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INFORME FINAL

PROYECTO CONAF 064/2011

CARACTERIZACIN DEL POTENCIAL SALUDABLE Y


AGROALIMENTARIO DE FRUTOS DE ESPECIES ARBREAS
NATIVAS DE LA ZONA CENTRO SUR DEL PAS

INSTITUCIN PATROCINANTE:
UNIVERSIDAD DE CONCEPCIN (UDEC)

INSTITUCIONES ASOCIADAS:
CENTRO REGIONAL DE ESTUDIOS EN ALIMENTOS SALUDABLES (CREAS)
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS (INIA)

OCTUBRE 2013
INTEGRANTES

DR. CARLOS FIGUEROA LAMAS


INVESTIGADOR RESPONSABLE
UDEC

DRA. DARCY RIOS LEAL


CO-INVESTIGADOR
UDEC

DRA. LIDA FUENTES VIVEROS


CO-INVESTIGADOR
INIA-CREAS

DRA. MNIKA VALDENEGRO ESPINOZA


CO-INVESTIGADOR
CREAS

DR. JUAN P. MARTINEZ CASTILLO


CO- INVESTIGADOR
INIA

DRA. WENDY FRANCO MELAZZINI


COLABORADOR
P.U. CATOLICA DE CHILE

DR. RAUL VINET HUERTA


COLABORADOR
U. VALPARAISO

SR. FELIPE SAEZ QUINTANA


TESISTA MAGISTER CS. FORESTALES
UDEC

SR. ANIBAL AYALA RASO


ASISTENTE TCNICO
INIA-CREAS

SRTA. KELLY PAREDES CID


ASISTENTE TCNICO
UDEC

SRTA. DANIELA FERNANDEZ SANCHEZ


MEMORISTA
UDEC

SR. RENE SANHUEZA REBOLLEDO


MEMORISTA
UDEC

SRTA. GABRIELA NARVAEZ GUEZ


ESTUDIANTE PREGRADO
UDEC

2
Tabla de contenido
I. FORMULACIN ........................................................................................................... 5
II. METODOLOGA.......................................................................................................... 7
1.1.- Ubicacin de las poblaciones y caracterizacin general de stas. Colecta de frutos (UDEC
y CREAS-INIA). ....................................................................................................................................................................... 7
1.2.- Propagacin vegetativa in vitro y en invernadero (UDEC). ................................................................ 7
1.2.1.- Cultivo in vitro de semillas de arrayn ................................................................................................. 10
1.2.2.- Propagacin in vitro de lleuque ............................................................................................................... 10
1.3.- Caracterizacin gentica de dos poblaciones de arrayn y peumo de la Regin del Biobo
(UDEC). .....................................................................................................................................................................................11
2.1.- Determinacin de parmetros agronmicos de madurez de los distintos estadios de
maduracin de los frutos (UDEC y CREAS-INIA) ...............................................................................................13
2.1.1.- Clasificacin de los estadios de maduracin de arrayn y peumo (CREAS-INIA).............. 13
2.1.2. Parmetros agronmicos de madurez evaluados en frutos de cada especie (UDEC y
CREAS-INIA). .................................................................................................................................................................... 13
2.2.- Determinacin de la tasa respiratoria y etileno (CREAS-INIA). ......................................................14
2.3.- Cuantificacin de polmeros de pared celular (UDEC). ........................................................................14
2.3.1.- Extraccin de residuos insolubles en alcohol. ..................................................................................... 14
2.3.2.- Cuantificacin de los componentes de la pared celular. ................................................................ 14
2.3.3.- Anlisis colorimtrico de las fracciones................................................................................................. 15
2.3.4.- Contenido de lignina. ...................................................................................................................................... 15
3.1.- Determinacin de la actividad antioxidante total en frutos en los tres estadios, hojas y
deshidratados (CREAS-INIA)........................................................................................................................................16
3.1.1.- Capacidad antioxidante expresada en equivalentes de Trolox (TEAC) .................................. 16
3.1.2.- Actividad antioxidante por el mtodo de DPPH................................................................................. 16
3.1.3.- Actividad antioxidante por el mtodo de FRAP ................................................................................. 16
3.1.4.- Anlisis estadstico........................................................................................................................................... 16
3.2.- Determinacin de compuestos bioactivos en frutos y hojas. ............................................................16
3.2.1.- Determinacin del contenido fenlico total......................................................................................... 17
3.2.2.- Determinacin de cido ascrbico (AA) en frutos ............................................................................ 17
3.2.3.- Determinacin de la actividad antimicrobiana en extractos de frutos y hojas de arrayn
................................................................................................................................................................................................. 17
3.2.4.- Determinacin de la bioactividad de extractos de arrayn y peumo ...................................... 18
3.2.5. Anlisis estadstico ............................................................................................................................................ 18
III. RESULTADOS .......................................................................................................... 20
1.1.- Ubicacin de las poblaciones y caracterizacin general de stas. Colecta de frutos. ...........20
1.1.1.- Caracterizacin general de las poblaciones. ....................................................................................... 22
1.1.2.- pocas de colecta de fruto para las especies ....................................................................................... 22
1.1.3.- Clasificacin de los estadios de maduracin de arrayan y peumo. ........................................... 23
1.2.- Propagacin vegetativa in vitro y en invernadero..................................................................................25
1.2.1.- Propagacin en invernadero. ..................................................................................................................... 25
1.2.2.- Respuestas a las condiciones de cultivo in vitro en peumo y arrayn. .................................... 25
1.2.3.- Cultivo in vitro de semillas de arrayn................................................................................................... 27
1.2.4.- Resultados del cultivo in vitro de lleuque. ........................................................................................... 28
1.2.5.- Propagacin in vitro de belloto del sur y naranjillo. ....................................................................... 29
1.3.- Caracterizacin gentica de dos poblaciones de arrayn y peumo de la Regin del Biobo.
......................................................................................................................................................................................................29

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2.1.- Determinacin de parmetros agronmicos de madurez de los distintos estadios de
maduracin de los frutos. ...............................................................................................................................................33
2.1.1.- Dimetro, peso y pH. ....................................................................................................................................... 33
2.1.2.- Firmeza. ................................................................................................................................................................ 35
2.1.3.- Contenido de slidos solubles (CSS). ........................................................................................................ 35
2.1.4.- Cambios en la pigmentacin de los frutos. ........................................................................................... 38
2.2.- Determinacin de la tasa respiratoria...........................................................................................................39
2.3.- Cuantificacin de polmeros de pared celular...........................................................................................40
2.3.1.- Cuantificacin de pared celular como Residuos Insolubles en Alcohol (AIR). ..................... 40
2.3.2.- Fraccionamiento de la pared celular. ..................................................................................................... 42
2.3.3.- Cambios en el contenido de lignina. ........................................................................................................ 45
3.1.- Determinacin de la actividad antioxidante total determinada en frutos, expresada segn
mtodo TEAC DPPH y FRAP. .........................................................................................................................................47
3.1.1.- Anlisis de correlacin ................................................................................................................................... 47
3.2.- Determinacin de compuestos bioactivos en frutos y hojas. ............................................................48
3.2.1.- Determinacin de cido ascrbico (AA) en frutos ............................................................................ 48
3.2.2.- Determinacin de la actividad antimicrobiana ................................................................................. 48
3.2.3.- Ensayos funcionales en aorta de rata. .................................................................................................... 52
4.- Divulgar hacia la comunidad los resultados y conclusiones obtenidos (ver anexo Difusin
por detalles). .........................................................................................................................................................................54
IV. PRINCIPALES CONCLUSIONES.................................................................................. 56
1.- AREA GENTICA ...........................................................................................................................................................56
2.- AREA PROPAGACIN .................................................................................................................................................56
3.- AREA CARACTERIZACION DE FRUTOS Y POTENCIAL ALIMENTARIO ...........................................56
4.- AREA POTENCIAL SALUDABLE Y FARMACOLGICO ...............................................................................57
V. RECOMENDACIONES ............................................................................................... 58
VI. BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................ 59

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I. FORMULACIN
Introduccin

Existen diversos recursos fitogenticos nativos an no investigados en profundidad los


cuales podran entregar grandes y muchos beneficios para el desarrollo y diversificacin de
actividades asociadas al fortalecimiento de Chile como potencia agroalimentaria y forestal. El
problema es que an existe desconocimiento sobre muchas propiedades que poseen las plantas y
rboles del bosque nativo chileno. Lo anterior, sumado a que los frutos poseen y acumulan una
variedad de componentes bioqumicos que tienen mltiples usos, ya sea para la salud humana si
es por consumo directo, o para la industria si es por la obtencin y purificacin de metabolitos de
inters; hace necesario una caracterizacin de los componentes asociados a la maduracin de
frutos nativos forjando una visin general de aquellas caractersticas.

