo de viso basta dividir o nmero de campo da ocular (20) pelo
aumento da objetiva (40). O resultado 0,5 mm que indica que o dimetro do campo
explorado pela objetiva.

9 Objetivas: so as lentes que se encontram encaixadas no revlver e so


responsveis pelo aumento e pela resoluo da imagem. So sistemas pticos constitudos por
vrias lentes superpostas que, alm de fornecer uma imagem ampliada e invertida do objeto,
procuram corrigir os defeitos ou aberraes da luz que por ela passa.

Na Figura 1.1 esto destacadas as caractersticas das objetivas:

Figura 1.1 Caractersticas de uma objetiva a seco (aumento de 10X) e de uma


objetiva de imerso (100X).

Portanto, cada objetiva possui gravados o aumento que proporciona, a existncia de


correo para o comprimento do tubo e para a presena ou ausncia da lamnula, bem como
a sua abertura numrica (AN). Este ltimo item uma funo da capacidade da objetiva em
coletar luz e um fator determinante do seu poder de resoluo, sendo definido pela frmula:

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sendo:
AN = n sen
n = ndice de refrao do meio que separa a objetiva e a amostra; e
= metade do ngulo do cone de luz que atinge a objetiva.

Figura 1.2 Esquema representando a maior captao de luz pela objetiva. Presena
do leo de imerso entre a lmina de vidro e a lente objetiva, no lado direito do desenho.

Outra caracterstica importante de uma objetiva a sua distncia de trabalho, ou


distncia focal, que constitui a distncia entre a lente frontal da objetiva e a lamnula quando
a amostra est focalizada. Quanto maior o aumento da objetiva, mais ela se aproxima da
preparao microscpica e menor a distncia de trabalho, o que leva a maior perda na coleta
dos raios luminosos.

10 Condensador: um conjunto de lentes situado abaixo da platina, concentra e


torna paralelo o feixe luminoso, fornecendo a luz necessria iluminao do objeto em
estudo. Ao concentrar os raios luminosos, aumenta a quantidade de luz que atravessa o
objeto. O controle de ajuste do condensador est localizado lateralmente, esquerda e abaixo
da platina. Este controle permite a movimentao do condensador que deve ser mantido na
posio mais elevada para a obteno de uma iluminao mxima.

11 Diafragma de ris: pea localizada acima do condensador, que regula a


intensidade do feixe luminoso que chega ao objeto, possibilitando maior nitidez da imagem. A
regulagem do diafragma feita por meio de uma alavanca e para tanto existe uma escala
numrica impressa em branco no diafragma. Os valores de abertura numrica devem
coincidir com os valores de abertura numrica das objetivas, ou seja, a cada mudana de
objetiva o usurio deve regular a abertura do diafragma.

12 Filtro: disco de vidro azul (ou verde) fixado abaixo do diafragma e que permite
a converso da iluminao de halognio em luz branca, exibindo a amostra em suas cores
naturais.

13 Fonte de luz: consiste de uma lmpada halognea embutida na base do


microscpio. O interruptor principal que liga a lmpada localiza-se na lateral. Abaixo do
interruptor encontra-se o boto seletor de intensidade luminosa, que permite regular a
intensidade de luz.

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O funcionamento do Microscpio de Luz

Agora que voc j est familiarizado com o microscpio de luz, possvel entender
como ocorre a formao da imagem produzida por este aparelho. Os efeitos de refrao e
absoro da luz so fenmenos importantes a serem considerados na formao da imagem
ao microscpio. Esses fenmenos ocorrem em consequncia da interao da luz com o meio
que ela percorre. Logo, a interao da luz com o espcime avaliado gera absoro e refrao,
criando contrastes entre o objeto e o meio que o envolve, permitindo a distino das
diferentes estruturas no material analisado.
Antes que a imagem gerada pelo microscpio chegue a retina do observador, a luz
responsvel por sua formao passa por alguns componentes do aparelho: os feixes
luminosos que saem da fonte de luz atravessam as lentes do condensador, passam pela
preparao microscpica (o espcime), atingem as lentes objetivas e por fim atravessam as
lentes oculares chegando a retina onde so focalizados. Durante todo esse percurso a luz
passa por lentes e pelo ar, sofrendo desvios que geram os ndices de refrao e absoro
discutidos acima.
O princpio para a formao de imagens nos microscpios segue leis da Fsica que no
cabem serem discutidas com detalhes aqui. Vale ressaltar somente que as lentes dos
microscpios funcionam como sistemas convexos, ou seja, so lentes convergentes cuja
formao da imagem, como apresentado anteriormente, depende da posio do objeto em
relao ao plano focal (f) ou ao centro focal da lente. Neste sentido, a lente objetiva forma
uma imagem invertida e ampliada da preparao, enquanto a lente ocular funciona apenas
como uma lupa que amplia a imagem formada pela objetiva. Como resultado, a imagem final
captada na retina do observador virtual, ampliada e invertida em relao preparao.

Procedimento para a focalizao

1 Verifique se a objetiva de menor aumento (4x) est encaixada.


2 Pegue a lmina a ser observada, segurando-a apenas pelas bordas. Verifique se a
lamnula est voltada para cima.
3 Abra a presilha e coloque a lmina sobre a platina, encaixando-a perfeitamente.
Solte a presilha e verifique se a lmina est bem encaixada. Centralize o material no orifcio
da platina, utilizando os controles dos eixos X e Y, Charriot.
4 Verifique se o controle de intensidade da luz encontra-se no mnimo.
5 Certifique-se o condensador encontra-se em sua posio mais elevada.
6 Acenda a lmpada do microscpio e ajuste a intensidade de luz.
7 Ajuste a abertura do diafragma de acordo com a abertura numrica da objetiva
de menor aumento.
8 Levante a platina movimentando o controle macromtrico at o seu ponto
mximo.
9 Ajuste a distncia interpupilar movimentando com cuidado os tubos do cabeote,
abrindo ou fechando conforme a necessidade.

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10 Agora, observando atravs das oculares e utilizando o controle macromtrico,
abaixe lentamente a platina, at que o material a ser observado seja visto. Assim que isto
ocorrer, corrija a focalizao utilizando o controle micromtrico.
11 Caso seja necessrio ajuste as diferenas que podem ocorrer entre o olho
esquerdo e direito (dioptrias) por meio do anel de correo de dioptrias no tubo esquerdo.
12 Explore o material, movimentando os controles dos eixos X e Y com a mo
direita e o controle micromtrico com a mo esquerda. Coloque sempre o material a ser
analisado no centro do campo de observao, antes de passar para a objetiva de aumento
imediatamente superior.
13 Aps percorrer todo o campo, passe para a objetiva de aumento mdio e corrija
a focalizao utilizando somente o micromtrico. Observe o campo e passe para a objetiva
seguinte. A cada mudana de objetiva centralize, com o Charriot, o material que est sendo
observado. Lembre-se sempre que medida que o aumento da objetiva maior o dimetro
da lente diminuiu, assim, a objetiva seguinte focaliza o centro do campo anterior, perdendo o
campo mais perifrico. Se voc no observar tal fato, poder perder o objeto do foco, o que
lhe forar a voltar na objetiva de menor aumento.
14 Sempre ajustar a abertura do diafragma de acordo com a objetiva em uso.
15 Verifique se a focalizao melhora, se voc manipular os pontos de controle de
luz: potencimetro, diafragma e condensador.
16 A atividade ao microscpio estritamente dinmica. A postura correta, alm dos
dois olhos abertos, inclui o fato de uma das mos ficarem nos parafusos Charriot, e a outra,
no parafuso micromtrico.
17 Terminada a observao: (i) encaixe a objetiva de menor aumento; (ii) reduza
ao potencimetro mnimo; (iii) desligue a luz; (iv) retire a lmina; (v) limpe e cubra o
microscpio; (vi) deixe seu lugar no laboratrio limpo e organizado.

Cuidados com o Microscpio

1 No arraste o microscpio sobre a mesa e nem faa movimentos bruscos com o


equipamento. Muitas peas so de plstico e podem quebrar quando foradas, o caso da
alavanca de pr-focalizao e do controle de abertura e fechamento do diafragma.
2 Caso necessite de mudar o microscpio de lugar, chame o professor ou o monitor.
3 No use a fora ao movimentar os diferentes controles (macromtrico,
micromtrico, alavanca de pr-focalizao e do controle de abertura e fechamento do
diafragma, etc). Quando perceber que algum controle no se movimenta por algum motivo,
no force! Chame o professor ou o monitor.
4 Somente movimente o boto macromtrico na objetiva de menor aumento.
5 Sempre ligue ou desligue com o controle da intensidade luminosa na menor
posio.
6 No limpe as lentes oculares e objetivas com pano, papel higinico ou papel
toalha. Chame o professor ou o monitor toda vez que perceber que as lentes esto sujas.
7 No deixe cair nenhum lquido sobre a platina e no toque a objetiva com
nenhuma soluo.

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Atividade 1

Objetivos:
1. Treinar o uso do microscpio de luz.
2. Compreender as etapas necessrias para a focalizao do material de observao.

1 Com base na Figura abaixo, escreva o nome e a funo de cada componente do


microscpio de luz indicados pelos nmeros de 01 a 19.

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1_______________________________________________________________

2_______________________________________________________________

3_______________________________________________________________

4_______________________________________________________________

5_______________________________________________________________

6_______________________________________________________________

7_______________________________________________________________

8_______________________________________________________________

9_______________________________________________________________

10______________________________________________________________

11______________________________________________________________

12______________________________________________________________

13______________________________________________________________

14______________________________________________________________

15______________________________________________________________

16______________________________________________________________

17______________________________________________________________

18______________________________________________________________

19______________________________________________________________

2 Descreva todo o percurso da luz, desde a sua origem at a formao da imagem


no olho do observador.

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3 - Focalizao de letras no microscpio.
Procedimento: (i) recorte as letra H, A e E de um jornal, revista, bula ou texto
qualquer; (ii) coloque uma gota de gua sobre a lmina, com o auxlio de um conta-
gotas ou pipeta; (iii) coloque as letras na posio de leitura sobre a gota; (iv) coloque a
lamnula em posio de 45o, com relao a lmina, para evitar a formao de bolhas; (v)
caso haja excesso de lquido, retire com papel absorvente, para manter a lamnula fixa;
(vi) seguir as etapas de focalizao do material.
a) Faa esquemas da posio e do tamanho das letras observadas olho nu e ao
microscpio.
Olho nu Microscpio

Olho nu Microscpio

Olho nu Microscpio

b) Quais so as diferenas entre as imagens observadas da letra com a vista


desarmada e ao microscpio?
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c) Quais so as caractersticas da imagem formada pela lente objetiva em relao


ao objeto?
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________________________________________________________________

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d) Quais so as caractersticas da imagem formada pela lente ocular em relao
imagem formada pela lente objetiva?
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e) Por que recomendado centralizar o material no campo de observao antes


de cada mudana de objetiva?
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2 ptica do Microscpio e
Qualidade da Observao
Princpios do funcionamento do microscpio

Aumento e poder de resoluo

Geralmente, relaciona-se a qualidade do microscpio sua capacidade de ampliao


da imagem de um objeto. Entretanto, a qualidade dos microscpios est associada ao seu
poder de resoluo. O poder de resoluo indica a capacidade do microscpio de fornecer
imagens ntidas, com detalhes estruturais. O aumento refere-se ao tamanho aparente da
imagem em relao ao objeto e a resoluo, riqueza de detalhes da imagem obtida.
O aumento dado pela objetiva e ocular obtido pelo produto dos aumentos conferido
por cada uma dessas lentes. Por exemplo, uma combinao de uma objetiva que proporciona
aumento de 20x com uma ocular de 10x, fornecer um aumento total de 200x.
O poder de resoluo pode ser inferido de uma maneira indireta. Para que isso seja
feito, necessrio que se conceitue limite de resoluo. Limite de resoluo a menor
distncia que deve existir entre dois pontos, de modo que ainda apaream individualizados na
imagem formada pelo sistema de lentes. Logo, se esses pontos estiverem separados por uma
distncia menor do que o limite de resoluo, estes sero vistos como um nico ponto,
independente da imagem. Portanto, quanto menor o limite de resoluo, maior o poder de
resoluo e melhor a qualidade da imagem.
O limite de resoluo do olho humano normal aproximadamente 0,1 mm; do
microscpio de luz, ao redor de 0,25 m e do microscpio eletrnico, de 3 a 5 . O limite de
resoluo (LR) calculado pela seguinte frmula:

LR = (k.)/(AN)

em que:
K = constante experimental estimada em 0,61;
= comprimento de onda da energia utilizada (luz branca = 550 nm ou feixe de eltrons);
AN = abertura numrica da lente objetiva. Esse valor calculado por meio da frmula:

AN = n sen

em que:
n = ndice de refrao do material intercalado entre a lamnula e a lente objetiva (ar, leo de
imerso, glicerina, gua, etc, dependendo do tipo de objetiva utilizada).
sen = metade do ngulo de abertura da lente objetiva (ngulo formado entre o feixe ptico
da lente objetiva e o raio de luz mais externo utilizado na formao da imagem).

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Por meio dessa frmula, verifica-se que o limite de resoluo diretamente
proporcional ao comprimento de onda da fonte de iluminao utilizada e inversamente
proporcional a abertura numrica. A diminuio do comprimento de onda () pode ser feita
utilizando-se outras fontes de iluminao como a luz ultravioleta (400 nm) ou utilizando-se
um feixe de eltrons cujo = 0,005 nm (microscpio eletrnico). A mdia dos comprimentos
de onda da luz branca de aproximadamente 550 nm ou 5,55 m o qual representa a
mdia dos comprimentos de onda do espectro da luz visvel. O quadro 2.1 mostra os
comprimentos de onda que compe a luz branca.
Com relao luz, quanto menor o comprimento de onda, menor o limite de
resoluo. De fato, detalhes estruturais menores que cerca de metade do comprimento de
onda utilizado no podem ser observados. Assim, analisando a tabela abaixo, podemos
depreender que, considerando apenas a influncia da luz, o limite de resoluo de um
microscpio ptico pode variar entre 200 nm e 400 nm.

Quadro 2.1 Espectro de decomposio da luz branca.

Cor (nm)
Violeta 400 424
Azul 424 491,2
Verde 491,2 575
Amarelo 575 585
Laranja 585 647
Vermelho 647 700

A diminuio do acompanhada por uma diminuio proporcional no limite de


resoluo e um conseqente aumento no poder de resoluo. Pode-se obter, tambm, um

12
menor limite de resoluo, aumentando a abertura numrica. Isso pode ser feito por duas
maneiras: utilizando-se objetivas com diferentes aberturas angulares, isto , diferentes valores
de ; ou variando-se o meio (ndice de refrao) que separa a objetiva da lmina, utilizando-
se, por exemplo, leo de imerso.
Quando o meio que separa a lmina da objetiva o ar, normalmente ocorrem desvios
do feixe luminoso em conseqncia da diferena de ndice de refrao (n) entre os dois meios
(vidro = 1,52 e ar = 1,00). Como resultado, uma menor quantidade de luz participa da
formao da imagem. O uso do leo de imerso (n = 1,52) contorna o problema
mencionado, uma vez que a semelhana entre os ndices de refrao do leo e do vidro
minimiza o desvio do feixe luminoso permitindo um maior aproveitamento da luz, o que
fornece, conseqentemente, uma imagem com maior riqueza de detalhes (Figura 2.1).

