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RESUMEN
El presente estudio evalu el efecto de la adicin de nutrientes (N y P) en forma de sales inorgnicas simples
(SIS) y un fertilizante inorgnico compuesto (FIC) en la biodegradacin de hidrocarburos totales de petrleo
(TPHs). Se emplearon mesocosmos con suelo contaminado (20,000 mgTPH/kgps) y se evalu un control
abitico y un control sin nutrientes (n=3). El estudio se realiz durante 125 das con 5 eventos de muestreo
(EM). Durante el estudio se evaluaron y compararon dos mtodos analticos para la cuantificacin de TPHs: el
mtodo D-5831 (ASTM, 1995) y el mtodo modificado de extraccin por agitacin mecnica y determinacin
gravimtrica (EAMG) (EPA, 1994; Schawab et l., 1999). Para monitorear la biorremediacin se evaluaron
parmetros fsico-qumicos: pH, porcentaje de humedad y nutrientes, y microbiolgicos: recuento en placa
de hetertrofos y degradadores de HCs por la tcnica del nmero ms probable (NMP-INT). Finalmente,
se realiz una caracterizacin bioqumica de los degradadores. Las mayores tasas de degradacin de TPHs se
observaron durante los primeros 28 das en SIS y FIC (278 y 235 mgTPHs/kgps/d, respectivamente) con
relacin a los controles (110 mgTPHs/kgps/d). El control abitico mostr que la biodegradacin intrnseca fue
el proceso predominante en la degradacin de TPHs durante el estudio. Aunque no hubo diferencias
significativas en las concentraciones de TPHs a travs del tiempo, entre los tratamientos y el control sin
nutrientes, las SIS mostraron un mayor porcentaje de degradacin (39% y 41% por los mtodos D-5831y
EAMG, respectivamente). El bajo nmero de degradadores (1x103 NMP/gps) y el bajo pH (4,1) alcanzado en
los tratamientos pudieron haber limitado mayores porcentajes de degradacin. Stenotrophomonas maltophilia
fue la especie predominante durante el estudio (34%).
ABSTRACT
The present study evaluated the effect of the nutrients addition (N and P) by using the amendment of
inorganic simple fertilizer (SIS) and inorganic compound fertilizers (FIC) in the biodegradation of total
hydrocarbon petroleum (TPH). Mesocosmos were used with contaminated soil (20,000 mgTPH/kgdw), abiotic
control and a control without nutrient (n=3) were used to evaluate the effect of nutrient amendment. The
study was conducted during 125 days with 5 sampling events (EM). During the study two analytical methods
for the determination of total petroleum hydrocarbons (TPHs): Method D-5831 (ASTM) and the modified
extraction by mechanical agitation and gravimetric determination method (EAMG) (EPA, 1994; Schawab et
al., 1999) were evaluated and compared. To monitor the bioremediation physic-chemical (pH, % moisture,
and nutrients) and microbiological (heterotrophic and hydrocarbon degrader microorganisms) parameters
were evaluated. The highest TPH degradation rates were observed during the first 28 days in the SIS and FIC
* Bacteriloga, M. Sc. Joven investigadora, Pontificia Universidad Javeriana, Bogot D. C. Correo electrnico:
vvallejo@javeriana.edu.co
** Estudiante de Microbiologa Industrial, Pontificia Universidad Javeriana. Correo electrnico:
lauraram@hotmail.com
*** Microbilogo, M. Sc., Ph. D. Profesor Asistente, Pontificia Universidad Javeriana. Coordinador de la Unidad de
Saneamiento y Biotecnologa Ambiental (USBA). Telfono: 3208320 ext: 4089. Correo electrnico:
fabio.roldan@javeriana.edu.co
Recibido: Octubre 20 de 2005 Aceptado: Noviembre 30 de 2005
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treatments (278 and 235 mgTPHs/kgdw/d, respectively) compared to the controls (110 mgTPHs/kgdw/d). The
abiotic control indicated that the intrinsic bioremediation was the main process during the TPH degradation.
Although, there was not significant differences between treatments and the control without nutrients, SIS
showed the highest TPH degradation (39% and 41% by D-5831 and EAMG methods, respectively). The low
pH (4,1) at the end of the study and the low degraders numbers (1x103 NMP/gdw) in the treatments could be
the limiting factors to achieve higher degradations rates. Stenotrophomonas maltophilia was the predominant
microorganism during the study (34%).