Las especies seleccionadas para el estudio de sus frutos en el presente proyecto son
rboles nativos en los cuales la informacin referida a maduracin de stos es escasa, razn por la
cual este proyecto pretende entregar conocimientos slidos y bsicos referidos a este proceso
caracterizando cada especie de acuerdo a particularidades de la maduracin de cada fruto. El
primer grupo corresponde a especies en peligro de extincin o aquellas en las que los datos
colectados a la fecha son insuficientes y por ende los esfuerzos se centrarn principalmente en la
bsqueda de poblaciones: belloto del sur (Beilschmiedia berteroana); huillipatagua, naranjillo o
patagua (Citronella mucronata); y pitao (Pitavia punctata). El segundo grupo corresponde a
especies silviculturalmente mejor descritas, de uso en la medicina tradicional, pero de la cual se
tiene escaso conocimiento de los componentes bioactivos que poseen sus frutos: lleuque o uva de
la cordillera (Prumnopitys andina); peumo (Cryptocarya alba); y arrayn (Luma apiculata). Todas
estas especies poseen frutos del tipo berries o bayas, los cuales en otras especies, presentan
capacidades antioxidantes ms altas, en relacin a otras frutas y verduras. En general la mayora
de las especies nativas de Chile que han sido altamente estudiadas y con uso agroindustrial, como
lo son el boldo, la murta y el maqui, tienen una gran capacidad antioxidante, debido a su alto
contenido en molculas bioactivas como los polifenoles.

Hiptesis

Frutos de especies nativas arbreas presentan una promisoria fuente de salud dado su
elevado valor saludable, por ello el desarrollo de estrategias de manejo sustentable de estas
especies con potencial en la industria agroalimentaria contribuir a incrementar las alternativas
alimenticias. De esta manera, mediante el anlisis y caracterizacin de los principales atributos de
la maduracin de frutos de especies nativas se entregar una clasificacin y visin del potencial
que tienen para el consumo humano directo y/o para su uso como fuente de metabolitos de inters.

Objetivo general

Determinar los parmetros agronmicos de maduracin y propiedades saludables de frutos


de especies arbreas nativas colectados en la zona centro-sur de Chile con potencial uso en la
industria agroalimentaria.

Objetivos especficos

1.- Determinar la distribucin de las especies arbreas en estudio y poca de colecta de sus frutos.
Colecta de frutos para caracterizacin y de material vegetal para preservacin y propagacin ex
situ de cada una de las especies.

2.- Caracterizar los frutos desde poblaciones seleccionadas en tres estadios (verde, a la cosecha y
postcosecha) en relacin a sus parmetros agronmicos de maduracin en dos temporadas.

5
3.-Caracterizar componentes relacionados a propiedades saludables en frutos en tres estadios
(verde, a la cosecha y postcosecha) en dos temporadas.

4.- Divulgar hacia la comunidad los resultados y conclusiones obtenidos.

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II. METODOLOGA
Objetivo 1: Determinar la distribucin de las especies arbreas en estudio y poca de
colecta de sus frutos. Colecta de frutos para caracterizacin y de material vegetal para
preservacin y propagacin ex situ de cada una de las especies.

1.1.- Ubicacin de las poblaciones y caracterizacin general de stas. Colecta de


frutos (UDEC y CREAS-INIA).
Segn informacin obtenida en la Facultad de Ciencias Forestales de la Universidad de
Concepcin y en otras fuentes bibliogrficas, se procedi a seleccionar las localidades de la VIII
Regin y pocas en las que se realizaron los muestreos de los frutos para cada especie. Se
consideraron al menos dos localidades para cada especie delimitadas mediante tcnicas de
sistemas de informacin geogrfica (SIG). Posterior a esto, en terreno se procedi a prospectar a
orillas de camino y 25 metros hacia el interior del bosque con la finalidad de encontrar un mayor
nmero de individuos e identificar las especies acompaantes, tipo de suelo, cursos de agua
cercanos entre otras variables. Cada sector de colecta de muestras fue geo-referenciado en
coordenadas UTM.
Material vegetal y frutos en estadio verde (V), transicin (T) y maduro (M) fueron obtenidos
de diferentes sectores entre la Regin de Valparaso y la Araucana tanto en la Cordillera de la
Costa como en la de Los Andes. Los frutos fueron recolectados desde los rboles sin alterar su
estado e inmediatamente se procedi a su embalaje hermtico y transporte en fro al Laboratorio
de Cultivo de Tejidos Vegetales, Centro de Biotecnologa de la Universidad de Concepcin (LCTV)
y al Laboratorio del INIA-La Cruz. Los frutos fueron caracterizados y estandarizados de acuerdo a
su peso, forma, tamao color y firmeza para su posterior congelacin con nitrgeno liquido y
almacenamiento a -80 C.

1.2.- Propagacin vegetativa in vitro y en invernadero (UDEC).


a) Propagacin en invernadero:
Para pitao la colecta de las semillas se realiz entre los meses de abril y mayo del ao
2013, y fueron tomadas directamente desde el suelo de forma aleatoria. Estas luego fueron
lavadas, y almacenadas en bolsas de plstico hermticas, y se sometieron a tratamiento de
estratificacin en fro a 4C de temperatura durant e, a lo menos, un mes. Posterior a esto se
sembraron en sustrato compuesto de corteza de pino compostada, y regadas cuatro veces al da
en el invernadero de la Facultad de Ciencias Forestales de la Universidad de Concepcin.
Para lleuque, naranjillo, belloto del sur: Desde los sectores prospectados se procedi a
extraer plntulas que se encontraran en evidente estado de vulnerabilidad o bien que se
encontraran acumuladas y compitiendo entre ellas mismas para sobrevivir, para ser transportadas
al vivero de la Facultad de Ciencias Forestales de la Universidad de Concepcin, donde se regaron
4 veces al da y se observo su estado (necrosis, clorosis, patgenos presentes, muerte y
saludable).

b) Propagacin va cultivo de tejidos in vitro:


El material vegetal fue colectado al azar desde individuos de la Reserva Nacional Nongun
(Cordillera de la Costa), San Fabin de Alico (Cordillera de los Andes) y Concepcin, Regin del
Biobo. Se colectaron brotes de la temporada, seleccionados por su adecuada condicin de
sanidad, cercanos a la base del rbol y/o brotes epicrmicos si es que stos lo presentasen. Este
material fue procesado en el LCTV.
Para la esterilizacin superficial del material se cortaron trozos de menor longitud y se
lavaron con jabn antibacterial y un cepillo bajo agua potable. Posteriormente se dejaron por 24 h
-1 -1 -1
en una solucin de 2 g L de captan y 2 g L de benomilo (fungicidas), adems de 200 mg L de

7
sulfato de estreptomicina (antibitico). Transcurrido este periodo y bajo cmara de flujo laminar, se
enjuag con agua destilada estril (ADE). Para la asepsia de los brotes de peumo y arrayn se
utiliz etanol al 70% (v/v) durante 30 s, seguido de 2 enjuagues con ADE. Luego se introdujeron en
-1
una solucin de cloro comercial (5 g L ingrediente activo) al 50% (v/v) en el caso de peumo, y
30% (v/v) para arrayn, ms 0,5 ml de Tween 20 durante 15 min, finalizando con 3 enjuagues
consecutivos con ADE.
Luego se cortaron segmentos binodales para su introduccin in vitro en medio MS 25%, sin
reguladores del crecimiento vegetal, debido a la alta oxidacin observada en los explantes en
-1
ensayos previos, para su establecimiento. ste fue suplementado con 20 g L de sacarosa como
-1
fuente de carbono. Se adicionaron 1,5 g L de polivinilpirridona (PVP) como antioxidante de los
-1 -1
tejidos; 1ml L de PPM como biocida. El pH se ajust a 5.8 para luego adicionar 7 g L agar-agar.
En esta etapa se contabiliz el nmero de explantes contaminados por bacterias, hongos, aquellos
que se oxidaron y los que pasaran a la etapa siguiente.
Para la fase de multiplicacin de microtallos se utiliz el medio WPM, suplementado con lo
descrito anteriormente para el medio MS, ms 0,01 mg L-1 de IBA y 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 mg L-1 de
-1
BAP, incluyendo un tratamiento control. Para arrayn se agreg adems 0,05; 0,5 y 1 mg L de
cido giberlico 3, incluyendo un tratamiento control. Los explantos se sembraron en recipientes de
vidrio conteniendo 20 mL de medio de cultivo, e incubados en cmara de crecimiento a 25 1C,
55% de humedad relativa, bajo fotoperiodo de 16 horas de luz fra y una intensidad lumnica de 40
-2 -1
mol m s . En esta etapa se contabiliz el nmero de nuevos brotes obtenidos al finalizar el
ensayo.
Se probaron variados protocolos de asepsias del material vegetal de las especies en
estudio, para visualizar su reaccin, para definir el mejor protocolo, se sometieron a diferentes
medios de cultivo y concentraciones hormonales. Todas las especies, luego de colectado el
material, se lavaron con jabn antibacterial con ayuda de un cepillo, bajo agua potable. Posterior a
-1
ello se mantuvieron 24 h en una solucin de los fungicidas captan-benomilo (2 g L de cada uno).
En vista de que la contaminacin bacteriana persista durante el cultivo in vitro, se agreg a la
-1
solucin 200 mg L de sulfato de estreptomicina. En la Tabla 1 se detallan las condiciones de
asepsias para peumo, arrayn, naranjillo y belloto del sur, a segmentos binodales, y para lleuque
segmentos con mltiples yemas y los medios de cultivo utilizados.