Figura 2.1 Princpio de funcionamento da objetiva de imerso.

O leo de imerso usado apenas com a lente objetiva de 100x, tambm chamada
de objetiva de imerso e caracterizada por um anel preto. Aps o uso, o leo removido com
papel absorvente ou cotonete, embebidos em ter etlico.
Para cada objetiva do microscpio podemos calcular o limite de resoluo, para que
possamos escolher a objetiva adequada para cada estudo. Para exemplificar, calcularemos o
LR de uma objetiva de 40x, cuja abertura numrica 0,65:
LR = (0,61 x 0,55 m)/0,65
LR = 0,51 m

De acordo com os dados acima, somente pontos separados a uma distncia igual ou
superior a 0,51 m podero ser observados com nitidez atravs dessa objetiva.
Para a mesma objetiva exemplificada anteriormente, teremos, com a utilizao da luz
ultravioleta, um limite de resoluo igual a:
LR = (0,61 x 0,20 m)/ 0,65
LR = 0,19 m

Como pode ser notado, com o emprego da luz ultravioleta poderemos distinguir
pontos muito prximos.

13
Abaixo esto apresentados alguns exemplos de limite de resoluo de sistemas
pticos importantes para estudos citolgicos:
LR do olho humano normal = 0,1 a 0,2 mm.
LR do microscpio ptico = 0,25 m.
LR do microscpio eletrnico = 2 a 5 .

Se associarmos estes valores aos nveis de organizao dos seres vivos, fica
evidenciada a importncia do uso microscpio para o estudo das clulas e suas estruturas.

Relao entre aumento total e limite de resoluo

Alm de escolher a objetiva adequada, no demais insistir na correta combinao


entre oculares e objetivas, principalmente porque muitos novatos costumam querer obter
amplificaes muito grandes, p. ex., de 2.500 vezes, empregando uma objetiva de 100 vezes
e uma ocular de 25 vezes de aumento prprio. Entretanto, o poder de resoluo, que oferece
nitidez aos pormenores mnimos da imagem, de maneira alguma aumentado por uma
ocular muito forte. Pelo contrrio, as oculares de grande aumento roubam muita luz; os
poderes resolutivos, definidores, que do nitidez aos contornos, e penetradores, com imagens
sempre claras em planos diversos, ficam grandemente prejudicados.
A ampliao total nunca deveria ultrapassar a escala de 1.000 vezes a abertura
numrica da objetiva que usa no momento. Por exemplo, com uma objetiva de 100x, de
imerso, com abertura numrica de 1,3x pode combinar-se no mximo uma ocular com
aumento prprio de 13x, no mais. Toda ocular mais forte acarretaria o assim chamado
aumento vazio, admissvel apenas quando se devem medir corpsculos mnimos. Tambm a
ampliao mnima tem seus limites: no deveria estar abaixo de 500 vezes a abertura
numrica da objetiva, para aproveitar-se plenamente o poder resolutivo do instrumento.

Profundidade de campo

Freqentemente, os aparelhos que so dotados de lentes (cmara de televiso,


maquina fotogrfica, microscpios, etc) no conseguem focar o campo todo, apresentando,
com isto, uma parte embaraada. Essa desuniformidade na focalizao se deve resoluo
em profundidade, ou seja, no eixo z que corta o plano da lmina. Uma das propriedades das
lentes pticas a profundidade de campo. Quando uma lente ajustada de tal forma
amostrar um certo plano, com mxima nitidez, o olho pode observar partculas que, embora
estando acima ou pouco abaixo do plano focal, podem ser vistas nitidamente. distncia
compreendida entre as regies imediatamente acima e abaixo do plano focal que
permanecem, simultaneamente, em foco chama-se profundidade de campo. Em microscopia
de luz, um dos fatores mais importantes na determinao da profundidade de campo a
abertura numrica (dependente do ngulo ). Quanto maior a abertura numrica, menor a
profundidade de campo. Considerando que as objetivas de maior aumento apresentam
maiores aberturas numricas, existe uma relao inversa entre o aumento e a profundidade
de campo, ou seja, quanto maior o aumento, menor a profundidade de campo. Isso pode ser

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observado quando se movimenta o micromtrico com a objetiva de 40x encaixada. Devido
pequena profundidade de campo dessa objetiva, um reduzido nmero de planos de um
objeto ser focalizado simultaneamente. Pequenos movimentos do micromtrico permitem a
focalizao de outros planos no observados anteriormente.
Na prtica, pode-se obter uma maior profundidade de campo utilizando-se objetivas
com menores aberturas numricas, ou diminuindo-se a abertura do diafragma, o que em
princpio envolve a reduo do ngulo do cone de luz que atravessa o sistema.

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Atividade 2

Objetivos:
1. Compreender os princpios de funcionamento do microscpio de luz: aumento,
poder de resoluo e profundidade de campo.
2. Relacionar a variao do limite de resoluo com as diferentes objetivas.
3. Relacionar a variao da profundidade de campo com o uso das diferentes lentes
objetivas.

1 Considere as duas combinaes de lentes:


A: lente objetiva de 40x, AN = 0,75 e ocular de 8x.
B: lente objetiva de 16x, AN = 0,35 e ocular de 20x.
Considere que o K = 0,61 e = 0,55 m e responda as seguintes questes:

a) Por que o comprimento de onda estimado em 0,55 m?


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b) Como calculado o aumento final da imagem observada?


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c) Qual das combinaes de lentes fornece o maior aumento?


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d) Qual das combinaes de lentes fornece uma imagem com mais detalhes?
Justifique.
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e) O que ocorreria com o detalhamento da imagem se o aumento da ocular da


primeira combinao de lentes fosse de 40x? Justifique.
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2 Observao de estrias de escamas de borboleta.

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Procedimento: (i) passe o pincel seco sobre um pedao de asa de borboleta e transfira as
esacamas que se soltarem para a lmina; (ii) coloque uma gota de gua com detergente sobre o
material e cubra-o com lamnula; (iii) observe o material ao microscpio e tente visualizar as
estrias longitudinais e transversais; (iv) aps a observao complete os itens abaixo:

a) calcule o limite de resoluo para as lentes objetivas de 4, 10,40 e 100x.


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b) Desenhe as escamas conforme so vistas em cada aumento

40x 100x

400x 1000x

c) As estrias transversais so observadas a partir da utilizao de qual lente


obejtiva?
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d) Baseando-se no clculo da questo a, estime o intervalo para a distncia entre


as estrias transversais das escamas.
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3 Demonstrao da profundidade de campo utilizando gros de plen de Hibiscus sp.
Procedimento: (i) passe o pincel no pistilo (parte amarela) da flor de hibisco que se encontra
na bancada; (ii) com um conta-gotas, coloque uma gota de soluo salina sobre uma lmina,
passe o pincel com os gros-de-plen na gota, cobrindo-a com uma lamnula; (iii) observe este
material ao microscpio, centralize um gro de plen da cor amarelo brilhante e proceda a
observao utilizando as diferentes lentes objetivas; (iv) aps a observao, responda as
questes.

a) Ao utilizar a lente objetiva de 40x, movimente lentamente o micromtrico e


observe as espculas do gro de plen. Qual foi o resultado desse movimento?
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b) Retorne a objetiva de 10x e movimente ligeiramente o micromtrico, como na
situao anterior. Qual o resultado desse movimento?
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c) Compare os resultados das questes a e b e justifique a diferena entre eles.


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d) Retorne lente objetiva de 40x, fechando gradativamente o diafragma. Escolha


a abertura que lhe fornea a imagem com mais contraste e responda: houve
alterao na profundidade de campo? Por qu?
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________________________________________________________________
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3 Preparao de lminas e
Cortes histolgicos
Preparao de material biolgico para observao no
microscpio de luz

A observao de materiais biolgicos em microscopia implica em uma srie de


procedimentos tcnicos prvios que so designados tcnicas histolgicas. Essas tcnicas visam
preparao dos tecidos destinados ao estudo em microscopia de luz ou eletrnica. Aqui, ns
focaremos as tcnicas destinadas ao estudo em microscopia de luz.
O exame ao microscpio feito pela passagem da luz pelo objeto que est sendo
analisado, o que significa que a luz deve atravessar esse objeto. Assim, a obteno de
fragmentos delgados de tecidos imprescindvel para uma boa preparao citolgica. Os
fragmentos devem ser bem finos e colocados em lminas tambm finas e transparentes.
Diferentes tcnicas so utilizadas em preparaes histolgicas, com objetivos
especficos. Algumas tcnicas so utilizadas freqentemente em rotinas de laboratrios, pois
proporcionam a visualizao da estrutura dos tecidos assim como os tipos celulares que os
compem.

Obteno do material biolgico

O processo de preparo de uma lmina consiste no isolamento do rgo ou um


fragmento do mesmo que se pretende estudar, podendo ser tanto de origem animal ou
vegetal. Esse material pode ser observado em preparaes frescas ou fixado.

A) Fixao

Esta etapa consiste na utilizao de procedimentos fsicos ou qumicos para imobilizar


as substncias constituintes das clulas e dos tecidos, fornecendo maior resistncia para
suportar as demais etapas. A fixao visa tambm evitar o processo de autlise ou
degradao bacteriana, o que poderia alterar drasticamente a estrutura celular.
A fixao que interfere o mnimo possvel na estrutura celular, bem como na estrutura
e localizao das diferentes macromolculas presentes nas clulas a ideal. Esta etapa
importante para a microscopia de luz e microscopia eletrnica.
Agentes fsicos como calor e microondas podem ser utilizados na fixao,
principalmente de bactrias. Entretanto, os agentes fixadores qumicos so os mais utilizados,
pois reagem com determinados stios especficos de diferentes biomacromolculas
promovendo a sua estabilidade. Existem muitos compostos qumicos que podem ser utilizados
como substncias fixadoras. Dentre eles: a acetona (fixador de espalhamentos e esfregaos);
alcois etlicos, metlicos e terc-butlico (bons para estudos de cidos nuclicos e

19
polissacardeos); aldedos (formaldedo, paraformaldedo e glutaraldedo), que so excelentes
fixadores de protenas; cido pcrico, cido crmico e bicloreto de mercrio (fixadores de
protenas).

B) Desidratao

Aps a fixao, o material deve ser lavado em gua corrente para remoo do
excesso de fixador. Em seguida, realiza-se a desidratao utilizando-se uma soluo
apropriada, como etanol ou acetona, em banhos sucessivos de concentraes crescentes. A
retirada de gua necessria para que o material utilizado na etapa de incluso penetre nas
estruturas do corte, possibilitando maior consistncia ao mesmo.

C) Diafanizao ou clarificao

Etapa utilizada para promover a retirada do lcool e permitir que a parafina penetre
nos tecido. Alm disso, remove gorduras dos tecidos, deixando-os translcidos. So utilizadas
substncias como o Xilol, benzeno ou tolueno, vrias vezes.

D) Incluso

Este procedimento consiste na impregnao do tecido com uma substncia de


consistncia firme que permita, posteriormente, seccion-lo em camadas delgadas em um
aparelho chamado micrtomo. A parafina e a resina sinttica so as mais utilizadas.

E) Microtomia

Esta etapa consiste, basicamente, em utilizar um micrtomo para obter cortes


sucessivos, delgados e uniformes, a partir dos tecidos inclusos em blocos de parafina ou
resina. A espessura e a uniformidade dos cortes dependem da firmeza com que a navalha
passa pelo material. Para tanto, aconselha-se o uso de micrtomos automticos. O avano da
navalha regulvel e pode fornecer corte com espessuras de 0,5 a 12m.
Aps a microtomia, os cortes so distendidos em gua temperatura
ambiente e coletados em lminas histolgicas. Estes cortes devem ser secos em estufas a
45C ou em chapa aquecida.

F) Colorao

A colorao consiste numa etapa muito importante para a visualizao das estruturas
do tecido. Normalmente so utilizados corantes hidrossolveis, sendo necessria a remoo
da parafina ou resina da pea que foi preparada nas etapas descritas anteriormente e que
permanece na lmina de vidro.
Existem muitos tipos de corantes, mas de um modo geral eles diferenciam os
componentes cidos e bsicos das clulas e os componentes fibrosos da matriz extracelular.

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G) Montagem

Aps a colorao do material na lmina, torna-se necessrio conservar esse material


corado. Recomenda-se cobrir o corte com lamnula, utilizando uma resina de montagem (ex:
entellan). A lamnula pode ser vedada com auxlio de esmalte incolor.

Outras formas de se obter camadas nicas de clulas

Esmagamento: Consiste em esmagar, entre lmina e lamnula, o material a ser


analisado. Pode-se corar o material juntamente com o processo de esmagamento ou retirar a
lamnula com auxlio de nitrognio lquido, e fazer a colorao logo aps.
Decalque: consiste em comprimir suave e firmemente a superfcie de um fragmento
do material freso sobre uma lmina. As clulas superficiais se destacam e aderem lmina,
sendo em seguida fixadas e coradas. Esses preparados so teis para a obteno de ncleos
livres de citoplasma.
Esfregao: clulas livres presente em lquidos corpreos, como sangue, linfa, smem,
lquor, podem ser dispostas sobre lmina em fina camada de maneira que possam ser
observadas em microscpio de luz. Coloca-se uma gota do liquido sobre a extremidade de
uma lmina e espalha-se o material uniformemente sobre a mesma com a o auxlio de outra
lmina inclinada em um ngulo de cerca de 45 graus.

Tipos de cortes histolgicos

Os cortes podem ser de 4 tipos: transversal (quando feito paralelamente ao menor


comprimento do material); longitudinal (quando feito paralelamente ao maior comprimento
do material; paradrmico (para obteno de epidermes) e oblquo.
Para observao in vivo, principalmente de material vegetal, os cortes so feitos mo
livre, os quais podem ser realizados de 2 maneiras:
1. Sem meio de incluso: Utiliza-se de uma lmina cortante para a obteno de
cortes finos do material.
2. Com meio de incluso: Muitas vezes a textura do material a ser cortado no
permite a obteno de cortes delgados sem o uso de meios de incluso, os quais envolvem o
material auxiliando desse modo a obteno de cortes finos.
Como exemplo de meios de incluso para cortes mo livre tem a medula de
imbaba, isopor, cortia, medula de girassol, etc.

Interpretao dos cortes

Deve-se ter em mente que a figura que se v representa apenas uma seco do
objeto. Essa figura bidimensional, e as clulas tm trs dimenses. Por esse motivo, deve-se
fazer uma srie de cortes sequenciais e a partir deles, faz-se a reconstruo mental, por
superposio, da forma em 3 dimenses.

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Figura 3.1 Interpretao de cortes.

22
Atividade 3

Objetivos:
1. Mostrar como se faz coleta e fixao de material
2.Treinar a obteno de cortes delgados mo livre.
3.Distinguir os trs tipos de cortes.
4.Observar clulas vegetais e diferenci-las das clulas animais.