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EVALUACIN DE LA BIOESTIMULACIN EN LA BIODEGRADACIN DE TPHs EN SUELOS CONTAMINADOS
en la degradacin de TPHs en suelos contaminados contaminacin alguna con petrleo ni haba sido fer-
con petrleo. Se compar la adicin de SIS y FIC, tilizado. La capa vegetal fue removida por descapote
correlacionando factores fsico-qumicos y microbio- manual y el suelo se tom hasta una profundidad de
lgicos. Se cuantificaron, aislaron e identificaron bio- 20 cm. Para la caracterizacin inicial del suelo se
qumicamente los microorganismos degradadores realizaron anlisis fsico-qumicos en los laboratorios
de HCs. Para la evaluacin de TPHs se compar la del Instituto Geogrfico Agustn Codazzi (IGAC) (ta-
tcnica modificada de extraccin por agitacin me- bla 1).
cnica y determinacin gravimtrica (EAMG) (EPA,
1994; Schawab et l., 1999) y con el mtodo D-5831 Montaje de los mesocosmos
(ASTM, 1995). Este estudio permiti ampliar el cono-
cimiento sobre los diversos parmetros ambientales Se contaminaron 500 kg de suelo con 10 kg de cru-
que influyen durante los procesos de biorremedia- do (tipo Castilla: 12 API) para una concentracin
cin, y de la diversidad microbiana de degradadores final de 20,000 mgTPH/kgps. Con base en las con-
nativos y su potencial uso biotecnolgico en el trata- centraciones de N y P presentes en el suelo (tabla
miento de suelos contaminados con TPHs. 1) se realiz el balance y adicin de los nutrientes,
con el objetivo de ajustar la relacin final de C:N:P
MATERIALES Y MTODOS en la mezcla resultante. Se utiliz una relacin
100:10:1, reportada como eficiente en numerosos
El estudio se realiz en mesocosmos de polietile- estudios de biorremediacin (Margesin y Shinner,
no de alta densidad (60 cm x 40 cm x 35 cm), mate- 1997; vila, 1999; Margesin et l., 2000; Cleves y
rial seleccionado por su baja permeabilidad y Sandoval, 2001; Hamme et l., 2003). Para evaluar
mnima absorcin de TPHs (Margesin et l., 2000, el efecto de la adicin de FIC, se seleccion el fertili-
2003a). Durante el estudio se evalu la adicin de zante triple quince por su bajo costo, fcil adquisicin
SIS en forma de NH4NO3 (Mol-Labs) y K2HPO4 (JT y manejo. Adems, este fertilizante haba sido em-
Baker) y FIC de tipo N:P:K (15:15:15) (Fergon). pleado en diferentes estudios de biorremediacin
Los fertilizantes se adicionaron los das 0 y 63 del
estudio para generar un aporte equitativo de
nitrgeno y fsforo (Margesin y Schinner, 1997; Tabla 1. Caractersticas fsico-qumicas y granulomtricas
Cleves y Sandoval, 2001; Margesin et l., 2000, del suelo empleado en el estudio
2003a). Adicionalmente, se utiliz un control
abitico (Basamid, 70 g/m2) y un control sin adi-
Anlisis Resultados
cin de nutrientes. Todos los tratamientos y con-
troles se hicieron por triplicado (n=3). El estudio se
pH 5.5 0.1
realiz durante 125 das con 5 eventos de mues-
treo (EM) cada 25 das. Se tomaron 2 muestras
N - NO-3 (mg/kgps) 21.9 6.1
aleatorias por mesocosmo para un total de 6
muestras por tratamiento.
N - NH+3 (mg/kgps) 19.6 2.7
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Durante el estudio, se observ una reduccin signifi- Despus de la adicin inicial de nutrientes, las
cativa del pH en SIS y FIC: 4,1 0.1 y 4,2 0.2, res- concentraciones de nitratos en SIS y FIC fueron de
pectivamente (Scheff, p<0.05; n= 120) (figura 1). 404.0 18.8 y 62.7 2.8 mg N - NO -3 /kgps (n=6), res-
Esta disminucin de pH coincidi con el aumento en pectivamente (figura 2). Se observ un consumo sig-
la concentracin de nitratos en SIS. nificativo de nitrato en SIS inmediatamente despus
de la adicin de los tratamientos (das 0 y 63). Esto
pudo ser causado porque el nitrato presente en este
tipo de fertilizante es ms soluble que el nitrato pre-
sente en el FIC, y por esta razn es asimilado ms r-
pidamente por los microorganismos degradadores.
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% CV FR DR
Suelo
%P DR DR
Extraccin 0.06h 2h
Muestras/da 35 25
DR: dentro del rango recomendado por el mtodo. FR: fuera del rango recomendado por el mtodo.
LC: lmite de cuantificacin. LDM: lmite de deteccin del mtodo. %CV: porcentaje de coeficiente de
variacin. %P: porcentaje de recuperacin.
homogeneidad presente en la mezcla de suelo: pe- Despus del da 28 las tasas de degradacin
trleo, ocasionada por el gran contenido de arcilla fueron ms lentas, posiblemente por la disminucin
del suelo. En trminos generales, el mtodo EAMG del pH, que se present en los tratamientos con nu-
present una mejor precisin y exactitud que el trientes, lo cual pudo llegar a inhibir el crecimiento de
mtodo ASTM en las diferentes matrices de suelo los degradadores. Adicionalmente, la presencia de
que se analizaron. compuestos de alto peso molecular difciles de de-
gradar por parte de los microorganismos pudo redu-
Biodegradacin de TPHs cir las tasas de degradacin (Margesin y Schinner,
1997; Ercoli et l., 2001; Ritmman y Mc Carty, 2001).