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Tabla 1. Condiciones de limpieza de tejidos para la generacin de un protocolo de asepsias del material
vegetal en todas las especies en estudios indicando los medios de cultivo utilizados y observaciones
obtenidas en el comportamiento del material vegetal introducido a condiciones de cultivo in vitro.

Especie Asepsia Medio de Observaciones


cultivo
Cryptocarya Etanol 70% 30 s MS/4 sh Explantos reaccionando,
alba (Peumo) ADE 2 y 5 min 100 Menor contaminacin
Cloro 50% + Quix 12 min frascos
ADE 2, 5 y 10 min

Citronella Bul I: MSN Incubacin en oscuridad, menor oxidacin


mucronata Etanol 70% 30 s
(Naranjillo) ADE 2 y 5 min
Biocida 1 gota/10 mL 15
min
ADE 5, 10 y 15 min

Luma Etanol 70% 10 s MS/4 sh Incubacin en oscuridad y otros en fotoperiodo


apiculata ADE 2 y 5 min 100 16-8
(Arrayn) Cloro 30% + Quix 12 min frascos Reaccionando muy bien
ADE 2, 5 y 10 min

Etanol 70% 10 s WPM0 Prdida casi total por oxidacin, se bajo la


ADE 2 y 5 min cantidad de cloro en la siguiente asepsia
Cloro 30% + Quix 15 min
ADE 2, 5 y 10 min

Etanol 70% 10 s WPM0 Frascos pequeos, asepsia sin fungicida, brotes


ADE 2 y 5 min epicrmicos, ms verdes y tiernos, menor dao
Cloro 50% + Quix 15 min al final de la asepsia.
ADE 2, 5 y 10 min

32 frascos x2 semillas de arrayn,


29.08.13 27 fueron llevados a tratamientos
T0, T1 y T2
Prumnopitys Etanol 70% 30 s MSN Las yemas muestran desarrollo lento, sin
andina ADE 2 y 5 min alcanzar la elongacin. Algunas se oxidan
(Lleuque) Cloro 30% + Quix 12 min pasados muchos meses, lo que se observ en
ADE 2, 5, 10 y 15 min el material que estaba anteriormente.
Biocida 1 gota/10 mL 20
min

20min fungicida Varios Hay prdidas por contaminacin, no por


Etanol 70% 0s medios oxidacin, en los medios que contenan
Cloro 30% 15min WPM giberelinas, se observa desarrollo y elongacin
de yemas.
22.8.13 cambio T0 2, T1 2, T2 7, T3 1

Fungicida 24 horas, Medios 3 frascos con 2 explantes de cada tratamiento


Cloro al 30% 15 min y WPM con definitivo usado en arrayn. Se observa
enjuagues. GA3 contaminacin, pero hay elongacin

Beilschmiedia Etanol 70% 5 min MSN Oxidacin, hay explantos reaccionando.


berteroana ADE 2, 5, 10 y 15 min Buena respuesta
(Belloto del Cloro 50% + Quix 15 min Los subcultivos re realizaron en medio WPM.
Sur) ADE 5, 5 y 5 min

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Los medios de cultivo utilizados fueron los siguientes:
-1 -1 -1 -1 -1
MSN: MS + 30 g L sacarosa + 1 g L PVP + 0,5 g L BAP + 0,05 g L AIB + 0,116 g L Vitrofural
-1
+ 6 g L agar; pH=5.8
-1 -1 -1 -1 -1
MSB: MS/2 + 30 g L sacarosa + 1 g L PVP + 2 g L BAP + 0,2 g L AIB + 7 g L agar; pH=5.8

MS2: MS + 30 g L-1 sacarosa + 1 g L-1 PVP + 2 g L-1 BAP + 0,5 g L-1 AIB + 0,116 g L-1 Vitrofural + 6
-1
g L agar; pH=5.8

Debido a que el problema ms frecuente durante la introduccin de material in vitro fue la


alta tasa de oxidacin de los tejidos, se procedi a modificar los medios de cultivo para evitar este
fenmeno, disminuyendo la concentracin de sales, de sacarosa, de agar, aumentando la
concentracin de antioxidante y cambiando el tipo de reguladores del crecimiento empleados.
Los nuevos medios a utilizar fueron los siguientes:

MSN2: MS/2 + 20 g L-1 sacarosa + 1,5 g L-1 PVP + 0,5 g L-1 BAP + 0,05 g L-1 AIB + 1 ml L-1 PPM +
-1
7 g L agar; pH=5.8
-1 -1 -1 -1 -1
MSK: MS/2 + 20 g L sacarosa + 1,5 g L PVP + 0,5 g L KIN + 0,05 g L AIB + 1 ml L PPM + 7
-1
g L agar; pH=5.8
-1 -1 -1 -1 -1
WPM: WPM + 20 g L sacarosa + 1,5 g L PVP + 0,5 g L BAP + 0,05 g L AIB + 1 ml L PPM + 7
g L-1 agar; pH=5.8

1.2.1.- Cultivo in vitro de semillas de arrayn


Las semillas de arrayn fueron colectadas en el campus de la Universidad de Concepcin.
Se retiraron de forma manual desde los frutos, se lavaron, se elimin aquellas que presentaban
daos y se procedi a esterilizarlas en una solucin de etanol 70% (v/v) por 10 s, ADE 2 y 5 min,
cloro 50% (v/v) + Quix 15 min, y ADE 2, 5 y 10 min. Luego de la asepsia, se le retir la cubierta
seminal con ayuda de bistur y pinza, obteniendo 32 frascos conteniendo 2 semillas cada uno, en
-1 -1 -1 -1
medio WPM + 20 g L sacarosa + 1,5 g L PVP + 1 mL L PPM + 8 g L agar, pH=5.8, sin adicin
de reguladores del crecimiento vegetal.
Para la etapa de multiplicacin, se cort la raz de las microplntulas y se llevaron a los
siguientes tratamientos en el medio WPM descrito en la etapa de establecimiento:

T0: 0,1 IBA + 1 BAP + 0 GA4+7


T1: 0,1 IBA + 1 BAP + 0,5 GA4+7
T2: 0,1 IBA + 1 BAP + 1 GA4+7

Al final del ensayo de contabiliz el nmero de nuevos microtallos.

1.2.2.- Propagacin in vitro de lleuque


El material vegetal se colect en el mes de agosto desde San Fabin de Alico. Se cortaron
las hojas de los segmentos a utilizar y se lavaron con jabn antibacterial bajo agua potable. Se
mantuvo en fungicida (captan) por 24 horas. Luego de haber sido enjuagado, en cmara de flujo se
realiz inmersin en solucin de hipoclorito de sodio al 30% (v/v) por 15 min y enjuagues con ADE.
-1 -1 -1
Los segmentos de introdujeron en medio WPM + 20 g L sacarosa + 1,5 g L PVP + 1 mL L PPM
-1
+ 8 g L agar; pH=5.8, con las siguientes concentraciones hormonales:

10
T0: 0 AIB + 0 BAP + 0 GA3
T1: 0,01 AIB + 0,1 BAP + 0 GA3
T2: 0,01 AIB + 0,1 BAP + 0,05 GA3
T3: 0,01 AIB + 0,1 BAP + 0,5 GA3
T4: 0,01 AIB + 0,1 BAP + 1 GA3