1 Coleta e fixao de material (raiz de cebola)


Procedimento: 1) Retirar as razes velhas da parte inferior do bulbo de uma cebola com uma
lmina de barbear. 2) Colocar os bulbos previamente (trs dias antes) sobre um recipiente
com gua, de maneira que apenas a parte inferior do bulbo toque a gua. Esperar emitirem
razes. 3) Preparar fixador Carnoy, composto de metanol e cido actico, nas propores de 3
partes de metanol para 1 parte de cido actico. 4) Quando as razes tiverem entre 0,5 cm e
1cm, seccionar a extremidade com o auxlio de uma lmina de barbear ou de pina de ponta
fina. 5) Imediatamente aps a retirada as razes devem ser mergulhadas no fixador Carnoy. 6)
Aps coletadas e fixadas, as razes podero ser armazenadas em freezer a -20C. Essas razes
podero ser guardadas e utilizadas em outras aulas prticas.

2 Cortes mo livre (folhas de Sansevieria sp.)


Procedimento:
- Corte paradrmico (camada fina, transparente, paralelo a superfcie do rgo) de folhas de
Sansevieria sp.
Com o auxlio de uma lmina de barbear, prepare cortes paradrmicos da folha da espada de
So Jorge. Verifique se a espessura dos cortes est adequada e coloque-os na placa de Petri
com gua. Os cortes devem ser pequenos e transparentes.
- Corte transversal (perpendicular ao eixo principal do rgo) de folhas de Sansevieria sp.
Com o auxlio da lmina de barbear, prepare um corte transversal da folha de espada de So
Jorge. Coloque o melhor corte ao lado do corte paradrmico.
- Corte longitudinal (paralelo ao eixo principal do rgo) de folha de Sansevieria sp.
Com o auxlio da lmina de barbear, prepare um corte longitudinal da folha de espada de So
Jorge, procedendo da mesma maneira que no item anterior.

Faa um esquema de cada um dos cortes, utilizando a segunda objetiva a seco:

1) Paradrmico 2) Transversal 3) Longitudinal

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Esquematize agora um grupo de clulas epidrmicas nos cortes paramtrico, transversal e
longitudinal, utilizando as objetivas 10 e 40 x.

1) Paradrmico 2) Transversal 3) Longitudinal

3 Qual a importncia da fixao para as preparaes citolgicas?

4 As clulas epidrmicas tm a mesma forma nos 3 tipos de cortes? Por qu?

5 Baseado em seus esquemas, indique como voc poderia distinguir os cortes paradrmicos,
transversal e longitudinal, em uma observao microscpica.

24
4 Mtodos Citoqumicos e
Organizao Molecular
Importncia da colorao e identificao dos
componentes qumicos da clula

As diferentes estruturas celulares interagem praticamente da mesma forma com a


luz, sendo que a velocidade com que a luz atravessa os diferentes compartimentos celulares
muito prxima. Isto conseqncia da constituio qumica e da densidade dos diferentes
componentes celulares, ou seja, dos seus ndices de refrao. As pequenas diferenas nos
ndices de refrao no so suficientes para dar contraste s diversas estruturas celulares.
Logo, o que podemos aprender sobre as clulas depende dos instrumentos que dispomos e
dos enormes avanos na biologia celular surgidos, devido introduo de novas tcnicas.
Entre essas, incluem-se as diversas tcnicas de citoqumica, histoqumica, imunocitoqumica,
auto-radiografia, hibridao in situ, entre outras, que permitem a localizao ao microscpio
de luz ou eletrnico, de componentes qumicos especficos que compe as clulas e tecidos.
Essas tcnicas baseiam-se em reaes qumicas desenvolvidas entre a substncia pesquisada
e o reagente utilizado, que resulta numa resposta colorida.
O uso de corantes o mtodo mais comumente utilizado no preparo de lminas para
estudos de Biologia Celular. As substncias denominadas corantes so aquelas que
apresentam capacidade de ligao diferencial a componentes qumicos especficos da clula,
permitindo sua identificao e localizao. Para ser utilizada como corante, uma substncia
deve possuir cor e capacidade de ligao a grupos qumicos especficos das clulas ou de seus
produtos.
A cor apresentada pela molcula de um corante atribuda presena de grupos
cromofricos (ou cromforos). Estes grupos apresentam uma regio da molcula capaz de
absorver os raios luminosos de determinados comprimentos de onda e refletir as radiaes
complementares no absorvidas. Corantes vermelhos, por exemplo, apresentam intensa
absoro de luz de comprimentos de onda correspondentes a outras corres, em especial o
verde, deixando passar aqueles referentes ao vermelho.
Nesta aula veremos os princpios dos mtodos citoqumicos e como eles podem ser
usados para detectar os diferentes componentes qumicos das clulas.

Citoqumica

A citoqumica uma rea da biologia celular e estrutural dedicada aos estudos dos
mtodos de colorao dos tecidos e dos constituintes celulares ou subcelulares, preocupando-
se no somente com os princpios qumicos das reaes de colorao, mas tambm com os
procedimentos protocolares para obteno de preparados a serem avaliados ao microscpio.
Muitos so os elementos que podem ser estudados citoquimicamente, tanto para a pesquisa
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cientfica como para fins de diagnstico patolgico. Dentre eles, podemos citar, os cidos
nuclicos, os polissacardeos, os lipdios, as protenas, alguns ons e enzimas.
Para que essa tcnica tenha sucesso so necessrios que sejam cumpridos alguns
princpios bsicos: a) o produto a ser pesquisado deve ser insolvel, o que evita a sua difuso
para outras regies das clulas e dos tecidos; b) indispensvel que o produto da reao
apresente cor ou, pelo menos, apresente-se na forma de um precipitado insolvel no local da
reao; c) a reao colorida desenvolvida deve ser especfica, isto , s deve ocorrer com o
composto pesquisado; d) a reao tambm deve ser sensvel para detectar quantidades muito
pequenas do produto colorido formado.
As reaes citoqumicas podem ser divididas em 3 tipos diferentes, dependendo da
natureza da reao qumica envolvida: (a) por ligaes eletrostticas; (b) por ligaes
covalentes; (c) por interaes hidrofbicas.

A) Ligaes Eletrostticas

Neste caso, um corante ionizado em uma soluo reage com um substrato de carga
inica oposta. Assim, podemos enumerar dois fenmenos citoqumicos: acidofilia e basofilia.
Entende-se por acidofilia como o fenmeno citoqumico no qual um substrato carregado
positivamente, chamado de substrato catinico, reage eletrostaticamente com um corante
carregado negativamente, dito aninico. Por ligao inica, esses dois elementos reagem e
formam um composto colorido, evidenciado ao microscpio de luz. Como exemplos de
corantes aninicos tm-se o xylidine ponceau, o Sirius Red, o Fast Green e a eosina.
J no fenmeno da basofilia, o substrato carregado negativamente chamado de
substrato aninico, reage eletrostaticamente com um corante carregado positivamente, dito
catinico. Como exemplo de corantes catinicos pode-se citar os corantes Azul de Toluidina,
Azul de metileno e o Azul de Alcien. A hematoxilina, embora no seja um corante, pode ser
considerada um complexo de corantes que comportam-se como corante catinico. Esses
corantes reagem com os elementos ionizveis nos tecidos que apresentam cargas negativas,
os grupamentos aninicos.
Uma das tcnicas de colorao, muito utilizada na citologia e na histologia animal, a
colorao pela hematoxilina e eosina (HE). A hematoxilina, por ser um corante bsico, cora o
ncleo (cor azul), devido aos cidos nuclicos presentes. A eosina por ser um corante cido
cora o citoplasma (cor rosa) dada a predominncia de protenas bsicas nesta regio celular.
Este tipo de colorao, envolvendo a afinidade cido-base, embora facilite o estudo da
morfologia celular, no possibilita maiores informaes a respeito da composio qumica das
estruturas coradas.

B) Ligaes Covalentes

Nessas tcnicas, a interao entre os corantes e as substncias pesquisadas feita


por ligaes covalentes. Embora, no se tenha ainda descrito o princpio exato dessas reaes,
essas tcnicas so muito difundidas e utilizadas na histopatologia e na pesquisa cientfica na
rea de biologia celular e tecidual. Os exemplos mais clssicos das reaes citoqumicas

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mediadas por ligaes covalentes so a reao de Feulgen, para DNA e o teste do cido
Peridico Schiff (PAS), para polissacardeos neutros. Ambas as reaes so obtidas a partir de
um mesmo reagente chamado de Reativo de Schiff, que consiste num leucoderivado do
corante Fucsina Bsica.
A reao de Feulgen utiliza como pr-tratamento do material uma hidrlise cida com
cido clordrico (HCl). Essa hidrlise remove da molcula de DNA as bases pricas, adenina e
guanina, processo chamado de depurinao do DNA, que consequentemente abre o anel
liberando grupos aldedos. No tratamento com o reativo de Schiff ocorre a reao radicais
aldedos-reativo de Schiff promovendo uma colorao rsea ou magenta ou bonina.
O teste de PAS muito utilizado para avaliaes citoqumica de polissacardeos
neutros, como o glicognio, o amido e a celulose. Ele utiliza como pr-tratamento do material
o cido peridico (HIO4). Esse cido oxida os grupos hidroxila livres em dois tomos de
carbono adjacentes (grupos gliclicos, chamados de vic-glicol ou amino glicol, dependendo do
tipo de carboidrato), produzindo radicais aldedos, ou seja, h quebra da ligao entre os
carbonos e converso aldedo. Os radicais aldedos reagem com o reativo de Schiff
promovendo uma colorao rsea ou magenta ou bonina.
Na tcnica de PAS, como vrios carboidratos respondem positivamente reao de
PAS, pode utilizar reaes complementares para se fazer a distino entre eles. A distino
entre glicoprotenas neutras e glicoprotenas cidas e de outros glicoconjugados, por exemplo,
feita associando-se tcnica PAS com a tcnica de Alcien Blue (azul de Alcien). A
positividade ao Alcien Blue indicada pelo aparecimento de componente corado de cor azul
celeste. O Alcien Blue, quando preparado em diferentes pHs, marca componentes celulares
ditintos: no pH 0,5 evidencia glicoconjugados cidos sulfatados e no pH 2,5 glicoconjugados
cidos sulfatados, glicoconjugados cidos carboxilados e glicoprotenas cidas.
Vale ressaltar que a tcnica de Feulgen semelhante do PAS, ou seja, ambas
utilizam o reativo de Schiff, aps exposio dos radicais adedos. A diferena que na tcnica
do PAS usa-se o cido peridico enquanto na de Feulgen usa-se o cido clordrico para
quebrar as molculas pesquisadas.

C) Interaes Hidrofbicas

Essas reaes so especficas para lipdios no polares, como, por exemplo, os


triglicerdeos e derivados de colesterol. Essas coloraes partem do princpio que os lipdios
no polares so altamente hidrofbicos, portanto esses corantes interagem com os lipdios
hidrofobicamente. Dentre os corantes especficos para os lipdios, podemos citar o Sudan
Black, o Sudan III, e o Azul de Nilo. Os mtodos para evidenciar lipdios requerem fixao em
formol ou cortes por congelamento. Apenas os fosfolipdios podem ser evidenciados em cortes
de parafina, pois resistem ao tratamento com lcool, xilol e a prpria incluso em parafina.

27
Atividade 4

Objetivos:
1. Conhecer os diferentes tipos de corantes.
2. Observar o material biolgico antes e aps a colorao.
3. Relacionar a constituio qumica da clula e a utilizao de corantes cidos e
bsicos.
4. Justificar a importncia dos corantes na microscopia de luz.

1 Importncia da colorao na microscopia de luz: preparo de lminas de clulas da


mucosa bucal.
Procedimento 1: Coloque uma gota de soluo salina sobre uma lmina. Com um palito de
fsforo faa uma leve raspagem na mucosa bucal. Transfira o material para a gota de soluo
salina. Cubra o material com a lamnula e observe ao microscpio, utilizando as lentes
objetivas de 4X, 10X e 40X. Aps a observao com a lente objetiva de 40X, volte lente
objetiva de 4X e retire a lmina do microscpio.
Procedimento 2: Coloque uma gota do corante azul de metileno em uma das bordas da
lamnula da lmina preparada no procedimento 1. Encoste um pedao de papel de filtro no
lado oposto ao da gota de corante. O papel absorver a soluo salina, permitindo que o
corante passe por capilaridade para o espao entre a lmina e a lamnula. Aguarde alguns
minutos e observe o material ao microscpio as lentes objetivas de 4X, 10X e 40X.
Represente o material observado no aumento de 400x.

a) Nesta lmina podemos observar alguns detalhes das clulas da mucosa. Por que
nem todas as estruturas citolgicas puderam ser vistas?
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b) Houve dificuldade na observao das clulas antes da colorao? Justifique.
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c) Qual foi o efeito do corante sobre as clulas?


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d) O que se entende por substncia corante?

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2 Sobre a sua bancada encontram-se razes de cebola coradas com reativo de Schiff
(Reao de Feulgen). O que evidenciado pelo reativo de Schiff nas clulas dessas
razes? Qual o princpio dessa reao? Compare a reao de Feulgen com o teste de
PAS.
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3 Focalize uma lmina de fgado corada pelo mtodo hematoxilina-eosina (HE),


esquematize um hepatcito observado com a lente objetiva de 40X indicando o
ncleo, o citoplasma e o nuclolo e responda s questes abaixo.

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a) Qual a cor predominante no citoplasma das clulas coradas e qual o corante
responsvel?

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b) Cite alguns exemplos de corantes cidos e corantes bsicos.


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c) O que caracteriza quimicamente os corantes cidos e bsicos?


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d) O que so estruturas acidfilas e basfilas?


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e) A que se deve a basofilia apresentada pelo ncleo e a acidofilia apresentada pelo


citoplasma?
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________________________________________________________________

f) Quais so as limitaes apresentadas pelas tcnicas de colorao que envolvem


interaes eletrostticas?
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5 Clulas Procariotas e
Eucariotas
Diferenciao das clulas procariotas e eucariotas sob o
microscpio de luz

A clula a unidade estrutural e funcional de todo ser vivo. Sabemos que o universo
biolgico constitudo por diferentes grupos de organismos que so classificados e ordenados
em gneros, famlia, ordem e reinos. Encontramos, portanto, uma diversidade de tipos
celulares nesses organismos. A Biologia Celular atua identificando tipos celulares e seus
componentes, compreendendo a organizao estrutural desses elementos e de suas
respectivas funes. Apesar dessa diversidade, apenas duas categorias celulares podem ser
reconhecidas: clulas procariotas e clulas eucariotas. Estas classes de clulas so
diferenciadas por seu tamanho e pelos tipos de estrutura interna e organelas que as
compem.
As clulas procariotas so estruturalmente mais simples e so representadas por
todos os tipos de bactrias e algas azuis que constituem o Reino Monera. Todos os outros
tipos de organismos protistas, fungos, plantas e animais so constitudos por clulas
eucariotas, mais complexas.
Ao microscpio ptico, o que mais chama a ateno a grande diferena de tamanho
entre as clulas eucariticas e procariticas tpicas. Por vezes pode-se observar clulas
procariticas, como as cianofceas, cujo tamanho est prximo ou mesmo maior que
algumas clulas eucariticas. Entretanto, a regra que os procariontes geralmente tm
clulas muito menores que os eucariontes.
Outra diferena bem marcante a presena do ncleo nos eucariontes e sua
ausncia nos procariontes. Internamente, no s a presena do ncleo difere os dois tipos de
clulas, mas tambm a intensa compartimentalizao das diversas funes celulares em
organelas envoltas por membranas o sistema de endomembranas caracterstico das
clulas eucariontes. O sistema de endomembranas de difcil visualizao ao microscpio
ptico, sendo observado somente ao microscpio eletrnico. Logo, utilizando microscpios
comuns, a caracterstica mais notvel para diferenciar os dois tipos de organizao celular a
observao de presena/ausncia de ncleo.
Nesta aula iremos ver as caractersticas gerais dos dois tipos celulares, observando as
semelhanas e divergncias referentes sua organizao. Posteriormente iremos observar
clulas eucariotas e procariotas no microscpio de luz a fim de diferenci-las.