La concentracin inicial de TPHs en el suelo fue de Estudios previos reportaron que la degradacin de
21,344 2,910 mg TPH/kgps. Al finalizar el estudio HCs disminuye con el tiempo, debido a que estos se
se observ una degradacin significativa de HCs en vuelven menos disponibles para la biodegradacin
los tratamientos con nutrientes y controles (Anova, por su carcter recalcitrante y su limitada biodisponi-
p<0.05; n=120) (figuras 3 y 4). Sin embargo, la ma- bilidad. Adems, se observ una tendencia decre-
yor degradacin de TPHs durante el estudio se evi- ciente de los recuentos microbianos antes del
denci durante los primeros 28 das. Las mayores agotamiento de los TPHs (Song y Bartha, 1990;
tasas de biodegradacin se presentaron en SIS y Margesin y Schinner, 1999).
FIC (278.2 3.7 y 234.4 5.6 mg TPH/kgps/d, res-
pectivamente), comparados con los controles A pesar de que no se observaron diferencias sig-
(116.5 32.1 mg TPH/kgps/d). De igual forma, en nificativas en las concentraciones finales de TPHs
este perodo se present un consumo marcado de (Anova, p<0.05; n=120) (figuras 3 y 4), la SIS y el FIC
nutrientes, especficamente nitrato y fsforo (figura presentaron los mayores porcentajes de remocin a lo
2), lo cual indica que la adicin de nutrientes esti- largo del estudio (40 y 34%, respectivamente), com-
mul la biodegradacin por parte de los microorga- parados con los controles sin nutrientes y abitico
nismos nativos. (30 y 13% respectivamente), lo que indica que la
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Estudios microbiolgicos
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al control sin nutrientes. Estos bajos recuentos de (1997) aislaron Pseudomonas sp. de un suelo
microorganismos se observaron en diferentes estu- antrtico contaminado con petrleo, y evaluaron su
dios de remediacin cuando las concentraciones capacidad para degradar alcanos, benceno, tolueno
de TPHs disminuyen con el tiempo o cuando algn y naftaleno. Rahman y colaboradores (2003) realiza-
factor limita el crecimiento (Margesin y Schinner, ron estudios con microorganismos degradadores de
1997a; Margesin y Schinner, 2001; Margesin et l., HCs, entre los cuales se encontraban: Pseudomo-
2003a, b). La reduccin de los recuentos de degra- nas sp., Acinetobacter sp., Strenophotomonas sp.,
dadores en SIS y FIC pudo estar relacionada con los Bacillus sp. Las Pseudomonas sp. han sido bastante
bajos valores de pH que se presentaron a partir del estudiadas y existen diferentes publicaciones por su
da 28, que inhibieron su crecimiento e hicieron ms capacidad para degradar HCs e hidrocarburos po-
lentas las tasas de degradacin de TPHs. Al inicio licclicos aromticos (PAH). Finalmente, C. viola-
del estudio el control abitico mostr altos recuen- ceum y F. orizihabitans se reportan como degrada-
tos de hetertrofos y degradadores; por esta razn doras de PAHs y clasificadas como especies del ge-
se aplic el producto nuevamente y se obtuvieron nero Pseudomonas sp. (Eriksson et l., 2003;
bajos recuentos a partir del da 63 (<102 UFC/gps) Hamme et l., 2003).
(figura 5).
Anlisis de correlaciones
Se identificaron 6 especies de microorganis-
mos degradadores de HCs: Stenotrophomonas mal- El anlisis de Pearson mostr una fuerte correlacin
tophilia, Acinetobacter iwoffii, Burkholderia cepacia, positiva entre el recuento de hetertrofos totales y
Pseudomonas putida, Chomobacterium violaceum, los degradadores de HCs (p<0.05), es decir que los
Flavimonas oryzihabitans, las cuales se reportaron recuentos de microorganismos degradadores de-
en estudios de biorremediacin (Macnaughton et l., penden de la densidad de hetertrofos presentes. La
1999; Rahman et l., 2002; Roling et l., 2002; Mar- correlacin de los parmetros microbiolgicos y el
gesin et l., 2003b). La especie predominante duran- pH indic que los recuentos microbianos se afecta-
te el estudio fue S. maltophilia (34%), que mostr su ron negativamente por los bajos valores de pH ob-
amplia diversidad y capacidad metablica para de- servados durante el estudio en los tratamientos.
gradar una variedad de HCs. Whyte y colaboradores Este factor pudo llegar a inhibir el crecimiento de la
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