1.3.- Caracterizacin gentica de dos poblaciones de arrayn y peumo de la


Regin del Biobo (UDEC).
El material de C. alba fue seleccionado al azar desde dos poblaciones distantes
geogrficamente: Reserva Nacional Nongun y San Fabin de Alico, representando tanto el sector
Cordillera de la Costa y precordillera de la Regin del Bio Bo, respectivamente.
En el presente estudio se analiz un total de 20 individuos de L. apiculata: 10 ubicados en
la comuna de San Fabin de Alico y 10 en la Reserva Nacional Nongun, comuna de Concepcin,
ambas pertenecientes a la Regin del Biobo. Las poblaciones estn ubicadas en reas
geogrficas diferentes. Para el anlisis gentico de ambas poblaciones se utilizaron hojas jvenes.
El ADN genmico de ambas especies fue aislado a partir de 20 mg de hoja liofilizada,
mediante DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN). Cualitativamente el ADN fue analizado por
electroforesis en gel de agarosa 1% (p/v) por 30 min a 75 V, con marcador de peso molecular
DNA-HindIII Digest (New England Biolabs, Inc.).
La tcnica de AFLP se realiz de acuerdo a lo descrito por Hasbn et al. (2012). La
digestin de ADN y ligacin de adaptadores se llev a cabo en un volumen total de 11 L
conteniendo 27,5 ng de muestra de ADN inicial.
En la amplificacin preselectiva se us 5 L de digestin/ligacin diluida (1:5) en 25 L de
reaccin total, la cual se llev a termociclador, finalizado el programa, se visualiz 10 L de
productos de PCR en gel de agarosa 1% (p/v) con marcador de peso 100 pb DNA Ladder (NEB),
esperndose bandas (en forma de smear) cercanas a los 500 pb.
Para la amplificacin selectiva en C. alba, se prob 12 combinaciones de partidores (Tabla
2). En la reaccin se utiliz 2,5 L de productos de preamplificacin (dilucin 1:10), en un volumen
total de 12,5 L, acabado el programa de termociclador, se visualiz 5 L de producto de PCR en
gel de agarosa 1% p/v con marcador de peso 100 pb DNA Ladder (NEB), esperndose bandas
bajo los 600 pb.

Tabla 2. Partidores utilizados en la etapa de amplificacin selectiva de AFLP en C. Alba

Eco (*) Mse


CC AA
GC CC
GG GA
TC CAG
ACA CAT
ACC CCG
ACG CTC
ACT CTG
CCG TAC
TCG
(*) Los partidores Eco se encuentran marcados con distintos fluorforos.

11
El descarte de combinaciones de partidores se efectu visualmente a partir de los geles de
agarosa, donde se obtuvo 6 combinaciones, las que fueron analizadas a travs de un secuenciador
de ADN capilar automtico ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Los datos
en bruto obtenidos en el secuenciador se visualizaron con el programa Genographer versin 2.1.4
para generar un perfil de AFLP representativo a travs de un gel virtual.
Para L. apiculata , a partir de un total de 25 combinaciones de partidores, se seleccionaron
15 (Tabla 3), para ser utilizados en anlisis posteriores.

Tabla 3. Partidores utilizados en la etapa de amplificacin selectiva de AFLP en L. apiculata

Eco Mse
CC* CC
TC* GA
ACA* CCA
ACG* CCG
ACT* CAT
ACC* CTC
CCG* CTG
*Los partidores Eco+2 y Eco+3 bases selectivas fueron marcados con un fluorforo.

12
Objetivo 2: Caracterizar los frutos desde poblaciones seleccionadas en tres estadios (verde,
a la cosecha y postcosecha) en relacin a sus parmetros agronmicos de maduracin en
dos temporadas

2.1.- Determinacin de parmetros agronmicos de madurez de los distintos


estadios de maduracin de los frutos (UDEC y CREAS-INIA)

2.1.1.- Clasificacin de los estadios de maduracin de arrayn y peumo (CREAS-INIA).

Para la caracterizacin agronmica y funcional se trabaj con las especies fuera de riesgo
y de amplia distribucin, arrayn y peumo. Las especies en estudio fueron clasificadas en funcin
de su estado de madurez y desarrollo; es as como para todas ellas se plantearon escalas basadas
en la evolucin del color y tamao de los frutos. Dicha clasificacin se aplic principalmente a estas
dos especies. En las restantes especies estudiadas se analizaron frutos en estado de plena
madurez, esto debido a la baja disponibilidad de material vegetal producto de la variacin
estacional. Las muestras analizadas en CREAS-INIA para peumo y arrayn se obtuvieron del
Parque Nacional Jardn Botnico (El Salto, El Olivar, Regin de Valparaso) y Antuco (Regin del
Bio-Bio), respectivamente.
Para la caracterizacin agronmica y funcional los frutos de arrayn fueron cosechadas a
partir de una poblacin ubicada en Antuco, Regin del Biobo, Chile (3722'35.01"S,
7129'21.20"W, 850 msnm). Se clasificaron en cuatro estadios segn el color y el tamao: La1,
baya verde, pequea y delgada; La2, baya verde con tonos prpura; La3, baya prpura
redondeada; La4, redondeado negro (Figs. 2 y 3). Los anlisis de calidad fueron realizados luego
de la cosecha y para los analticos la fruta se congel en nitrgeno lquido y se almacen a -80 C
hasta su uso.
Las muestras de peumo fueron colectadas en Jardn Botnico de Via del Mar
(330218.58 S; 712948.04 W; 77 msnm), sector El Salto-El Olivar, Regin de Valparaso. Los
frutos de peumo se clasificaron en tres estadios de desarrollo (verde, semi-maduro y maduro), de
este modo, los tres estadios se diferenciaron segn el color y el tamao en las categoras
siguientes: Ca1, rosado claro y pequeo; Ca2, rosado claro mediano; Ca3, rosado grande y ms
oscuro (Fig. 2). Los anlisis de calidad fueron realizados luego de la cosecha y para los analticos
la fruta se congel en nitrgeno lquido y se almacen a -80 C hasta su uso.

2.1.2. Parmetros agronmicos de madurez evaluados en frutos de cada especie (UDEC y


CREAS-INIA).
Peso fresco del fruto: el peso fresco y seco de los frutos de las muestras se determin
utilizando una balanza analtica (Denver Instrument Company AA-200) y una estufa (Tempra ZRD-
5055) para el secado del material vegetal a 80C durante 48 hrs de secado.
Tamao del fruto: El tamao del fruto fue determinado a travs de la medicin del dimetro
ecuatorial de estos utilizando un pie de metro (CALIPER profesional). Se consider un nmero de
30 mediciones por estadio de desarrollo de fruto por especie.
Color: El color superficial de los frutos fue determinado mediante la utilizacin de un
colormetro (Konica Minolta CR400, Tokio, Japn,) de acuerdo a los parmetros CIELAB de
variacin de luminosidad, variacin del verde a rojo y del amarillo a azul del espectro visible de
cada muestra, considerando un nmero de 50 frutos para cada estadio por especie.
Firmeza: La firmeza de los frutos se midi utilizando un detector de compresin (FirmTech
2, Bio Works Inc., EE.UU.), utilizando muestras de 10 frutos por repeticin de cada estadio y se
expres como Newtons (N) error estndar (SE).
Contenido de slidos solubles (CSS), acidez titulable (AT) y pH: Cinco gramos de tejido de
cada replica biolgica se homogeniz en agua y se ajust el volumen final a 5 mL. La mezcla se
filtr a travs de un filtro tipo miracloth y el jugo fue analizado para determinar el CSS (Gonzlez et

13
al., 2009). El CSS fue determinad a 20C utilizando un refractmetro manual (Atago Co. Japan) con
compensacin de temperatura y se expres como g/g de peso fresco (PF). La acidez (pH) y la AT
del jugo se determin por titulacin de una alcuota de 5 mL de jugo del fruto con NaOH 20 mM
determinando el punto de equilibrio y se expres como mEq del respectivo cido/g PF (Valdenegro
et al., 2012).

2.2.- Determinacin de la tasa respiratoria y etileno (CREAS-INIA).


Para la determinacin de la produccin de CO2 y la tasa respiratoria de cada especie
estudiada, se analizaron tres repeticiones de cada etapa de desarrollo del fruto de arrayn y
peumo, dicha muestra const de 20 g de frutos enteros, los que se introdujeron en cmaras
hermticas de metacrilato (400 ml) provistas de septums, siendo incubados a 20C durante 2 h. Al
final del perodo se procedi a muestrear el espacio libre de cabeza del recipiente. La tasa
respiratoria se determin con un detector de CO2 (MAP Headspace Gas Analyzer, Puente
-1 -1
Analizadores, EE.UU) y se expresaron como mg CO2 kg h .

2.3.- Cuantificacin de polmeros de pared celular (UDEC).


Se cuantificaron los polmeros de pared celular en frutos de las seis especies. Para
lleuque, arrayn y peumo de tomaron frutos de dos sectores de la Regin del Biobo: costa y
precordillera andina, y de tres estadios de desarrollo: verde (V), transicin (T) y maduro (M). Para
naranjillo, y pitao slo se obtuvo frutos verdes (V) y maduros (M); y para belloto del sur slo
maduro (M). Para estas tres especies se obtuvo material vegetal de algunas localidades
especficas debido a su escasa presencia y vulnerabilidad.