Organizao Celular em Procariotos

As clulas procariotas so assim denominadas, pois no possuem um ncleo envolto


por membrana (carioteca). A palavra procarioto constituda do prefixo pro que significa

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antes e do sufixo karyon que significa parte central ou ncleo, portanto tem o significado
de anterior ao ncleo. Sem o envoltrio nuclear, o material gentico dessas clulas ocupa
um espao denominado nucleide e est em contato direto com o citoplasma ao seu redor. O
DNA das clulas procariotas pode atingir comprimento entre 0,25mm a 3mm sendo
suficiente para codificar centenas e milhares de protenas necessrias para seu
desenvolvimento. Alm disso, o DNA organizado como um simples cromossomo circular,
constituindo um DNA nu, sem associao com protenas.
A organizao do citoplasma das clulas procariotas bastante simples: ele
desprovido de estruturas membranosas, as organelas. No citoplasma esto presentes apenas
os ribossomos, estruturas supramoleculares constitudos de protenas e RNA, que constituem
as bancadas para a sntese protica, e o nucleide.
As clulas procariotas so envoltas por membranas biolgicas, tridimensionais e por
paredes celulares rgidas, as quais protegem a delicada forma de vida presente em seu
interior. Em relao diviso celular, os procariotos tm um mecanismo simples: o DNA do
nucleide duplicado pela maquinaria protica, as duas cpias so separadas unicamente e
de forma precisa atravs do crescimento de uma membrana celular divisria.
Os procariotos so seres assexuados, possuem uma nica cpia de seu nico
cromossomo e no produzem gametas. Logo, eles no tm fertilizao verdadeira. No
entanto, alguns so capazes de trocar fragmentos de DNA entre cromossomos de clulas
diferentes, processo este denominado conjugao.
No que diz respeito motilidade, os procariotos possuem flagelos, um filamento
proticos fino que se projeta para fora da clula sendo capaz de girar. A rotao do flagelo
exerce presso no fluido circundante e fora a clula a propulsionar-se atravs do meio,
locomovendo o organismo.
Do ponto de vista evolutivo os procariotos so os seres mais antigos do planeta.
Acredita-se que durante 2 bilhes de anos eles foram os nicos residentes vivos da Terra. Os
primeiros eucariotos teriam surgido de procariotos, da as semelhanas encontradas entre
esses dois tipos de clulas, as quais sero descritas a seguir.

Organizao Celular em Eucariotos

Como foi visto as clulas eucariotas certamente evoluram a partir de clulas


procariotas ancestrais. Em funo da existncia de um ancestral comum as clulas eucariotas
compartilham semelhanas com clulas procariotas: apresentam uma linhagem gentica
idntica codificada no DNA; possuem mecanismos de transcrio e traduo da informao
gentica e ribossomos similares; possuem maquinaria de conservao de energia qumica
(ATP) em membranas biolgicas; compartilham passos metablicos como gliclise, ciclo do
cido tricarboxlico e fotossntese similares; possuem um membrana plasmtica com mesma
constituio molecular, a qual delimita a clula constituindo uma barreira seletiva e permevel
entre o mundo vivo e o inanimado.
A diferena bsica existente entre uma clula procariota e uma clula eucariota est
na organizao do material gentico. O DNA das clulas procariotas est disperso no
citoplasma em uma regio denominada nucleide, enquanto nos eucariotos o material

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gentico est associado a protenas e envolto por uma estrutura membranosa complexa
constituindo o ncleo da clula. A palavra eucarioto, portanto, tem significado de ncleo
verdadeiro em funo do prepfixo eu que significa verdadeiro, seguido do sufixo karyon. O
DNA de uma clula eucariota muito mais complexo e extenso do que de uma clula
procariota, podendo atingir metros de comprimento alm de ser distribudo em numerosos
cromossomos.
Analisando superficialmente uma micrografia eletrnica de uma clula eucariota
observa-se que seu citoplasma preenchido por uma diversidade de estruturas que
constituem as organelas membranosas. As mitocndrias so as organelas mais notveis no
citoplasma e esto presentes essencialmente em todas as clulas realizando a respirao
celular, onde energia qumica na forma de ATP produzida a partir da oxidao de molculas
orgnicas. Os plastdeos constituem outro grupo de organelas membranosas que esto
presentes apenas em cianobactrias e clulas vegetais. nos cloroplastos que ocorre a
fotossntese processo no qual a energia solar transformada em energia qumica atravs da
fixao de carbono e liberao de oxignio. Alm dessas duas organelas membranosas o
citoplasma de uma clula eucariota constitudo por uma rede de endomembranas da qual
fazem parte o retculo endoplasmtico (liso e rugoso), o complexo de Golgi, endossomos e
lisossomos. Juntas, essas organelas so responsveis pela produo, ordenao, modificao e
transporte de molculas biolgicas a partir de em produto bruto. O destino final dessas
molculas pode ser organelas celulares, membrana plasmtica, meio extracelular ou
lisossomos. Os lisossomos constituem organelas amorfas cuja funo a digesto intracelular.
Alm das organelas citadas at ento uma clula eucariota possui em seu citoplasma
inmeras vesculas membranosas simples que possuem formas, tamanhos e funes variadas.
Entre elas citam-se vesculas envolvidas no transporte de material de uma organela a outra e
vesculas enzimticas, como os peroxissomos, responsveis pela degradao do perxido de
hidrognio. Neste sentido as membranas presentes nas organelas das clulas eucariotas
funcionam como divisrias no citoplasma permitindo a compartimentalizao e especializao
de atividades celulares.
O citoplasma da clula eucariota se comporta como um gel aquoso onde est contido
um gama de molculas sendo o local de ocorrncia de muitas reaes qumicas fundamentais
a existncia da clula. Ele contm ainda tbulos e filamentos que so ancorados em uma das
extremidades das membranas que se irradiam por toda a clula, constituindo o citoesqueleto.
A rede interna de filamentos do citoesqueleto constituda por protenas e auxiliam na
estruturao e manuteno da forma da clula.

33
Atividade 5

Objetivos:
1. Diferenciar clulas procariotas e eucariotas.
2. Diferenciar clulas eucariotas animais de clulas eucariotas vegetais.

1 Observao de clulas procariotas (bactria de iogurte).


Procedimento: Sob uma lmina coletar uma pequena poro de coalhada. Pingar uma gota de
gua e dissolver bem. Fazer um esfregao, tomando-se o cuidado de identificar o lado da
lmina no qual encontra-se o esfregao. Secar bem a lmina, podendo utilizar chapa aquecida.
Pingar 3-4 gotas da mistura lcool-clorofrmio. Secar o preparado movimentando a lmina no
ar. Em seguida, pingar 2 gotas de azul de metileno, espalhando-o pela lmina. Aguardar 5
minutos, lavando com gua destilada. Limpar o excesso de gua e levar ao microscpio para
observao em objetiva de 10x e 40x. Fechar um pouco o diafragma aps a localizao do
material. Represente o material observado no aumento de 400x.

2 Observao de clulas eucariotas unicelulares (levedo de po).


Procedimento: Tome uma poro de fermento de po, dissolvendo-o em gua morna. Junte
acar, deixando descansar por 15 a 20 minutos. Pingue uma gota da suspenso sobre uma
lmina, adicione uma gota do corante azul de metileno, cubra com lamnula e observe ao
microscpio com as objetivas de 10x e 40x. Esquematize no aumento de 400x.

3 Observao de clulas eucariotas vegetais (catafilo de cebola).


Procedimento: Retirar delicadamente um pedao da epiderme do catafilo da cebola com
auxlio de uma pina; Distender suavemente o material coletado sobre a lmina, com auxlio de
um pincel molhado em gua; Pingar sobre o material distendido uma gota de gua; Cobrir com
a lamnula; pingar em uma das extremidades da lamnula uma gota de azul de metileno e com
auxlio de papel filtro, aspirar na margem oposta at a infiltrao do corante; Analisar em
aumentos crescentes, utilizando as objetivas de 4x, 10x e 40x. Esquematizar no aumento de
400x.

1) bactria de iogurte 2) levedo de po 3) catafilo de cebola

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4 Quais as caractersticas observadas nas clulas das bactrias, do levedo de po e
do catafilo? Como voc diferenciaria estas clulas atravs de suas observaes?
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5 Compare as clulas da bactria e da cebola com as clulas da mucosa bucal


observada na aula anterior.
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6 - Quais as principais diferenas internas que no puderam ser observadas ao


microscpio de luz?
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6 A Clula Vegetal
Parede Celular, Vacolo e Plastdios

A biologia celular das plantas essencialmente similar dos animais, ou seja, a clula
a unidade estrutural do vegetal. No entanto, a clula vegetal apresenta alguns aspectos
especiais, como parede celular, mais ou menos rgida, envolvendo o protoplasto; um ou mais
vacolos, que so cavidades cheias de lquido que se encontram no citoplasma; e organelas
exclusivas, os plastdios, relacionados com os processos de armazenamento e fotossntese.
Nesta aula iremos ver os aspectos gerais destes trs constituintes particulares da clula
vegetal.

Parede Celular

A parede celular primria, formada por um esqueleto de celulose e uma matriz de


natureza glicdica (hemicelulose e pectina) e protica (extensina), uma estrutura tpica de
clulas vegetais. Os polmeros de celulose, principal componente da parede, so agrupados
em microfibrilas formando um arcabouo preenchido por uma matriz de molculas, dentre
elas destacam-se: as hemiceluloses (variam entre diferentes tipos celulares e entre os
diferentes grupos de plantas), as pectinas (comuns nas primeiras camadas formadas na
parede celular e na lamela mediana), glicoprotenas, enzimas, lignina (confere resistncia) e
substncias graxas (cutina, suberina e ceras).
A parede celular primria limita a expanso do protoplasto, evitando a ruptura da
membrana plasmtica quando o protoplasto aumenta de volume em decorrncia da entrada
de gua. A parede celular tambm determina, em grande parte, o tamanho e a forma da
clula vegetal e a textura do tecido, contribuindo para a forma final do rgo vegetal. Alm
dessas funes, a parede celular pode apresentar papel na defesa ativo contra fitopatgenos
(bactrias e fungos).
Quando inicia-se o processo de diferenciao celular, dependendo da funo que
clula vegetal ir desempenhar, ocorre deposio de grande quantidade de celulose, formando
a parede secundria internamente parede primria. A matriz da parede secundria
constituda de hemicelulose. A parede secundria aumenta a resistncia, especialmente nas
clulas do xilema.
Uma caracterstica importante da parede a presena poros que interligam clulas
vizinhas e por onde passam os plasmodesmos (canais citoplasmticos que permitem trocas
entre as clulas). Estes poros originam-se em decorrncia da no deposio de componentes
qumicos em alguns locais da parede.

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Vacolo

O vacolo, assim como os plastdios e a parede celular, separam as clulas vegetais


das animais. Essa organela delimitada por uma membrana denominada tonoplasto e
origina-se diretamente do retculo endoplasmtico ou, mais comumente, do complexo de
Golgi.
Os vacolos so preenchidos pelo suco vacuolar, contendo, especialmente, gua, ons
inorgnicos (Ca2+, K+, Cl-, Na+, HPO42-), acares, cidos orgnicos, aminocidos, e cristais de
oxalato de clcio. Esses ltimos podem apresentar diferentes formas.
A clula vegetal imatura tipicamente apresenta numerosos pequenos vacolos. Ao
longo do desenvolvimento celular, os vacolos aumentam de tamanho e se fundem formando
uma nica organela que ocupa cerca de 90% do volume celular. Esse fato promove o
desenvolvimento de uma presso interna e a manuteno da rigidez do tecido.
Alm dessa funes, os vacolos:
a) so compartimentos de armazenamento de metablitos primrios (acares,
cidos orgnicos e protenas de reserva nas sementes) e secundrios (nicotina e taninos).
b) so stios de acmulo de antocianinas, que conferem colorao a alguns tecidos e
rgos dos vegetais.
c) esto envolvidos na quebra de macromolculas e na reciclagem de componentes
celulares. Nesse caso, os vacolos so comparveis aos lisossomos das clulas animais.

Plastdios

Em clulas vegetais ocorrem organelas tpicas denominadas plastdios. Estas organelas


esto presentes em todas as clulas vegetais e compartilham caractersticas comuns, tais
como:
a) so circundadas por duas membranas concntricas,
b) possuem um genoma prprio (nucleide), bem como uma maquinaria para
biossntese protica, por isso denominadas organelas semi-autnomas.
Os plastdios se desenvolvem a partir de proplastdios, pequenas organelas presentes
em clulas meristemticas que se diferenciam em um determinado tipo de plastdio, em
funo da clula em que se encontra e dos estmulos ambientais. A figura 6.1 representa o
ciclo de desenvolvimento e converso do proplastdio.
Os plastdios diferem entre si em virtude das suas caractersticas estruturais e dos
compostos qumicos que armazenam. Desta forma, os plastdios podem ser assim
classificados em:

A) LEUCOPLASTOS

Plastdios maduros menos diferenciados estruturalmente em virtude da perda de


pigmentos e por no apresentarem um sistema interno de membranas elaborado. Esses
plastdios armazenam substncias de reserva e esto presentes principalmente em clulas de
razes, caules, frutos e sementes. Dentre os leucoplastos listam-se:

37
1 amiloplastos, armazenamento de amido, presentes em grande quantidade em
caules e razes, alm de serem encontrados em folhas, armazenando o excedente de
carboidrato oriundo da fotossntese;
2 proteoplastos, armazenamento de protena, e
3 elaioplastos, armazenamento de lipdios, encontrados em clulas de frutos e
sementes;

B) CROMOPLASTOS

Plastdios que contm em seu interior pigmentos coloridos. Essas organelas


apresentam formas variadas, sintetizam e retm pigmentos do grupo dos carotenides. Esses
compostos conferem colorao a muitas flores e alguns frutos e razes. Os cromoplastos
podem se originar a partir de cloroplastos preexistentes, por uma converso na qual a
clorofila e a estrutura interna de membrana dos cloroplastos desaparecem e uma grande
quantidade de carotenides se acumula. Dentre os cromoplastos listam-se:
1 xantoplastos, possuem pigmentos que conferem cor amarela (xantofilas), e
2 eritroplastos, possuem pigmentos que conferem cor vermelha.
Esses plastdios possuem importncia adaptativa, uma vez que atuam como atrativo
para organismos dispersores de plen (cor da flor) e de sementes (cor do fruto).

Cloroplasto

Estioplasto

Cromoplasto
Proplastdio

Elaioplasto
Amiloplasto
oooo
C) CLOROPLASTOS

So plastdios que contm pigmentos (clorofilas e carotenides) relacionados com a


ocorrncia da fotossntese. As clorofilas so os pigmentos responsveis pela colorao verde
dessas organelas. Os cloroplastos geralmente apresentam forma discide, medindo cerca de 4
a 6 micrmetros. Uma clula vegetal pode possuir de 40 a 50 cloroplastos, os quais se

38
dispem paralelamente parede celular, podendo reorientar-se na clula sob influencia da
luz.
A estrutura interna dos cloroplastos caracterizada pela ocorrncia do estroma, o
qual atravessado por um sistema de membranas na forma de sacos achatados denotados
tilacides. Acredita-se que os tilacides constituam um nico sistema interconectado. O
conjunto de tilacides empilhados denominado grana, sendo que os diferentes granum
(plural de grana) so interligados pelos tilacides que atravessam o estroma. Os carotenides
e as clorofilas esto inseridos na membrana do tilacide.
Os cloroplastos no so apenas o stio da fotossntese, mas tambm esto envolvidos
na biossntese de aminocidos e cidos graxos, e no armazenamento temporrio de
carboidratos como o amido.

39
Atividade 6

Objetivos:
1 . Diferenciar clulas de diferentes tecidos com base em suas paredes celulares.
2 .Observar a presena de substncias no vacolo.
3 . Observar incluses slidas no vacolo.
4 . Observar os cloroplastos.

1 Observao de clorosplastos, vacolo e parede celular de folhas de Tradescantia sp.


Procedimento: a) Retirar uma pelcula da epiderme inferior da folha de Tradescantia,
com o auxlio de uma lmina de barbear; b) Colocar este material sobre a lmina com
uma gota de gua e cobrir com lamnula iniciando sua colocao em posio de 45
com relao lmina e ir abaixando lentamente at que a mesma fique totalmente
sobre a lmina, evitando a formao de bolhas; c) Caso haja excesso de lquido, retirar
com papel absorvente, para manter a lamnula fixa; d) Analisar em aumentos
crescentes, utilizando as objetivas de 4x, 10x e 40x; e) Esquematizar em aumento de
400x.
Observar: 1 Estmatos, constitudos pelas clulas-guarda, clulas subsidirias ou
acessrias na epiderme da folha; 2 Parede celular, citoplasma, cloroplastos e ncleo.

2 Observao de diferentes plastdios presentes em razes, folhas e frutos.


Procedimento: a) Faa cortes finos de frutos imaturos e maduros de Solanum
lycopersicum Mill. (tomate). Coloque-os em placas de Petri com gua. Escolha os mais
finos e coloque-os na lmina que j dever estar com uma gota de gua. Reserve. b)
Faa cortes finos de raiz tuberosa de Daucus carota L. (cenoura) e coloque-os em placa
de Petri com gua. Escolha o mais fino e coloque-o ao lado dos outros 2 cortes de
tomate. Reserve. c) Faa cortes finos transversais de Sanservieria sp.. Coloque-os na
placa de Petri com gua. Escolha o mais fino e coloque-o junto aos outros 3 cortes. d)
Cubra os 4 cortes com uma lamnula.

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3 Observao de amiloplastos evidenciados com lugol.
Procedimento: a) Faa cortes finos no tubrculo de Solanum tuberosum L. (batata); b)
Coloque os cortes em placa de Petri com gua e retire o excesso de plastdios com o
auxlio do pincel; d) Coloque o corte lavado sobre uma gota de lugol e cubra-o com
uma lamnula; e) Observe ao microscpio utilizando a segunda objetiva a seco.

Preencha o quadro abaixo de acordo com suas observaes:

Plastdio (s)
Classificao Esquema
presente (s)

Batata

Tomate
Imaturo
Corte Obsevado

Tomate
Maduro

Cenoura

Espada de
So Jorge

4 O que voc observou nos cortes onde se utilizou o lugol? (Espada de So Jorge,
batata e tomate verde).
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5 Como voc explica a ocorrncia de 3 tipos de plastdios no tomate? D suas


funes, justificando suas presenas em relao fase em que se encontra o fruto.

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6 Observao de parede primria e secundria em caule de caruru.


Procedimento: a)Com o auxlio da lmina de barbear faa cortes transversais no
material colocado sobre o balco (caule) e coloque-os na gua na placa de Petri; b)
Coloque uma gota do corante Verde Iodo Actico em uma das extremidades da
lmina juntamente com 2 cortes delgados e deixe que o corante atue por 5 minutos; c)
Retire os cortes do corante com o auxlio do pincel e lave-os na gua da placa de Petri.
d) Coloque uma gota do corante Vermelho Congo na outra extremidade da lmina
utilizada na colorao acima e transfira os 2 cortes, j lavados, para esse corante e
deixe atuar por 2 minutos; e) Retire os cortes do corante e lave-os na placa de Petri; f)
Transfira os cortes corados e lavados para outra lmina limpa, com uma gota dgua,
cubra com a lamnula; g) Observe ao microscpio, utilizando a segunda objetiva a seco.

Esquematize uma poro do campo observado, desde a epiderme at a medula.

42
7 Permeabilidade Seletiva das
membranas
Introduo

As clulas de qualquer organismo esto envoltas pela membrana celular. A


constituio dessa membrana promove a passagem controlada de substncias e o
conseqente equilbrio dinmico no interior do organismo.
Permeabilidade seletiva um processo fundamental para a manuteno de condies
intracelulares adequadas para o funcionamento e vida da clula. A seletividade determina
quais as substancias devem entrar e sair da clula. A membrana deve permitir a entrada de
substancias responsvel pelo crescimento, regenerao e atividades vitais da clula, alm de
regular a sada de substancias atravs da secreo e da excreo. Enfim, a membrana
permite que a clula mantenha equilibrada o seu meio interno independentemente das
condies do meio extracelular. O meio interno deve ser adequado ao metabolismo normal de
cada tipo de clula.
A composio qumica e a organizao molecular da membrana plasmtica que
embasam os estudos de permeabilidade. Esses constituintes estabelecem uma clara
diferenciao entre o lquido intracelular e o extracelular, no qual a clula est imersa.
A membrana plasmtica, e de uma maneira geral todas as membranas celulares, so
constitudas por uma bicamada lipdica e por protenas que apresentam uma organizao
vetorial (Figura 7.1). Os lipdios das membranas so molculas anfipticas com as regies
polares ou hidrfilas orientadas para as superfcies interna e externa, enquanto que as regies
apolares ou hidrfobas se localizam no interior das membranas. As membranas apresentam
natureza fluda gozando as molculas proticas de mobilidade lateral, no plano da
membrana. As protenas so os principais componentes funcionais das membranas celulares.
Como a seletividade das membranas reflexo de sua estrutura e composio
qumica, molculas apolares de pequeno porte tais como oxignio (O2) e dixido de carbono
(CO2) e molculas no carregadas (gua, etanol e glicerol) podem mover a favor de um
gradiente de concentrao atravs da prpria bicamada por simples difuso. Em contraste as
bicamadas lipdicas so altamente impermeveis a todos os ons e molculas carregadas,
independente de seu tamanho. Neste caso protenas transportadoras so necessrias para
transferir tais substncias atravs das membranas celulares. Por exemplo, se um soluto est
presente em maior concentrao fora da clula do que em seu interior e uma protena
transportadora est presente na membrana celular, o soluto mover-se- espontaneamente,
atravs da membrana pela protena transportadora para dentro da clula por transporte
passivo, sem gasto energtico. Por outro lado, transporte de solutos contra o gradiente de
concentrao demandam gasto de energia, este mecanismo denominado transporte ativo.

43
Figura 7.1 Representao esquemtica da estrutura em mosaico fluido da membrana
celular.

A manuteno de determinadas substncias dentro ou fora da clula, contra um


gradiente de concentrao, s poder ser mantida caso a membrana celular esteja ntegra.
Exposio a solventes orgnicos que dissolvem lipdeos alteram a permeabilidade da
membrana por desnaturarem a bicamada lipdica. Temperaturas elevadas tambm atuam
alterando a integridade e a seletividade da membrana, uma vez que o calor desnatura a
maioria das protenas envolvidas no transporte de substncias.
A membrana plasmtica geralmente mais permevel a gua do que aos solutos
nela dissolvidos. Quando duas solues de diferentes concentraes esto separadas pela
membrana, ocorre um deslocamento da gua para o meio de maior concentrao. Esta
passagem da gua atravs da membrana um tipo de transporte passivo denominado
osmose. Desta forma uma clula colocada em um meio hipotnico tende a intumescer devido
a absoro de gua por osmose, enquanto que em meio hipertnico a clula tende a perder
volume devido ao movimento de sada de gua. As clulas vegetais, por apresentarem a
parede celulsica que cria resistncia contra a entrada excessiva de gua, so impedidas de
intumescer at a lise celular. Em meio hipertnico, clulas vegetais perdem gua e sofrem
retrao do citosol em relao parede celular, uma condio denominada plasmlise. A
plasmlise temporria no destrutiva para a clula. Esta pode recuperar rapidamente sua
condio de turgidez normal, se a colocarmos em um meio isotnico em relao ao citosol de
uma clula normal. Tal mecanismo denominado desplasmlise.

44
Atividade 7

Objetivos
1. Descrever o efeito e o mecanismo de ao da acetona e da temperatura elevada
sobre a permeabilidade das membranas celulares.
2. Relacionar as alteraes de formatos das clulas com a concentrao do meio
extracelular e o fenmeno de osmose.
3. Observar e justificar a resistncia de clulas vegetais em meios hipotnicos.

1 Efeito do solvente orgnico sobre a permeabilidade das membranas celulares:


Procedimento: Identifique dois tubos de ensaio com os nmeros 1 e 2. Coloque 4 mL
de gua no tubo nmero 1 e 2 mL no tubo nmero 2. Acrescente 2 mL de acetona no
tubo nmero 2. Adicione a cada um dos tubos um cubo de beterraba cortada. Aguarde
cerca de uma hora e verifique o que ocorreu em cada um dos tubos.

Aps a observao do resultado responda:

a) O que se pode concluir quando se compara os resultados dos tubos 1 e 2?


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b) Como a acetona atuou sobre as clulas?


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2 Efeito do aquecimento sobre a permeabilidade das membranas celulares


Procedimento 1: Enumere trs tubos de ensaio. Faa as adies descritas no quadro
seguinte, na seqncia indicada, agitando aps cada adio.
Tubo Suspenso de levedo Vermelho congo gua
1 2 mL - 3 mL
2 2 mL 3 mL -
3 2 mL 3 mL -

- Em seguida coloque o tubo nmero 3 em banho Maria a 100oC por 10 minutos.

Procedimento 2: Coloque, com auxilio de uma pipeta, uma gota da suspenso de


levedo, do tubo 1, sobre uma lmina e cubra o material com uma lamnula. Observe ao
microscpio tendo, o diafragma inicialmente fechado, mas regule sua abertura quando
utilizar diferentes objetivas.

45
- As clulas de levedo so esfricas ou ovaladas e podem apresentar brotamentos
(uma clula pequena unida a outra maior) caractersticos de seu processo de
reproduo. Atente para a colorao destas clulas.

Procedimento 3: Monte outra lmina colocando, com auxilio de pipetas uma gota da
suspenso de levedo do tubo nmero 2 em uma das extremidades da lmina, uma gota
da suspenso de levedo do tubo nmero 3 na outra extremidade. Ao utilizar as pipetas
cuidado para que no as misture. Cubra cada gota com uma lamnula. Observe ao
microscpio com a lente objetiva de 40X, regulando a abertura do diafragma. Aps a
observao responda as questes a, b, c e d.

a) Como se apresentam as clulas no tubo 2, em relao ao corante?


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b) O que isto indica quanto permeabilidade da membrana plasmtica do levedo ao


vermelho Congo?
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c) Qual a cor apresentada pelas clulas do levedo no tubo nmero 3?


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d) Houve penetrao do corante? Por qu?


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3 Osmose em clulas animais.


As clulas sanguneas em suspenso correspondem, na sua maioria, em glbulos
vermelhos (hemcias). Com a lente objetiva de 4X, o conjunto destas clulas mostra-
se com aspecto granular. A partir da lente objetiva de 10X e com a lente objetiva de
40X, percebe-se que as hemcias no caso de mamferos, tm formato de disco
bicncavo e so anucleadas.

Procedimento 1: Coloque sobre uma lmina, com auxlio de uma pipeta de Pasteur,
uma gota de suspenso de sangue em soluo isotnica (NaCl 0,9%) e cubra o material
com uma lamnula. Observe ao microscpio tendo o diafragma inicialmente fechado.
Ao utilizar a objetiva de 40X, regule a abertura do diafragma de modo a obter uma
imagem ntida. Observe a forma das hemcias.

Procedimento 2: Monte outra lmina colocando, com auxilio de pipetas uma gota da
suspenso de sangue em soluo hipertnica (NaCl 1,5%) em uma das extremidades da

46
lmina e uma gota de sangue em soluo hipotnica (NaCl 0,6%) na outra
extremidade. Ao utilizar as pipetas, cuidado para que no as misture. Cubra cada gota
com uma lamnula. Observe ao microscpio com a lente objetiva de 40X, regulando a
abertura do diafragma. Aps a observao responda as questes a, b e c.

a) Desenhe as clulas conforme se apresentem em cada meio.

1) Isotnico 2) Hipotnico 3) Hipertnico

b) Qual a forma das hemcias na soluo de NaCl a 0,9%?


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c) Quais foram as modificaes observadas das hemcias quando colocadas nas


solues de NaCl 1,5% e 0,6%? Como estas modificaes podem ser explicadas?
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_____________________________________________________________

4 Osmose em clulas vegetais

A epiderme da folha de Tradescantia apresenta clulas prismticas aclorofiladas, sendo


que muitas delas apresentam colorao rosada de aspecto homogneo. Esta colorao
deve-se ao pigmento antocianina, presente no vacolo destas clulas, cujo citoplasma
restrito a uma faixa justaposta a parede celular. Desta forma o conjunto apresenta-se
com uma colorao uniforme, no sendo possvel distinguir o citoplasma do vacolo.
As nicas clulas epidrmicas clorofiladas (apresentando tonalidade esverdeada) so as
clulas-guarda estomticas, em forma de cunha e aos pares. Os cloroplastos
observados sob as clulas epidmicas comuns so provenientes das clulas do
parnquima clorofiliano, as quais se romperam no processo de retirada da epiderme.

47
Procedimento 1: Monte uma lmina colocando uma gota de gua em uma extremidade
e uma gota de soluo salina (NaCl 2%) na outra extremidade. Retire com auxlio de
uma pina alguns fragmentos da epiderme inferior de uma folha de Tradescantia.
Coloque os fragmentos retirados em cada uma das gotas sobre a lmina e cubra o
material com a lamnula. Observe ao microscpio, utilizando a lente objetiva de 10X.
Inicie a observao com o material montado em gua.

Procedimento 2: Substitua a soluo salina por gua destilada, procedendo da seguinte


maneira: coloque uma gota de gua destilada em uma das extremidades da lamnula,
encoste um pedao de papel de filtro na outra extremidade, de forma a absorver a
soluo existente entre a lmina e a lamnula. Observe ao microscpio, utilizando a
lente objetiva de 10X e responda as questes de a at f.

a) Qual foi a modificao observada na forma das clulas, quando montadas em


soluo salina 2%?
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________________________________________________________________
________________________________________________________________

b) Que nome se da a este fenmeno em clulas vegetais?


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c) O que ocorreu com as clulas aps a substituio da soluo salina por gua
destilada? Explique.
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________________________________________________________________

d) Que nome se da esta modificao?


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e) Porque as clulas observadas no de rompem com a exposio excessiva a gua?