2.3.1.- Extraccin de residuos insolubles en alcohol.


El material de la pared celular fue extrado segn lo descrito por Vicente et al., (2007), con
algunas modificaciones. Se homogenizaron 10 g de tejido de cada estadio de los frutos de las
especies bajo estudio en Ultraturrax mezclndolos en 4 volmenes de etanol (40 mL de EtOH 95%
(v/v)) hervidos durante 45 min. Posterior a esto se filtr el material insoluble en Miracloth (Vicente
et al. 2007), Lavando el residuo con 15 mL etanol (caliente) por triplicado, nuevamente el residuo
se dej reposar en 15 mL cloroformo/metanol (1:1) y se filtr, lavando tres veces con
cloroformo/metanol, posterior a esto se dej reposar nuevamente en 15 mL acetona y se filtr,
lavando tres veces con el solvente utilizado anteriormente. Finalmente los Residuos Insolubles en
Alcohol (AIR, principalmente material de pared celular) se secaron a 37C por 2 das. Los
resultados se expresaron como gramos de AIR por 100 g de fruta fresca.

2.3.2.- Cuantificacin de los componentes de la pared celular.


Se determinaron los cambios en el contenido de polmeros de pared celular. Para ello se
hizo un fraccionamiento qumico de pared celular desde los tres estadios de fruto mediante
solubilizacin secuencial en agua, CDTA, Na2CO3, y KOH, segn lo descrito por Vicente et al.
(2007) con algunas modificaciones. Aproximadamente 100 mg de AIR se suspendieron en 15 mL
de agua y se agitaron a temperatura ambiente durante 12 h. La mezcla se centrifug a 6000 rpm
durante 20 min a 4C, el sobrenadante se filtr por fibra de vidrio (Whatman GF/C), lavando dos
veces con 15 mL de agua. Los lavados de filtrado y el agua se combinaron y se design como la
fraccin soluble en agua (WSF). El residuo se extrajo luego con 15 mL de trans-1,2-
diaminociclohexano-N,N,N,N-tetra actico cido (CDTA) 50 mM (pH 6.5) por agitacin de la mezcla
durante 12 h. La mezcla se centrifug nuevamente, filtrando una vez ms como se mencion
anteriormente, el sedimento restante se lav dos veces con 15 mL de solucin CDTA. El filtrado y

14
los lavados se reuni y se design como la fraccin soluble CDTA (CSF). El sedimento CDTA
insoluble se extrajo nuevamente con 15 mL de Na2CO3 50 mM que contuvo NaBH4 20 mM,
durante 1 h a 4C, con agitacin constante. El homo genizado se centrifug y filtr, lavando
nuevamente dos veces con 15 mL de solucin de Na2CO3. Esta fraccin se design como la
fraccin soluble en Na2CO3 (NSF). El sedimento restante se extrajo con 15 mL de KOH 4 M que
incorporaba NaBH4 1 mM, durante 1 h a 4C, con agit acin. La mezcla se centrifug y filtr una
vez ms, y el sedimento se lav dos veces con 15 ml de KOH, designando la fraccin soluble en
KOH como KSF. Tres extracciones independientes se realizaron a partir de cada repeticin,
obtenindose tres fracciones pcticas y una hemicelulsica. Luego, se midi la concentracin de
pectinas (como cidos urnicos) y azcares neutros en las fracciones de pared mediante test
colorimtrico.

2.3.3.- Anlisis colorimtrico de las fracciones.

Determinacin de cidos urnicos (AU): las concentraciones de cido urnico de todas las
fracciones pcticas se estimaron por el mtodo de m -hidroxifenil usando cido galacturnico (AG)
como estndar (Blumenkrantz y Asboe-Hansen, 1973). De cada fraccin pctica se extrajo un
volumen de 210 L la cual se hidroliz con 1250 L de una solucin consistente en Na2B4O7
0,0125 M en H2SO4 concentrado, la cual se incub 1 min en mezcla agua-hielo, para luego mezclar
por vrtex. La solucin se incub 10 min en agua hirviendo, y despus en bao agua-hielo.
Posteriormente, se agreg 20 L de 3-PhPOH 0,15% (p/v) en NaOH 0,5% (p/v), homogeneizando
en vrtex, y se determin la absorbancia de la mezcla a 520 nm en espectrofotmetro. Se realiz
una curva de calibracin utilizando una dilucin seriada a partir de AG 0,33 mM en cido
actico/acetato de sodio 50 mM, pH 5.5. Los contenidos de AG se expresaron en mg en base a
100 mg de AIR y a 100 mg de fruto fresco (Blumenkrantz y Asboe-Hansen, 1973; Yemm y Willis,
1954).
Determinacin de azcares neutros (AN): la concentracin de azcares neutros (AN) de
todas las fracciones de pared celular se estim por el mtodo de antrona usando glucosa como
estndar (D Amour et al., 1993). De cada fraccin se extrajo un volumen de 200 L la cual se
hidroliz con 2 mL de una solucin consistente en antrona (Sigma, USA) 0,05% (p/v) en H2SO4
(66% v/v), la cual se mezcl con vrtex. La solucin se incub 20 min en agua hirviendo y despus
1 min en bao agua-hielo. Luego, se dej por 15 min en oscuridad. Se determin la absorbancia de
la mezcla a 620 nm en espectrofotmetro. Se realiz una curva de calibracin utilizando una
dilucin seriada a partir de 0,16 mg/ml de glucosa 0,04% (p/v) en agua destilada. Los contenidos
de AG se expresaron en mg en base a 100 mg de AIR y a 100 mg de fruto fresco. El contenido de
AN de las fracciones pcticas fue calculado en base a la sustraccin del valor equivalente en
glucosa correspondiente al contenido de AG que presente cada fraccin.
Los resultados se calcularon utilizando una curva estndar de cido galacturnico (UA) o
de glucosa (AN). Las mediciones se realizaron por triplicado, y los resultados se expresaron como
microgramos de cido galacturnico/miligramo de AIR.

2.3.4.- Contenido de lignina.


Se homogeniz 250 mg de pared de fruto en 1,5 ml de buffer fosfato sdico (pH 7.2) y se
incub durante 30 min. Se lav por duplicado con etanol 80%. Se dej el pellet con 950 L de
NaOH 1M por 16 h a temperatura ambiente, luego se hidroliz con 950 L de HCl 1M. Se
realizaron lavados con H2O destilada. Se dej incubar el pellet a 80C por 3 h con 750 L H2O, 250
L 37% HCl (v/v) y 100 L cido tiogliclico. Se lav con H2O, y se agreg 1 ml NaOH 1M y se dej
por 16 h con agitacin. Se traspas el sobrenadante a otro tubo, y se dej 4 h a 4C con 200 L HCl
37% v/v. Luego se descart el sobrenadante y disolvi el pellet con NaOH 1M. Finalmente, se
midi la absorbancia a 280 nm.

15
Objetivo 3: Caracterizar componentes relacionados a propiedades saludables en frutos
en tres estadios (verde, a la cosecha y postcosecha) en dos temporadas

3.1.- Determinacin de la actividad antioxidante total en frutos en los tres


estadios, hojas y deshidratados (CREAS-INIA).
Para arrayn y peumo se determin la capacidad antioxidante total por varias
metodologas:

3.1.1.- Capacidad antioxidante expresada en equivalentes de Trolox (TEAC)


El ensayo de la capacidad antioxidante equivalente de Trolox estndar (TEAC) se utiliz
para determinar la actividad antioxidante total de las muestras de fruta (Van den Berg et al., 1999;
Valdenegro et al, 2012). Se registr la disminucin de la absorbancia a 734 nm para calcular el
valor de TEAC (Murcia et al., 2004). Los valores TEAC se expresaron como equivalentes de Trolox
por Kg de PF. Estos datos fueron contrastados con arndano.

3.1.2.- Actividad antioxidante por el mtodo de DPPH


La actividad captadora de radicales libres de los extractos de frutas se evalu por el DPPH
(2, 2-difenil-1-picrilhidracilo) ensayo utilizando un mtodo colorimtrico modificado propuesto por
Brand-Williams et al. (1995) determinando la absorbancia a 517 nm. La actividad de eliminacin del
radical DPPH se determin utilizando Trolox como estndar. Los resultados se expresaron como
mM de Trolox por gramo de peso fresco (PF).

3.1.3.- Actividad antioxidante por el mtodo de FRAP


Para cada estado de madurez de las especies en estudio, alimento se analizaron 3
muestras, se homogenizaron en un Warring Blendor y se adicion agua debidamente medida. Se
tom 1 gr de este homogenizado y se adicionaron 10 mL de metanol absoluto y se realiz la
extraccin durante una hora, bajo agitacin magntica. Posteriormente se centrifug a 12.000 x g y
en el sobrenadante se determin la capacidad antioxidante por duplicado de acuerdo al mtodo
FRAP (Ferric Reducing Activity Power), segn Benzie y Strain (1996), realizando la lectura
espectrofotomtrica a los 4 min despus de la adicin de los reactivos. Los resultados se expresan
como mM FeSO4 por gr de peso fresco.

3.1.4.- Anlisis estadstico


Los experimentos se llevaron a cabo utilizando un diseo completamente al azar con
cuatro repeticiones biolgica por estado. Todos los resultados se expresaron como promedios
ES. Los datos se analizaron mediante correlaciones o a travs de un anlisis ANOVA de una va
con el programa SPSS (v.14), y las diferencias se consideraron estadsticamente significativas a un
valor de (P 0,05). Tambin se realiz un anlisis de correlacin entre los datos de color (croma) y
el contenido de polifenoles y los datos de capacidad antioxidante (TEAC, DPPH y FRAP).

3.2.- Determinacin de compuestos bioactivos en frutos y hojas.


Se determin el contenido fenlico total y el de vitamina C (cido ascrbico) en muestras
de arrayn y peumo.

16
3.2.1.- Determinacin del contenido fenlico total
El contenido total de fenoles se determin utilizando el mtodo colorimtrico de Folin-
Ciocalteu midiendo la absorbancia a 760 nm propuesto por Singleton y Rossi (1965) y Galati et al.
(2003) en un espectrofotmetro UV/Vis (Perkin Elmer, Lambda 25, Beaconsfield, Bucks, UK). La
cuantificacin se realiz mediante una curva estndar de cido glico. El contenido total de
compuestos fenlicos se expres en miligramos de equivalentes de cido glico por cada 100 g de
peso hmedo (GA mg/100 g FW).

3.2.2.- Determinacin de cido ascrbico (AA) en frutos


El contenido de cido ascrbico (AA) en el supernadante se determin mediante HPLC de
acuerdo a la metodologa de Wimalasiri y Wills (1983) con modificaciones menores, de acuerdo a
Valdenegro et al. (2012).

3.2.3.- Determinacin de la actividad antimicrobiana en extractos de frutos y hojas de


arrayn
(Actividad en colaboracin con Dra. Wendy Franco, PU Catlica de Chile).

3.2.3.1.- Determinacin de contenido de agua y actividad de agua del material vegetal. El


contenido de humedad de frutos y hojas fue determinado por gravimetra luego de secado por
conveccin de acuerdo al mtodo AOAC 920.151 (AOAC International, 2011). La actividad de agua
de las muestras fue determinada mediante mediciones directas en equipo.

3.2.3.2.- Cultivos bacterianos. Se emplearon para el estudio dos cepas de Escherichia coli (E. coli
O157;H7, E. coli no toxignica), tres de Salmonella (S. enteritidis, S. typhimurium, S. newport), dos
de Listeria (L. monocytogenes, L. innocua) y tres de Staphylococcus aureus (S. aureus 25923, S.
aureus ST182-2001, S. aureus 433000 MRSA). Todas las bacterias fueron adquiridas del Instituto
de Salud Pblica (ISP, Chile).

3.2.3.3.- Preparacin de extractos de estudio. Hojas y frutos limpios fueron secados en horno a
una temperatura de 70C por 48 h. Las muestras secas fueron desmenuzadas a mano y
pulverizadas utilizando un procesador de alimentos. Diez gramos de las muestras pulverizadas
fueron mezcladas con 150 mL de metanol y sometidas a extraccin por 24 h a temperatura
ambiente. Despus de la extraccin cada muestra fue filtrada y rotaevaporada a 40C hasta
obtener un extracto libre de solvente. Los extractos fueron luego reconstituidos con metanol hasta
alcanzar una concentracin stock de 500 mg/mL. Los extractos reconstituidos fueron esterilizados
mediante filtracin y empleados para los anlisis posteriores.

3.2.3.4.- Determinacin de la capacidad antimicrobiana. La determinacin de la actividad


antimicrobiana de cada extracto se realiz mediante el mtodo de difusin de disco (Clinical
Laboratory Standards, 2011). En breve, cultivos bacterianos de cada cepa de estudio a una
concentracin de 8 log UFC/mL fueron esparcidos uniformemente sobre Agar Muller Hinton. Tres
discos de 6 mm impregnados con los extractos fueron colocados sobre las placas de cultivo
inoculadas. Discos de ampicilina y estreptomicina (10 g/disco, cada uno) y un disco en blanco
(impregnado en metanol) fueron empleados como controles positivos y negativo, respectivamente.
Las placas de cultivo fueron incubadas por 24 h a 37C. Despus de la incubacin se midieron los
halos de inhibicin formados alrededor de los discos, determinndose aquellos con dimetros
mayores o iguales 6 mm como positivos en actividad microbiana.

17
3.2.3.5.- Determinacin de la concentracin mnima de inhibicin (CMI). Aquellos extractos
que mostraron actividad microbiana fueron empleados para determinar la concentracin mnima de
inhibicin siguiendo la metodologa descrita por Hsu et al. (2010). En breve, los extractos fueron
diluidos hasta alcanzar rangos de dilucin 150 a 300 mg/mL. Discos impregnados con estas
concentraciones fueron depositados en tubos eppendorf con 500 L de Caldo Muller Hinton, a los
que se aadi 5 L de cultivo bacteriano (8 log UFC/mL). Los tubos fueron incubados a 37C por
18 h y observados para determinar turbidez. Luego se aadieron 0,2 mg/mL de p-
iodonitrotetrazolium. Los cultivos fueron incubados por otros 30 min y se reexaminaron: aquellos
cultivos de color rosa/violeta fueron tomados como cultivos con crecimiento microbiano, mientras
que los incoloros como cultivos inhibidos. La concentracin ms baja que permiti la inhibicin
microbiana se tom como concentracin mnima inhibitoria (CMI).

3.2.4.- Determinacin de la bioactividad de extractos de arrayn y peumo

(Actividad en colaboracin con Dr. Ral Vinet, Fac. Farmacia, U. de Valparaso).

3.2.4.1.- Preparacin de los anillos de aorta torcica de rata y de grabacin. Para los ensayos
de vasoproteccin se utilizaron tres extractos: (1) hoja de peumo (Peumo-H), (2) hoja de arrayn
(Arrayan-H) y (3) fruto de arrayn (Arrayan-F). Estas muestras son las mismas que se sometieron a
anlisis de compuestos con capacidad antioxidante que se detallan en el punto 3.1. Para cada
extracto se evalu su capacidad para proteger la relajacin dependiente de endotelio, de anillos de
aorta de rata pre-incubados con alta glucosa (HG, D-glucosa 25 mM).

3.2.4.2.- Preparacin de los anillos de aorta. Las ratas fueron sacrificadas por decapitacin y la
aorta torcica se retir cuidadosamente para ser instalada en una cmara de tejido, tal como se ha
descrito previamente (Vinet et al., 1991). La aorta fue disectada y los anillos se suspendieron entre
dos ganchos de acero inoxidable, y se colocaron al interior de cmaras de rganos de 30 mL que
contenan los tampones y atmosfera adecuada.

3.2.4.3. Ensayos del efecto protector de los extractos. Se determin la tensin isomtrica. El
primer anillo se incub en KHB (Control), el segundo se incub en KHB con alta glucosa (HG; D-
Glucosa 25 mM) y el tercer anillo se incub en tampn KHB con HG ms el extracto (0,1; 1; 10
mg/ml)). Todos los anillos se incubaron durante 3 h. Despus de este perodo, los anillos fueron
contrados con fenilefrina (0,1 M) y una vez que se consigui una contraccin estable, se
realizaron las curvas de concentracin-respuesta mediante adicin acumulativa de ACh. La
relajacin mxima (Emax) y concentracin que produce la mitad del efecto mximo (CE50),
expresada como pD2 (-log CE50), se determinaron mediante un ajuste no lineal para una
sigmoidea mediante la aplicacin GrapPad Prims versin 6. La relajacin desde el nivel base del
vaso pre-contrado hasta la lnea base, se consider como un 100% de relajacin.