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f) O que voc esperaria que ocorresse com clulas animais, como as hemcias, caso
fossem colocadas em gua destiladas?
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48
8 Movimentos Celulares
Princpios e exemplos de movimentos celulares

As clulas no so estticas, e pelo contrrio, elas possuem movimentos que


permitem a locomoo, a contrao muscular, a circulao do meio extracelular, a
movimentao das estruturas intracelulares e as atividades de endocitose e/ou de exocitose.
As alteraes no conjunto de microtbulos e/ou de filamentos de actina presentes no
citoplasma, que constituem o citoesqueleto, que possibilitam os diversos tipos de
movimentos. Alm de atuar na mobilidade da clula, o citoesqueleto est diretamente
relacionado s alteraes coloidais citoplasmticas, sustentao de protenas solveis e
ribossomos e manuteno do formato celular.
Os filamentos de actina ou microfilamentos so compostos pela protena actina. Eles
apresentam espessura de aproximadamente 5 a 9 nm e formam uma gama bastante ampla
de estruturas diferentes, estando distribudos por todo o citoplasma e aparecendo, algumas
vezes, tambm no ncleo. Entretanto, h uma concentrao maior dos filamentos de actina
abaixo da membrana plasmtica. Eles so responsveis por diversos tipos de movimentos
celulares, como, por exemplo, a contrao muscular, quando associados a protenas motoras
de miosina.
O msculo estriado esqueltico formado por clulas alongadas, com numerosos
ncleos ovalados, dispostos na periferia, ao longo da clula. Cada clula multinucleada, ou
fibra muscular, apresentam muitas fibrilas, ao longo das quais as unidades contrteis
(sarcmeros) se repetem linearmente. A seqncia de sarcmeros formada por grupos de
filamentos de actina associados miosina, conforme pode ser visto na figura seguinte (Figura
8.1).
As regies de acmulo de actina formam faixas claras (bandas-I), enquanto que nas
faixas escuras h superposio parcial de filamentos de actina e da miosina (bandas-A). Em
uma banda-A, a regio central, ocupada apenas por miosina, forma a banda-H. No centro da
banda-H observa-se uma faixa mais densa (linha-M), resultante da interconexo da miosina.
A interconexo entre os filamentos de actina forma a linha-Z, que dividi a banda-I ao meio e
representa o limite de cada sarcmero (Figura 8.1).
Ao microscpio de luz o alinhamento dos sarcmeros resulta numa alternncia de
faixas claras e escuras, formando estriaes transversais. O movimento de contrao
muscular ocorre devido ao deslizamento dos filamentos de actina sobre os de miosina,
resultando na diminuio do comprimento de cada sarcmero e na contrao da fibra como
um todo.
Os movimentos citoplasmticos, como a ciclose em clulas vegetais e o movimento
amebide em, por exemplo, amebas e leuccitos so tambm realizados pelos filamentos de
actina e de miosina. Nesses casos, eles no estariam organizados em sarcmeros, mas
dispostos em outros arranjos no citoplasma. No movimento amebide esto envolvidas trs
etapas principais: polimerizao dos filamentos de actina empurrando a membrana

49
plasmtica para frente, formando pseudpodes, a adeso dos pseudpodes ao substrato por
protenas transmembrana e, por ltimo, a retrao do citoplasma, pela interao da actina
com a miosina, deslocando-se como um todo. O movimento amebide tem como
conseqncia o deslocamento da clula e tambm possibilita a fagocitose.

Figura 8.1 Esquema de um sarcmero

Para facilitar a difuso de solutos entre diferentes pontos do citoplasma, clulas


animais e vegetais possuem correntes citoplasmticas, organizadas pelos componentes do
citoesqueleto. Como o citoplasma das clulas vegetais constitui normalmente apenas uma
estreita lmina entre o grande vacolo central e a membrana plasmtica, o seu movimento,
acompanhado das organelas, bastante ordenado, por isso recebendo a denominao de
ciclose. Esta pode ser facilmente observada em citoplasmas de Elodea, onde os cloroplastos
circulam nas estreitas faixas de citoplasma que contornam o vacolo central.
Os microtbulos so estruturas cilndricas e bastante longas, com cerca de 25 nm de
dimetro. Eles so relativamente flexveis. Sua distribuio na clula varivel, em funo da
situao fisiolgica, mas geralmente irradiam de um dos centros de organizao dos
microtbulos, como o centrossomo. Suas cujas paredes so compostas por dmeros da
protena tubulina. Eles so os principais componentes do aparelho mittico, dos centrolos, dos
clios e dos flagelos.
Clios e flagelos so projees da membrana plasmtica, responsveis pela
movimentao. Nas clulas do epitlio da traquia, os clios tm funo de circular o meio
adjacente a elas, formando uma corrente contnua e unidirecional do muco e partculas
aderidas. Em alguns protistas, como a Vorticella, o Stentor e o Paramecium, os clios ajudam
na conduo de partculas alimentares para o ciststoma, uma regio especializada da
membrana, responsvel pela ingesto de alimentos. Ainda no Paramecium, o batimento
coordenado dos clios permite o movimento da clula, to importante para a explorao do
meio a procura de alimento, como para fuga de possveis predadores. Enquanto os clios so
numerosos e curtos, os flagelos so longos e ocorrem em pequeno nmero por clula.
A estrutura fundamental responsvel pelos movimentos dos clios e flagelos o
axonema. Este formado por um feixe de microtbulos, com suas extremidades positivas
voltadas para a extremidade distal, e protenas associadas. Na grande maioria dos clios e

50
flagelos de eucariotos, os microtbulos so arranjados em um padro caracterstico de 9 +
2, no qual um par central de microtbulos simples circundado por nove duplas perifricas
de microtbulos. Os clios e flagelos originam-se a partir de corpsculos basais, constitudos
por microtbulos dispostos em um arranjo idntico ao dos centrolos (9 trincas perifricas,
sem microtbulos centrais).
Enquanto os microtbulos e os filamentos de actina ocorrem em todas as clulas
eucariticas, no citoesqueleto de metazorios ocorre um terceiro tipo de filamentos, os
filamentos intermedirios. Mesmo nestes organismos, h tipos celulares que tambm no
possuem filamentos intermedirios. Estes filamentos so compactos, com espessura por volta
de 10 nm e formados por uma variedade de protenas fibrosas como, por exemplo, a
queratina. Entretanto, os filamentos intermedirios, aparentemente, no participam de
movimentos celulares, eles so particularmente abundantes no citoplasma de clulas que
esto sujeitas ao estresse mecnico e sua principal funo parece ser conferir resistncia s
clulas e tecidos.

51
Atividade 8

Objetivos
1. Identificar as estruturas responsveis pelo movimento de diferentes tipos celulares
na microscopia de luz
2. Relacionar as estruturas responsveis pelos movimentos com as funes que
desempenham em diferentes tipos celulares.

1 Observao de fibras musculares estriadas em lngua de rato (cortes corados pelo


tricmio de Mallory).
Procedimento: Com a lente objetiva de 10x, escolha um campo mais ao centro do
corte, onde existam clulas musculares cortadas longitudinalmente e, portanto, com
forma alongada. Observe algumas dessas clulas com a lente objetiva de 40x e
responda a prxima questo.

Esquematize uma regio de uma clula muscular, identificando os ncleos e as bandas


A e I.

2 Observao de clios em clulas fixas de traquia e esfago de rato (corte


transversal corado pela hematoxilina frrica e eosina).
Procedimento: Com a lente objetiva de 10x, tente distinguir no corte a traquia e o
esfago. Focalize o epitlio voltado para a luz da traquia, escolha uma regio bem
preservada e observe-a com a lente objetiva de 40x.

a) Qual a funo dos clios nessas clulas?


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3 Observao do movimento de flagelo em clulas de espermatozides de mamfero.
Procedimento: Coloque sobre a lmina uma gota de smen e cubra com lamnula.
Comece a focalizar com a lente objetiva de 10x, v at a de 40x e responda a prxima
questo. Esquematize um espermatozide, indicando a cabea e a cauda (flagelo)

4 Observao de movimento de protistas.


Procedimento: Coloque sobre uma lmina, uma gota de gua coletada previamente
(pode ser coletada em bromlias, aqurios, etc). Observe ao microscpio, inicialmente
com a objetiva de menor aumento e o diafragma fechado. Observando o material com
a lente objetiva de 40x, esquematize o protozorio encontrado.

Aps observao responda:

a) Qual a estrutura responsvel pelo movimento do Paramecium?


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________________________________________________________________

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b) Qual a importncia da mobilidade para os organismos unicelulares?
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c) Cite as semelhanas e diferenas entre clios e flagelos.


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5 Observao de movimentos citoplasmticos em Elodea.


Procedimento: Coloque uma gota de gua sobre uma lmina, retire com uma pina, um
pedao da planta Elodea e deposite-o sobre a gota. Cubra o material com uma lamnula
e observe-o ao microscpio. Inicie pela objetiva de 10x e passe para a de 40x.
Controle a abertura e fechamento do diafragma e movimente o parafuso
micromtrico, de modo a visualizar nitidamente, o contedo celular. Observe o
movimento dos cloroplastos, ao longo das faixas estreitas de citoplasma ao redor do
vacolo. Aps observao, faa as questes a e b.

a) utilizando a lente objetiva de 40x, esquematize uma clula de Elodea indicando o


ncleo, o citoplasma e os leucoplastos.

b) Qual a importncia das correntes citoplasmticas, incluindo a ciclose, para as


clulas?

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9 Ncleo
Principais aspectos estruturais do ncleo

Em uma clula eucariota o ncleo corresponde a uma regio delimitada por um


sistema de duas membranas apresentando em seu interior DNA, RNA e protenas. Na
seqncia de bases nitrogenadas do DNA est a informao necessria para o controle
metablico e a diferenciao celular.

Estrutura e composio qumica nuclear

O ncleo composto de um envoltrio que separa seu contedo (cromatina, nuclolo


e nucleoplasma) do restante do citoplasma. Ao microscpio eletrnico o envoltrio nuclear se
aprese ta constitudo por duas membranas concntricas. A membrana externa apresenta
ribossomos aderidos a face citoplasmtica enquanto a membrana interna encontra-se
associada cromatina em sua face nuclear. Este envoltrio no contnuo, apresentando
poros que possibilitam a passagem de macromolculas como RNAs sintetizados no interior do
ncleo e carreados para atuar no citoplasma.
No ncleo interfsico, a cromatina constituda de DNA associado a protenas
bsicas denominadas histonas, podendo esta ser encontrada nas formas condensada e
descondensada. A eucromatina se apresenta descondensada na maioria das clulas, podendo
aparecer condensada em certos tipos celulares ou fase do ciclo celular. A cromatina sexual ou
corpsculo de Barr, encontrada em certas clulas de fmeas de mamferos, um exemplo
de eucromatina condensada. Neste caso uma das cpias do cromossomo X torna-se
altamente condensado e inativado. A heterocromatina por sua vez, apresenta-se condensada
em todas as clulas do organismo, independente da fase do ciclo celular.
Existem evidncias entre o grau de condensao da cromatina e sua atividade gnica.
Clulas com intensa atividade de sntese protica apresentam a cromatina descondensada
devido a atividade de transcrio, que resulta na formao de diferentes tipos de RNAs.
Situao oposta observada em clulas com baixa atividade de sntese protica. Isto pode ser
observado em microscopia de luz pela intensidade de colorao do ncleo.
Os nuclolos so regies de intensa basofilia ocasionada pelo grande acmulo de
RNAr nesta regio da cromatina. O tamanho e quantidade de nuclolos variam de acordo
com o tipo celular e com o estado funcional da clula. Geralmente os nuclolos so mais
evidentes e/ou numerosos em clulas com alta atividade de sntese protica.
A substncia de que preenche os espaos no interior do ncleo denominada
nucleoplasma, constitudo de gua, protenas, ons e metablitos. Acredita-se que no
nucleoplasma exista uma rede de filamentos similar ao citoesqueleto que ajudaria na
organizao e manuteno da forma do ncleo.

55
Nmero tamanho, forma e posio dos ncleos

Em geral o nmero tamanho, forma e posio dos ncleos variam entre os tipos
celulares, estando relacionados atividade metablica da clula. Clulas que apresentem
intensa atividade de sntese protica e/ou grandes volumes podem possuir mais de um ou
ncleos maiores. A diferena de tamanho do ncleo pode ser devido duplicao ou
descondensao da cromatina durante o ciclo celular.
Algumas clulas altamente especializadas, como as hemcias de mamferos so
anucleadas quando em seu estgio final de maturao. Por este motivo estas clulas so
incapazes de se reproduzir, o que determina sua curta vida mdia (em torno de 120 dias).
Nos diferentes tipos celulares normalmente o ncleo ocupa posio central no
citoplasma, entretanto em certos casos ele pode ser deslocado do centro, em decorrncia do
acumulo de materiais no citoplasma ou ao grande tamanho de certas organelas como o
vacolo em clulas vegetais.
Normalmente a forma do ncleo acompanha a forma da clula, esfrico em clulas
cbicas e alongado em clulas cilndricas. Em leuccitos observamos ncleos multiformes e
irregulares. Por exemplo, os neutrfilos apresentam ncleos polimrficos com dois a cinco
lbulos ligados por finas pontes cromatdicas. Em moncitos os ncleos variam de ovide a
reniforme de acordo com o estgio de maturao da clula.

56
Atividade 9

Objetivos
1. Observar ao microscpio de luz, a forma, o tamanho, a posio e o nmero de
ncleos em diferentes tipos celulares.
2. Observar ao microscpio de luz, nuclolos em diferentes tipos celulares.
3. Relacionar o grau de condensao da cromatina com a atividade metablica das
clulas observadas.
4. Observar a estrutura do ncleo e do nuclolo em eletromicrografias.

1 - Observe ao microscpio os diferentes tipos celulares e faa desenhos e esquemas


evidenciando citoplasma ncleo e nuclolo.

A) Sangue Humano (hemcias e leuccitos);


Procedimento: Focalize a lmina com a lente objetiva de 10X e escolha um campo
onde as clulas sanguneas estejam bem separadas. Esquematize uma hemcia
(eritrcito) e os diferentes leuccitos.
Tipos de leuccitos:
Moncitos e linfcitos a forma do ncleo varia de arredondado a reiniforme.
Neutrfilos, eosinfilos e basfilos apresentam ncleos segmentados (lobulados).

Caractersticas: Caractersticas: Caractersticas:

Caractersticas: Caractersticas: Caractersticas:

57
B) Fgado de Rato (hepatcitos)
Esquematize um hepatcito em um aumento final de 400X.

Aps observar as lminas e fazer os esquemas, responda as questes seguintes:

a) Tomando como referncia as clulas observadas, correta a afirmao de que o


formato dos ncleos acompanha sempre o formato das clulas? Justifique.
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________________________________________________________________
________________________________________________________________

b) Em que implica para os hepatcitos, a presena de ncleos volumosos ou de dois


ncleos por clula?
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c) Que relao existe entre o grau de condensao da cromatina e a atividade


metablica das clulas?
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d) Enumerar os nuclolos que ocorrem no interior dos ncleos observados. Porque as


clulas com intensa atividade de sntese protica geralmente apresentam nuclolos
evidentes?
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58
10 Ciclo Celular - Mitose
Movimentos dos cromossomos durante a mitose

O ncleo organizado observado no citoplasma de clulas eucariotas durante um


perodo do ciclo celular denominado interfase. No decorrer deste a clula pode apresentar
intensa atividade metablica e ter seu DNA replicado. A replicao um pr-requisito para a
mitose. A mitose garante a manuteno da bagagem gentica ao longo do processo
proliferativo celular. Nas clulas eucariotas diplides (2x), a mitose um processo divisional,
por meio do qual os cromossomos da clula me so igualmente distribudos entre as clulas
filhas.