3.2.5. Anlisis estadstico


Los experimentos desarrollados para la clasificacin en funcin de su estado de madurez,
calidad fsico-qumica y evaluacin de la capacidad antioxidante, se llevaron a cabo utilizando un
diseo completamente al azar con cuatro repeticiones biolgicas para cada estadio. Todos los
resultados se expresaron como promedio ES. Los datos se analizaron mediante correlaciones o
de anlisis de la varianza ANOVA de una va con el programa SPSS (v. 14), y las diferencias se
consideraron estadsticamente significativas a un valor de (P 0,05). Se tuvo en cuenta el factor de
maduracin para cada tipo de fruta evaluado, mientras que las pruebas de separacin de medias
se realizaron por la prueba de HSD, siendo significativas con valor de (P 0,05). Tambin se
realiz un anlisis de correlacin entre los datos de color (croma) y el contenido de polifenoles y los
datos de capacidad antioxidante (TEAC, DPPH y FRAP).
Para los anlisis de capacidad antimicrobiana los ensayos se realizaron por triplicado en
dos experiencias independientes. Los datos resultantes fueron evaluados mediante ANOVA (SAS

18
9.0, Cary, NC, USA) y la prueba de Duncan para la diferencia de medias (P 0,05).
Para los ensayos en aorta de rata, el anlisis estadstico se realiz mediante el software
GraphPad Prism versin 6 (GraphPad Prism, Inc, USA). Se utiliz un anlisis unidireccional de la
varianza (ANOVA) con la prueba de Newman-Keuls para comparacin mltiple o una prueba t
segn fuera ms apropiado. Todos los datos se expresan como el promedio E.S. Las diferencias
se consideraron estadsticamente significativas con un P < 0,05.

19
III. RESULTADOS
Objetivo 1: Determinar la distribucin de las especies arbreas en estudio y poca de
colecta de sus frutos. Colecta de frutos para caracterizacin y de material vegetal para
preservacin y propagacin ex situ de cada una de las especies.

1.1.- Ubicacin de las poblaciones y caracterizacin general de stas. Colecta de


frutos.
La caracterizacin poblacional se realiz en poblaciones localizadas en la Regin del
Biobo de las cuales se analiz frutos principalmente en relacin a pared celular, anlisis gentico,
y material para micropropagacin (UDEC).
Se prospectaron un total de 6 poblaciones localizadas en la Cordillera de la Costa y de los
Andes de la Regin del Biobo y Araucana. Tres poblaciones fueron prospectadas en la costa de
la Octava Regin en las cercanas el rio Biobo: Nongun (5916752 m E; 678863 m N) Hualpn
(5926231m E; 664075 m N) y Quebrada Honda (5936400 m E; 686900 m N). En dichos sectores
se pudieron encontrar frutos de L. apiculata, C. alba, C. mucronata y P. punctata. Otro punto de
presencia fue observado en la cordillera de la costa cercano a la comuna de Angol (5811120n E;
691298 m N) en dicho sector se logro prospectar y extraer frutos de P. andina. Cercano a la
comuna de Bulnes (5932966 m E; 745627 m N) se encuentra uno de los pocos remanentes de B.
berteroana sector que presenta un total de 7 individuos y comprende el lmite de la distribucin sur
de la especie, en dicho sector se recolectaron frutos y segmentos nodales para el estudio de la
maduracin y la propagacin in vitro de la especie. Finalmente en la Cordillera de los Andes se
logr identificar un punto de presencia para las especies L. apiculata, C. alba y P. andina en el
sector de San Fabin de Alico (5935690 m E; 830497 m N) donde se colect material vegetal
(frutas y segmentos nodales). Este sector fue seleccionado por sus caractersticas contrastantes
con la Cordillera de la Costa. La ubicacin para cada poblacin se puede apreciar en la Figura 1:

20
Figura 1. Distribucin de las especies prospectadas en el Proyecto 064/2011, ubicadas en la Regin del Biobo y
Araucana, utilizadas para la mayor parte de los anlisis (principalmente los realizados en la UDEC).

21
1.1.1.- Caracterizacin general de las poblaciones.
En la Tabla 4 se muestra una caracterizacin general de cada localidad en donde se
encontraban las especies, y desde donde se obtuvieron muestras para los diferentes anlisis y
propagacin.

Tabla 4. Caracterizacin general de las poblaciones colectadas en la VIII y IX regin, para las diferentes
especies objetivo, segn localidad.

LOCALIDAD
R. N. Nongun, San Fabian de Alico Angol Bulnes
Parque Pedro del
Rio Zaartu
Especies Arrayn, peumo, Arrayn, peumo, lleuque Lleuque Belloto del sur
naranjillo, pitao

Tipo de Estatal Propietario Particular Empresa Propietario


propietario forestal Particular

Matriz Bosque nativo Bosque nativo Plantacin Agrcola


forestal
Topografa Laderas, cimas de Valle Cima cerro Valle
cerros, pequeas
quebradas

Amenazas Extraccin ocasional Cambio uso del suelo Cambio uso del Cambio uso del
de madera y follaje plantacin forestal, suelo por suelo siembre
crianza de animales y plantacin de especies
creacin de centrales de forestal agrcolas y
paso frutcolas

Vegetacin Olivillo, arrayn Roble, Coihue, Hualo, Coihue, roble, N/A


acompaante lingue, roble, Cipres de la cordillera pino
canelo.

Proteccin Si No No No
SNASPE

Regeneracin Si Si Si Si
N/A=No Aplica

Adicionalmente, se ubicaron dos poblaciones para arrayan y peumo especficamente para


la caracterizacin de los estadios de madurez en funcin a sus parmetros agronmicos y su
evaluacin funcional que se realiz en CREAS-INIA. As, los frutos de arrayn fueron cosechados
a partir de una poblacin ubicada en Antuco, Regin del Biobo (3722'35.01"S, 7129'21.20"W,
850 msnm). Las muestras de peumo fueron colectadas en Jardn Botnico de Via del Mar
(330218.58 S; 712948.04 W; 77 msnm), sector El Salto-El Olivar, Regin de Valparaso.

1.1.2.- pocas de colecta de fruto para las especies

Dado el poco conocimiento de la especies objetivos, las pocas de colecta fueron definidas
segn lo descrito por Hechenleitner et al. 2005.

22
En la Tabla 5 se pueden apreciar las diferentes pocas de colecta de frutos determinadas
en el presente proyecto:

Tabla 5. Fechas de colecta de frutos para las diferentes especies estudiadas


en el presente proyecto.

Estadio
Especie Verde Transicin Maduro
Arrayn Febrero Marzo-Abril Mayo-Julio
Lleuque Diciembre-Enero Febrero Marzo
Peumo Febrero Marzo- Abril Mayo-Julio
Belloto del Sur Febrero NA Marzo
Pitao Febrero NA Marzo-abril
Naranjillo Enero NA Febrero-Marzo
NA= No Aplica

Las poblaciones de P. andina localizadas en las localidades de Angol y San Fabin de


Alico fueron muestreadas a fines de diciembre del 2012 y principios de enero del 2013. En dichas
campaas a terreno se logr colectar frutos en estadio inmaduro; el fruto en estado transicin se
colect durante el mes de febrero y finalmente durante el mes de marzo se logr colectar frutos en
su estado maduro. Cabe mencionar que a pesar de la disparidad de las fechas, algunos frutos
verdes se mantiene en las ramas de la especie, por lo cual es necesario seleccionar los frutos de
mayor tamao y que comienzan a cambiar de tonalidad.
Las poblaciones de L. apiculata y C. alba fueron muestreadas en las localidades de San
Fabin de Alico y Nongun. Inicialmente los frutos en estadio verde fueron muestreados en la
segunda visita a San Fabin durante el mes de febrero. Posteriormente, el estadio de transicin fue
colectado durante los meses de marzo y abril, y finalmente los frutos maduros fueron muestreados
durante los meses de mayo y julio. Los frutos de estas especies, se mantienen durante bastante
tiempo en sus respectivos rboles lo que permiti contar con una mayor cantidad de tiempo para
muestrear las poblaciones anteriormente mencionadas.
La poblacin de B. berteroana ubicada en la localidad de Bulnes fue muestreada durante
los meses de febrero y marzo, y se colectaron dos estadios, verde y maduro. La poblacin slo
presentaba 5 individuos de gran tamao, por lo que en la colecta de material se consider semillas
del suelo y extradas directamente de las ramas.
La poblacin de P. punctata, ubicada en la Reserva Nacional Nongun fue muestreada en
primera instancia durante el mes de febrero y posteriormente durante los meses de marzo y abril.
Se cont con la participacin de guardaparques, quienes facilitaron la extraccin de material
vegetal.
La poblacin de naranjillo fue seleccionada en el parque Pedro del Rio Zaartu. Este sector
corresponde a uno de los pocos sectores de donde se pueden obtener semillas de naranjillo en la
VIII Regin. Se realizaron dos visitas en el mes de enero y durante los meses de febrero y marzo.
El sector contaba con individuos adultos de ms de 10 metros de alto por lo que se procedi a
instalar una trampa de semillas. Las semillas capturadas en la trampa fueron colectadas y
transportadas a laboratorio.