Mitose

O crescimento e desenvolvimento dos organismos vivos dependem do crescimento e


da diviso de suas clulas. Em seres unicelulares a diviso celular representa a prpria
reproduo. Ao contrrio nos organismos pluricelulares que provm de um zigoto, repetidas
divises a partir da clula inicial levam ao desenvolvimento e crescimento do indivduo.
A gnese de novas clulas faz parte de um processo cclico denominado ciclo celular,
o qual compreende dois perodos; Interfase e Diviso.
Na Interfase, perodo entre o final de uma diviso e o incio da seguinte, o material
gentico nuclear encontra-se disperso e ativo, constituindo a cromatina. Este perodo pode se
dividido em trs fases, G1, S e G2. A fase G1 caracteriza-se por uma intensa sntese de RNA
e de protenas. Nesta fase ocorre o crescimento geral e reconstituio do citoplasma das
clulas filhas recm originadas. Na fase S, que se segue, ocorre a duplicao no contedo de
DNA, paralelamente sntese das histonas, com as quais o DNA se complexa. Os eventos
ocorridos em G2 no esto bem esclarecidos, entretanto sabe-se que nesta etapa ocorre
sntese de protenas indispensveis para o incio da mitose.
A Diviso, perodo entre o final de uma mitose e o incio da seguinte, compreende a
fase M, composta por dois processos, Mitose (diviso nuclear) e Citocinese (diviso
citoplasmtica).
Uma srie de eventos permite, para fins de estudo, identificar e caracterizar uma
seqncia de cinco fases no processo mittico, apesar de no existirem limites precisos entre
elas. Estas fases so denominadas prfase, metfase, anfase e telfase e encontram-se
descritas a seguir:
Prfase: os cromossomos duplicados se condensam progressivamente, o nuclolo se
desorganiza enquanto o fuso mittico progressivamente organizado.
Prometfase: trmino da desorganizao do nuclolo. O envelope nuclear se rompe
e os microtbulos do fuso se ligam aos centrmeros cromossmicos.
Metfase: caracteriza-se pela reunio dos cromossomos no plano equatorial da
clula.

59
Anfase: ocorre rompimento de centrmeros e separao de cromossomos em dois
conjuntos idnticos, e a posterior migrao destes para os plos opostos da clula.
Telfase: inicia quando cada um dos conjuntos cromossmicos chega aos plos do
fuso. Esta fase caracteriza-se pela reconstituio dos dois ncleos filhos, que assumem aos
poucos um aspecto interfsico.
Concomitante s duas ltimas etapas inicias-se a citocinese, diviso do citoplasma.
Esta fase difere de maneira acentuada entre clulas animais e vegetais. Nas clulas animais a
separao das clulas filhas ocorre por um mecanismo contrtil, no qual participam
microfilamentos de actina e miosina. Nas clulas vegetais a citocinese comea com o
aparecimento do fragmoplasto, que formado por componentes do fuso de diviso e por
vesculas oriundas do complexo de Golgi. A fuso destas vesculas determina a formao da
placa celular, que separa as clulas filhas, com a liberao de seu contedo para a formao
da matriz pctica.

Cromossomos mitticos metafsicos

Do incio da mitose, os cromossomos se condensam e se tornam visveis


individualmente. Como resultado da replicao ocorrida durante a fase S do ciclo celular, os
cromossomos apresentam-se constitudos por duas molculas dupla fita de DNA, associadas
uma a outra, denominadas cromtides irms.
Os cromossomos apresentam um estrangulamento, constrio primria ou regio
centromrica, cuja posio possibilita sua identificao. Um cromossomo dito metacntrico
quando tem centrmero mediano que o divide em dois braos iguais. submetacntrico
quando tem centrmero submediano, que o divide em dois braos desiguais e acrocntrico
quando tem centrmero subterminal. O cromossomo telocntrico tem o centrmero na
posio terminal, confundindo-se com sua extremidade.
A fase mais adequada para o estudo dos cromossomos a metfase, quando estes
atingem o mximo de sua condensao e podem portanto serem vistos de forma
individualizada.
Cada uma das espcies animais e vegetais apresenta nmero cromossmico que lhe
constante. Denomina-se caritipo ao conjunto de caractersticas (nmero, tamanho,
morfologia) dos cromossomos de uma espcie. O estudo do caritipo dentre outras aplicaes
importante em estudos evolutivos, identificao de espcies, entre outros modelos de
anlises.
Na obteno de cromossomos metafsicos, para anlise de caritipos, so utilizados
agentes fsicos e qumicos que atuam como inibidores da diviso celular. Entre eles a
colchicina um dos mais utilizados, trata-se de um alcalide extrado da planta asitica do
gnero Colchicum. Quando adicionada s clulas em diviso, a colchicina impede a formao
do fuso, impossibilitando a separao e a migrao das cromtide e interrompendo, portanto,
o processo de diviso.

60
Atividade 10

Objetivos:
1. Caracterizar as fases da mitose em raiz de cebola;
2. Identificar os diferentes tipos de cromossomos metafsicos;

1 Mitose em raiz de cebola atravs da tcnica de esmagamento.


Material: A durao do ciclo celular em clulas de meristema de ponta de raiz de
cebola (Aliun cepa) temperatura de 20C a seguinte: intrfase 16 horas
aproximadamente; mitose 2 horas aproximadamente (prfase 60 min; metfase 18
min; anfase 12 min; telfase 42 min). Clulas somticas de cebola apresentam 2n =
16 cromossomos.
Procedimento: Transferir as pontas de raiz de cebola para uma soluo de HCl 5N a
60 graus, durante 20 min. lavar com gua destilada por 10 min. Coras as razes com
orcena actica 2% durante 15 a 20 minutos. Cortar o meristema apical da raiz e
transferi-lo para uma pequena gota de acido actico 45% depositada em uma lmina
bem limpa. Cobrir o material com uma lamnula e colocar a preparao entre papel de
filtro. Bater levemente com a extremidade de uma caneta ou lpis. Retirar o papel de
filtro e observar na objetiva de 40x.

a) Observe ao microscpio as diferentes etapas da diviso mittica e faa desenhos e


esquemas evidenciando a organizao dos cromossomos no citoplasma.

Prfase: Metfase: Anfase:

Telfase: Citocinese: Intrfase

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b) Em que fase do ciclo celular ocorre a replicao do DNA?
________________________________________________________________

c) Como na prtica possvel diferenciar a interfase da prfase?


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________________________________________________________________

d) Como na prtica possvel diferenciar a metfase da anfase?


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________________________________________________________________

e) Por que se diz que a mitose um processo conservativo, sob o ponto de vista
gentico?
________________________________________________________________
________________________________________________________________

Considerando que uma clula diplide em G1 apresenta nmero cromossmico = 2x,


contedo de DNA = 2C e 1 cromtide por cromossomo, de o nmero de cromtides
por cromossomo, o contedo de DNA e o nmero de cromossomos das clulas nas
seguintes fases do ciclo celular:

NO de cromtides por Contedo de DNA NO de cromossomos


ETAPAS
cromossomo (C, 2C, OU 4C) (X, 2X)
G1
G2
Prfase
Metfase
Anfase
Telfase

f) O que o centrmero?
________________________________________________________________
________________________________________________________________

g) Classifique os cromossomos de acordo com a posio do centrmero.


________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

h) O que caritipo?
________________________________________________________________
________________________________________________________________

62
i) Qual a importncia do estudo do caritipo?
________________________________________________________________
_______________________________________________________________

j) Porque a melhor fase para o estudo do caritipo a metfase.


________________________________________________________________
________________________________________________________________

h) Porque se utiliza a colchicina no estudo do caritipo?


________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

63
11 Meiose
Movimentos dos cromossomos durante a meiose

A meiose um tipo especial de diviso celular, exclusiva dos indivduos que se


reproduzem de forma sexuada. Em organismos que se reproduzem assexuadamente a
diviso celular simples ou ocorre mitose. Em animais e vegetais, a reproduo realizada
por meio de gametas ou clulas sexuais geradas por meiose. Esses gametas se unem por um
processo denominado fecundao. A meiose permite que o nmero diplide (2n) de
cromossomos, caracterstico de uma espcie, seja reduzido a um nmero haplide (n) por
meio de duas divises sucessivas com uma nica fase de replicao do DNA. A produo de
clulas reprodutivas haplides essencial para restabelecer o nmero de cromossomos de
uma espcie.
A meiose tratada como um tipo especial de diviso por que: o nmero de
cromossomos reduzido metade; h recombinao gentica, ou seja, o intercmbio de
segmentos cromossmicos e os cromossomos homlogos paternos e maternos segregam-se
aleatoriamente.
semelhana da mitose, a meiose um processo contnuo, dividido em uma srie de
etapas apenas com propsito didtico. Estas etapas apresentam caractersticas prprias que
permitem seu reconhecimento e diferenciao.
A meiose compreende duas divises celulares. A meiose I se distingue da meiose II (e
da mitose) porque sua prfase muito longa e em seu transcurso os cromossomos homlogos
se pareiam e se recombinam para intercambiar material gentico.

As fases da Meiose

A Primeira diviso meitica:

Prfase I Comea quando a cromatina interfsica inicia a condensao. Durante a


prfase o envoltrio nuclear se mantm ntegro, os cromossomos se condensam
gradualmente, o nuclolo vai desorganizando e o fuso de diviso organiza-se no citoplasma. A
prfase I, uma fase longa e complexa e, por isso, foi subdividida em leptteno, zigteno,
paquteno, diplteno e diacinese:
A) Leptteno os cromossomos, j duplicados, aparecem como filamentos longos,
finos e individualizados, apresentando regies mais compactadas intercaladas com
outras ainda pouco condensadas, dando um aspecto granular ao filamento. Esses
grnulos so denominados crommeros.
B) Zigteno os cromossomos homlogos emparelham-se longitudinalmente, ponto
a ponto, ao longo de todo o seu comprimento (sinapse) e, entre eles, aparece
uma estrutura protica denominada complexo sinaptonmico (CS). Este
pareamento importante, pois vai permitir a ocorrncia do crossing-over, na fase

64
seguinte, alm de resultar na segregao dos homlogos, na anfase. Ao
microscpio de luz no possvel ver as quatro cromtides dos homlogos
emparelhadas, uma vez que esto intimamente associadas e pouco condensadas.
C) Paquteno os cromossomos encontram-se mais condensados e totalmente
emparelhados e o evento mais importante dessa fase a permuta ou crossing-
over, no qual cromtides homlogas trocam pedaos equivalentes, resultando em
uma nova combinao de genes dos pais.
D) Diplteno a separao dos cromossomos homlogos, iniciada no final do
paquteno, continua neste estgio, quando podem ser observados os quiasmas,
ponto nos quais cromtides de cromossomos homlogos se entrelaam. Os
quiasmas correspondem evidncia citolgica do crossing-over ocorrido na fase
anterior.
E) Diacinese os cromossomos homlogos, ainda unidos, continuam se condensando
e os quiasmas deslocam-se para as extremidades dos cromossomos, podendo
diminuir em nmero.

Prometfase I trmino da desorganizao do nuclolo. O envoltrio nuclear se


desorganiza e os microtbulos do fuso se ligam aos cromossomos conduzindo-os em direo
regio equatorial do fuso.
Metfase I a fase em que os cromossomos atingem o seu grau mximo de
condensao e ainda permanecem unidos em suas extremidades pelos quiasmas. Eles se
posicionam no plano equatorial da clula. Cada cromossomo homlogo encontra-se orientado,
por meio do fuso de diviso, para um dos plos. As duas cromtides de cada cromossomo
comportam-se como uma unidade funcional.
Anfase I ocorre a separao dos cromossomos homlogos (cada um com duas
cromtides), que migram para plos opostos, reduzindo metade o nmero de cromossomos
em cada clula formada. Os cromossomos homlogos se separam pelo tracionamento do fuso
meitico para plos opostos da clula. Esta segregao ocorre independente da sua origem
paterna ou materna (segregao independente dos cromossomos homlogos).
Telfase I os cromossomos descondensam, o envoltrio nuclear reconstitudo e
ocorre a citocinese. Essas duas clulas formadas ao final da meiose I so haplides (n),
embora ainda tenham a quantidade de DNA duplicada (2C), j que cada cromossomo do par
constitudo de duas cromtides (a duplicao ocorreu na fase S da interfase, tornando a
clula 4C).
Intercinese um perodo, em geral curto ou inexistente, entre as duas divises da
meiose. Neste perodo no ocorre duplicao do material gentico.

Portanto, ao final da primeira diviso, as clulas filhas possuem metade do nmero de


cromossomos da clula parental o que caracteriza uma diviso reducional.

65
Segunda diviso meitica

Prfase II Caracteriza-se pela condensao progressiva dos cromossomos,


desorganizao do envoltrio nuclear e do nuclolo e organizao de dois novos fusos.
Prometfase II Ocorre o trmino da desorganizao do nuclolo e a
desorganizao do envoltrio nuclear.
Metfase II Os cromossomos, com suas duas cromtides-irms ligadas pelo
cinetcoro s fibras de fusos opostos, alinham-se no plano equatorial da clula.
Anfase II Caracteriza-se pela separao das cromtides-irms e trao dos
cromossomos filhos para os plos opostos da clula.
Telfase II os cromossomos descondensam-se, organizam-se novos ncleos e o
nuclolo reaparece. Uma nova citocinese dar origem a quatro clulas haplides (n), que
ficaro tambm com a metade da quantidade de DNA (C) de uma clula diplide.

66
Atividade 11

Objetivos:
1. Preparar lminas a partir de anteras de Lrio (Lilium sp.) e identificar as diferentes
fases da meiose em clulas me do gro de plen
2. Relacionar o processo meitico com a reproduo sexuada.

1 Meiose em anteras de lrio (Lilium sp.).


Material: O Lrio apresenta 2n= 24 cromossomos. A meiose masculina ocorre nas
clulas-me do gro de plen das anteras imaturas presentes nas flores, sendo este
processo denominado de microsporognese. Nas anteras de uma determinada flor de
Lrio, a meiose sincronizada e, por isso, para se observar as diferentes fases da
diviso so necessrias selecionar anteras em diferentes estdios de desenvolvimento.
Observe, tambm, o nuclolo, o qual est presente e bastante desenvolvido at o final
da prfase da primeira diviso meitica.
Obteno do material: O material dever ser colhido na fase de boto novo e fixado
em Carnoy por 12 a 24 horas, seguido de duas trocas de lcool 70%. Aps a ltima
troca, guardar no congelador ou no freezer.
Procedimento: Para se obter as diferentes fases da meiose: a) Retirar o material da
geladeira, deixando que alcance a temperatura ambiente; b) Separar botes florais em
diferentes estdios para se obter clulas em diferentes fases da meiose e, com o auxlio
de uma lupa e estiletes, retirar suas anteras. Este procedimento dever ser feito com o
material mergulhado em lcool 70%; c) Transferir as anteras para uma lmina limpa.
Colocar sobre as anteras 1 ou 2 gotas de carmin actico; d) Cortar as anteras e
esmag-las levemente com um estilete para que as clulas se soltem; e) Cobrir com
uma lamnula, retirar o excesso de corante com papel filtro e aquec-la levemente;
f) Esmagar fazendo presso com o polegar; g) Vedar a lamnula com o esmalte incolor,
esperar que este seque; h) Observar ao microscpio.

a) Examinar as diversas fases da meiose, procurando caracterizar cada uma delas.


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67
b) Desenhar as diferentes fases da meiose, destacando as alteraes celulares mais
relevantes.

c) Enumerar 5 diferenas existentes entre a mitose e a meiose.


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________________________________________________________________
________________________________________________________________

d) Por que a primeira diviso meitica chamada reducional e a segunda diviso


equacional?
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________________________________________________________________
________________________________________________________________

e) Por que a meiose um pr-requisito para a reproduo sexuada?


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________________________________________________________________

f) Analise as frases abaixo e identifique as que se referem mitose ou meiose:


1. Ocorre exclusivamente em clulas germinativas ________________________
2. Ocorre em clulas somticas ______________________________________
3. Pareamento dos cromossomos homlogos ____________________________
4. Troca de material gentico _________________________________________
5. Segregao de cromossomos homlogos _____________________________
6. Clulas filhas resultantes com n cromossomos __________________________
7. Clulas filhas resultantes com 2n cromossomos __________________________

68
g) Considerando uma clula diplide em G1 apresenta nmero de cromossomos 2n =
2x, contedo de DNA = 2C e 1 cromtide por cromossomo, d o nmero de
cromtides por cromossomo, o contedo de DNA e o nmero de cromossomos por
clula em G1, G2 e nas diferentes fases da meiose.

N de cromtides por Contedo de DNA N de cromossomos


Etapas
cromossomo (C, 2C ou 4C) (x ou 2x)
G1
G2
Prfase I
Metfase I
Anfase I
Telfase I
Prfase II
Metfase II
Anfase II
Telfase II

69
12 Microscopia Eletrnica
Princpios e Funcionamento do Microscpio Eletrnico

A Microscopia Eletrnica diferencia da Microscopia de Luz, dentre outras


caractersticas, na fonte que alimenta o sistema ptico para a gerao da imagem. Enquanto
na microscopia de luz a fonte de iluminao so lmpadas incandescentes, na microscopia
eletrnica a imagem gerada decorrente de uma fonte de eltrons. Como sabemos que o
limite de resoluo de um microscpio est intimamente relacionado ao comprimento de onda
da fonte de iluminao, o microscpio eletrnico proporciona menor limite de resoluo e
maior poder de resoluo do que o microscpio de luz.
Como foi visto at o momento o microscpio de luz nos permite observar estruturas
de no mnimo 200nm. No entanto as clulas possuem estruturas abaixo deste limite que s
puderam ser observadas a partir da dcada de 40 com o advento do primeiro microscpio
eletrnico. A introduo da microscopia eletrnica, portanto, trouxe contribuio marcante
para a Biologia Celular revelando a ultra-estrutura celular em toda sua exuberncia,
mostrando no s detalhes das organelas at ento conhecidas (membrana plasmtica,
ncleo, nuclolo, cromossomos, cloroplastos, mitocndrias, entre outras), como tambm
permitindo a descoberta de outros componentes celulares como retculo endoplasmtico,
ribossomos, filamentos do citoesqueleto, lisossomos, junes celulares, glicoclix, etc. Nesta
aula iremos estudar os princpios gerais das duas principais formas de Microscopia Eletrnica
existente, Microscopia Eletrnica de Transmisso e de Varredura, bem como as principais
diferenas existentes entre as Microscopias de Luz e Eletrnica, o procedimento bsico para
preparao de espcimes para Microscpio Eletrnico e a diferenciao de estruturas
celulares em micrografias eletrnicas.

Microscopia Eletrnica de Transmisso

O Microscpio Eletrnico de Transmisso (MET) foi o primeiro microscpio eletrnico


a ser construdo, na dcada de 30, sob liderana do pesquisador Ruska. As consideraes e
princpios da Microscopia de Luz (ML) so perfeitamente aplicveis MET salvo as
diferenas existentes entre eles.
O desenvolvimento do MET foi possvel a partir de demonstraes do comportamento
de ftons num sistema a vcuo seguido da possibilidade de conduo de eltrons atravs do
uso de lentes eletromagnticas. Logo, o funcionamento do MET est relacionado natureza
dos feixes de eltrons utilizados na formao da imagem. A fonte geradora de feixes de
eltrons fica localizada na parte superior do aparelho de forma que o aspecto global do MET
semelhante ao do ML, invertido e em propores maiores (figura 12.1).

70
Figura 12.1 Representao da estrutura de um MET.

O feixe de eltrons emitido por um filamento, ou por um emissor que age como
ctodo, situado no topo de uma coluna cilndrica com cerca de 2m de altura. Quando
submetida alta voltagem, a fonte de eltrons aquecida emitindo os eltrons que so
acelerados por meio de diferena de potencial eltrico. Dentro da coluna criado um sistema
de alto vcuo evitando a coliso entre eltrons e as molculas de ar e, consequentemente, a
disperso dos eltrons. Alm disso, um sistema de lentes eletromagnticas est disposto no
interior da coluna funcionando lente condensadora dos feixes, concentrando-os e
direcionando-os para o plano onde se localiza o material. A imagem ampliada do espcime
em observao gerada pelas lentes intermedirias que funcionam como uma lente objetiva;
posteriormente um terceiro conjunto de lentes eletromagnticas, denominadas projetoras,
atua como lentes oculares ampliando mais uma vez a imagem. Por fim, a imagem final
projetada em anteparo fluorescente, uma placa fotogrfica ou em um monitor.
A imagem gerada no MET depende na disperso diferencial de eltrons que, ao se
chocar com os ncleos dos tomos do espcime, se dispersam para fora da abertura das
lentes objetivas. A conseqncia da disperso a formao de uma imagem com pontos
eletrodensos e eletrolcidos. Os pontos eletrodensos so observados em funo de elementos
como ferro, smio, chumbo e ouro, enquanto pontos eletrolcidos so observados quando os
eltrons encontram elementos como hidrognio, carbono, nitrognio ou oxignio. Os materiais
biolgicos so ricos nesses ltimos elementos, portanto geram imagem eletrolcidas, sendo
necessrio contrastar o material com metais pesados, antes da sua observao no MET, a fim
de conseguir um bom contraste na imagem final observada.

71
Diante dessas informaes possvel montar um quadro comparativo abordando as
principais diferenas entre as microscopias ML e MET quanto aos aspectos de funcionamento
e formao da imagem como mostrado a seguir:

Microscopia Eletrnica
Aspectos Microscopia de luz
de Transmisso
Fonte Luz visvel Feixe de eltrons
Lentes Vidro Eletromagnticas
Limite de Resoluo 200 nm 0,2 nm
Formao da Imagem Absoro Eltron-opacidade

Uma comparao entre os sistemas de lentes de um ML e de um MET mostrada


na figura 12.2:

Microscopia Eletrnica de Varredura

Como vimos o MET empregado na anlise da estrutura interna da clula. As


informaes da ultra-estrutura celular so obtidas a partir de cortes ultrafinos de clulas ou
tecidos. A imagem bidimensional do material de estudo gerada atravs dos eltrons que
atravessam o objeto interagindo com seus componentes. Na Microscopia Eletrnica de
Varredura (MEV) os eltrons saltam superfcie do material revelando a topografia da

72
superfcie do mesmo com grande nitidez de detalhes. Logo, a MEV amplamente utilizada
para examinar superfcies de objetos quaisquer, seja biolgico ou no, fornecendo imagens
tridimensionais dos mesmos. Alm disso, MEV pode ser aplicado em estudos de objetos
grandes, inteiros, como vermes, insetos ou cabea de um animal; em clulas livres como gro
de plen, bactrias, vrus; em tecidos animais e vegetais; em fragmentos geolgicos para
estudos de granulometria e textura de solos, ou objetos inanimados como prego, fibras, etc..
A estrutura de um MEV bem diferente de um MET como pode ser observado na
figura 12.3:

Figura 12.3 Representao da estrutura de um MEV.

O MEV constitudo de um sistema de gerao de eltrons que est localizado na


parte superior do aparelho. Os eltrons gerados so acelerados atingindo o espcime. A
imagem tridimensional formada e observada decorrente de eltrons secundrios emitidos
pelo espcime, depois deste ser atingido por eltrons primrios, ou por eltrons que so
refletidos da superfcie da amostra. A formao da imagem , portanto, indireta. Os eltrons
secundrios ou refletidos so captados por um sistema de captao, coletados, e o sinal
emitido amplificado, gerando em uma tela de computador a topologia da superfcie do
espcime. O resultado da imagem depende da quantidade de eltrons coletado; quanto mais
eltrons coletados a partir do espcime, mais forte o sinal para o tubo e maior a intensidade
do raio na tela. As diferenas topolgicas observadas (fendas, elevaes, cavidades) so,
portanto, conseqncias dessas diferentes intensidades.
As imagens geradas no MEV podem chegar ampliao de 15 at 150.000 vezes.
Este poder de resoluo est relacionado com o dimetro dos raios de eltrons que incidem
na amostra de forma que alguns modelos mais recentes fornecem resoluo inferior a 5 nm.
O foco de profundidade de um MEV tambm considervel: 500 vezes o obtido com o
microscpio ptico utilizando a ampliao correspondente. Este fator contribui para uma
maior qualidade tridimensional das imagens geradas no MEV. Ao nvel celular o MEV permite
visualizar a superfcie externa da clula e todos os processos, extenses e matrias
extracelulares que interagem com o ambiente.

73
A MEV difere em vrios aspectos da MET apesar de em ambos os casos a imagem
ser formada a partir da interao de eltrons com lentes eletromagnticas. As principais
diferenas esto relacionadas com a formao da imagem, como pode ser observado na
figura 12.4.

Preparo de amostras para Microscopia Eletrnica

Assim como a ML a MET e MEV requerem que as amostras sejam preparadas


previamente e adequadamente antes da observao ao microscpio. Os procedimentos de
preparo de amostra para os dois tipos de ME esto relacionados com as caractersticas na
gerao da imagem de cada um. Por exemplo, a amostra a ser observada no MET deve ser
uma seo. A seguir iremos destacar as principais etapas do preparo de amostra para cada
um dos ME.

A) PREPARO DE AMOSTRAS PARA MET:

A preparao de amostras para o MET obedece a etapas semelhantes aquelas


estudas para a ML na aula 3 desta apostila sendo que algumas etapas so mais crticas. O

74
tecido ou material a ser analisado dever ser cortado de modo que tenha no mximo 1mm de
espessura, facilitando a etapa de fixao (o ideal so amostras com 1mm).
Aps a coleta o material deve ser imediatamente fixado. Esta etapa critica para a
MET, pois uma m fixao pode danificar organelas celulares e prejudicar as anlises. Os
fixadores que so utilizados na ME so os aldedos (gluteraldedo, para-formaldedo,
gliceraldedo, etc.) e o tetrxido de smio. comum realizar duas fixaes, a primeira com
uma combinao de aldedos (para-formaldedo e glutaraldedo), combinando a rapidez de
penetrao do formol nas clulas com a capacidade de preservao das protenas e estrutura
celular do gluteraldido; e a segunda com tetrxido de smio, este penetra na clula
lentamente, reage com os carboidratos e lipdeos preservando a membrana plasmtica. Alm
disso, o smio um metal pesado sendo capaz de dispersar os eltrons aumentando o
contraste da amostra na ocasio da observao no MEV.
Uma vez o material fixado deve-se realizar a desidratao no mesmo j que o
funcionamento do ME (vcuo, eltrons, etc) requer amostras sem umidade. A desidratao
realizada atravs de sries alcolicas ou acetnicas onde a gua das clulas e tecidos
lentamente substituda por um solvente.
Como a MET requer amostras extremamente finas o material deve ser incluso em
resinas para permitir os cortes ultrafinos sem danificar a amostra. As principais resinas
utilizadas neste processo so as plsticas, de epxi (Epon ou araladite) ou Spurr e as acrlicas
(LRWhite). Durante a incluso o liquido utilizado na desidratao substitudo pela resina, de
forma que a resina ocupe todos os espaos vazios da clula, proporcionando um corte
perfeito.
Aps o emblocamento na resina, realizado em formas de silicone ou suportes de
plstico, o material deve ser cortado em um ultra-micrtomo. As sees obtidas com a ultra-
microtomia so realizadas com lminas de vidro ou diamante de forma que sua espessura
no ultrapasse 100m. Os cortes obtidos so posteriormente coletados com telinhas de liga
metlica que fazem a funo da lmina na ML. Em geral as telinhas so confeccionadas com
cobre, ouro ou nquel e possuem 3 mm de dimetro.
Uma vez que a amostra est na telinha necessrio realizar a contrastao, etapa
que pode ser relaciona com a colorao na ML. A contrastao da amostra permite melhor
distino dos componentes celulares em funo da diferenciao de elementos eletrodensos e
eletrolcidos gerando grande riqueza de detalhes na imagem. Nesta etapa utiliza-se acetato
de uranila ou citrato de chumbo, metais pesados que se ligam as macromolculas fornecendo
densidade atmica necessria para dispersar os raios de eltrons.

B) PREPARO DE AMOSTRAS PARA MEV:

A preparao de amostras para o MEV um pouco mais simples que para MET j
que no necessrio fazer cortes no material. O material a ser fixado pode ter mais que
1mm de espessura recomendando-se no mximo 3 cm em funo da distncia de trabalho
do MEV. A fixao realizada semelhana do MET com uma fixao primria em aldedos
e secundria no tetrxido de smio. Neste caso o smio usado apenas para aumentar a
condutividade dos eltrons na superfcie das amostras.

75
Aps a fixao faz-se o processo de desidratao do material com sries de lcool ou
acetona. Posteriormente o material levado a um aparelho de ponto crtico onde todo o
solvente retirado, deixando o material totalmente seco, sem umidade, semelhante a uma
esponja. O material seco montado em suporte especial para o MEV denominado stub.
Segue a impregnao da superfcie do material com banho de ouro, facilitando a conduo de
eltrons e a amostra est pronta para ser visualizada no MEV.

O quadro abaixo apresenta uma comparao entre as MET e MEV quanto a


preparao das amostras.

Microscopia Eletrnica de
Microscopia Eletrnica de Varredura
Transmisso
Fixao com aldedo
Ps-fixao com tetrxido de smio
Desidratao em srie alcolica ou acetnica
Incluso do material em resinas Secagem especial em ponto crtico
Ultra-microtomia para obteno de cortes Banho de ouro na superfcie do material a
ultrafinos (< 100m de espessura) ser analisado
Contrastao com metal pesado Sem contrastao

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Atividade 12

1 Compare os microscpios de luz e eletrnico.

2 Quais as principais diferenas entre MET e MEV?

3 Descreva as etapas envolvidas na preparao de amostras no MET e no MEV.

4 Observe as fotomicrografias (A, B e C) e indique em que tipo de microscpio elas


foram obtidas.

5 Indique todas as estruturas celulares que voc conseguir diferenciar na


fotomicrografia D apresentada a seguir.
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(C)

(D)

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