1.1.3.- Clasificacin de los estadios de maduracin de arrayan y peumo.


Se caracteriz los diferentes estadios de maduracin de arrayn y peumo en base a
caractersticas externas como cambios en la coloracin de la piel y tamao del fruto (Fig. 2). Para
arrayn fueron 4 estadios para los cuales la forma del fruto sirvi tambin de criterio clasificatorio
como se detalla en la figura 3.

23
Figura 2. Clasificacin de frutos de arrayn y peumo de acuerdo a el estado de maduracin. Frutos de
arrayn: La1, fruto verde alargado; La2, fruto verde purpura; La3, fruto redondo purpura; La4, fruto maduro
fruto negro redondo. Frutos de peumo: Ca1, verde; Ca2, semi-maduro; Ca3, maduro.

Figura 3. Detalle de los estadios de maduracin clasificados en arrayn. (A) La1 fruto verde alargado; (B) La2
fruto verde purpura; (C) La3 fruto redondo purpura; (D) La4 fruto maduro fruto negro redondo.

24
1.2.- Propagacin vegetativa in vitro y en invernadero.

1.2.1.- Propagacin en invernadero.

La propagacin por semillas de P. punctata result exitosa, de un total de 50 semillas


sembradas, 32 lograron germinar sin problemas, esto corresponde a 72% de germinacin en el
sustrato utilizado. Semillas no germinadas presentaron pudricin de la semilla o raz, y presencia
de hongos.

Las plntulas de B. berteronana, C. mucronata y P. andina llevadas a vivero presentaron


diferentes sntomas (Fig. 4):

Belloto del Sur Naranjillo


15%

15% % saludable % saludable


24% 30%
% necrotico % necrotico
9%
% clorosis % clorosis

21% % patogenos 70% % patogenos


31%
%muerte %muerte

Lleuque
15%

% saludable
24% % necrotico
47%
% clorosis
% patogenos
25%
%muerte

Figura 4. Estado fitosanitario de belloto del sur, naranjillo y lleuque en plntulas llevadas a vivero.

1.2.2.- Respuestas a las condiciones de cultivo in vitro en peumo y arrayn.


Las respuestas obtenidas en relacin a los agentes contaminantes que se presentaron en
el establecimiento de los segmentos binodales de C. alba y L. apiculata, bajo las condiciones de
cultivo realizados se presentan en las figura 5:

25
80%
72.8%
70.0%
70%

60%

50%

40%

30%
19.6%
20% 17.0%

10% 6.0% 4.3% 7.0%


3.3%
0%
B H O E

Peumo Arrayn
Figura 5. Porcentaje de contaminacin de acuerdo a los agentes contaminantes durante la fase de
establecimiento del cultivo in vitro de peumo y arrayn. B: contaminacin por bacterias; H: contaminacin por
hongos; O:oxidacin de los explantes; E: explantes que pasan a la etapa siguiente.

En general se observ una baja contaminacin de los explantes debido a la asepsia


utilizada para arrayn y peumo (Tabla 1, Metodologa). Sin embargo, el grado de oxidacin de los
tejidos en el caso de peumo reviste importancia, ya que esto evita que la elongacin celular y por
ende el crecimiento del nuevo brote a diferencia de lo que sucede en arrayn, cuyo porcentaje de
oxidacin de los tejidos lleg a un 3%. Esto se encuentra directamente relacionado con la
lignificacin del segmento nodal y la poca del ao que se colect, es decir, durante la poca de
primavera.
En la etapa de multiplicacin, se observ que los segmentos de peumo respondieron en
todos los tratamientos ensayados, generndose mayoritariamente tejido calloso, pero el desarrollo
-1
de nuevos brotes es lento, siendo su mxima respuesta en medio WPM con 0,01 mg L de IBA y 1
-1
mg L BAP, tras 3 meses de cultivo. En cambio arrayn, se logra elongar y multiplicar en medio
-1 -1 -1
WPM suplementado con 0,01 mg L de IBA, 0,1 mg L BAP y 1 mg L de cido giberlico (Fig. 6
y 7).

A B C

Figura 6. Establecimiento de segmentos nodales y multiplicacin de microtallos en peumo. A) segmentos


nodales en condiciones de cultivo in vitro de peumo y arrayn; B) brotacin de yemas laterales en segmentos
nodales de peumo; C) microtallos de peumo, despus de 3 meses de cultivo en medio WPM suplementado
-1 -1
con 0,01 mg L de IBA y 1 mg L BAP

26
A B B

Figura 7. Segmentos nodales y desarrollo de yemas axilares en arrayn cultivados en medio WPM
-1 -1 -1
suplementado con 0,01 mg L de IBA, 0,1 mg L BAP y 1 mg L de cido giberlico. A) expresin de yemas
axilares; B) desarrollo de microtallo con callo basal; C) multiplicacin de brotes.

1.2.3.- Cultivo in vitro de semillas de arrayn


Establecimiento de semillas: La germinacin en condiciones de cultivo in vitro fue ptima sin
contaminacin cuyas plntulas pasaron a la etapa de multiplicacin (Fig. 8):

A B
D
C

Figura 8. Cultivo de semillas en condiciones aspticas in vitro. A) retiro cubierta seminal; B) larva al interior de
la semilla, responsable de daos en ella; C) microplntula en medio de establecimiento; D) plntulas aptas
para etapa de multiplicacin; E) arrayanes en medios de multiplicacin.

27
La germinacin de la semilla bajo condiciones de cultivo in vitro se produjo a los 7 das de cultivo
(Fig. 8C), desarrollndose microplantas a los 30 das de cultivo, perodo donde se comenz la fase de
multiplicacin y proliferacin del material para la produccin de microtallos aptos para su enraizamiento
(Fig.7E).
Para la etapa de multiplicacin, utilizando medio de cultivo WPM, el tratamiento que present una
mayor produccin de microtallos por explante cultivado fue T2 (0,1 IBA + 1 BAP + 1 GA4+7), con un promedio
de 3,5 microtallos por explante (Fig. 9).

5
4
3 T0

2 T1

1 T2

0
Total
Figura 9. Nmero de microtallos obtenidos en los diferentes tratamientos ensayados.
T0: 0,1 IBA + 1 BAP + 0 GA4+7; T1: 0,1 IBA + 1 BAP + 0,5 GA4+7; T2: 0,1 IBA + 1 BAP
+ 1 GA4+7.

1.2.4.- Resultados del cultivo in vitro de lleuque.


Gracias a la adicin de giberelinas al medio de cultivo, se observ una rpida respuesta de
las yemas axilares a los 25 das de cultivo. Sin embargo se present una alta contaminacin
fngica y bacteriana, atacando en 70% del total de explantes cultivados. Por otro lado, tambin se
evidenci presencia de oxidacin de los tejidos impidiendo el desarrollo de las yemas axilares (Fig.
10A). Pero cuando se logr el manejo de stos inconvenientes, se logr un desarrollo de la yema
vegetativa a los 35 das de cultivo (Fig. 10B).

A B

Figura 10. Aspecto de los segmentos nodales de lleuque despus de 35 das de cultivo. A) oxidacin de las
yemas; B) elongacin de yemas.

La presencia de giberelinas en el medio de cultivo provoc una elongacin de las yemas


vegetativas provocando su mayor efecto cuando se utiliz una concentracin de 0,05 mg L-1 (Fig.
11C).

28
A
B C

Figura 11. Respuesta de segmentos nodales de lleuque cultivados en medio WPM en diferentes tratamientos
-1 -
hormonales. A) ausencia de hormona; B) T1 (0,01 mgL AIB + 0,1 BAP mgL 1 + 0 GA3); C) T2 (0,01 AIB + 0,1
BAP + 0,05 GA3).

Los tratamientos T3 (0,01 AIB + 0,1 BAP + 0,5 GA3) y T4 (0,01 AIB + 0,1 BAP + 1 GA3),
presentaron el 100% de contaminacin fngica y bacteriana, por lo que no pudieron ser evaluados.

1.2.5.- Propagacin in vitro de belloto del sur y naranjillo.

No se logr el establecimiento del cultivo in vitro en ambas especies. El principal problema


estuvo dado en la gran carga de microorganismos que poseen los tejidos externos e internos en
ambas especies, producindose contaminacin agresiva de los cultivos y oxidacin de los tejidos,
impidiendo de esta manera la reaccin de las yemas axilares. Sin embargo se sigue trabajando en
ello, probando extraer material vegetativo en las diferentes pocas del ao, como tambin teniendo
la planta donante en condiciones de invernadero y con tratamientos anti fngicos y antibacterianos
superficiales, para bajar la carga de microorganismos desde la superficie de la planta.

1.3.- Caracterizacin gentica de dos poblaciones de arrayn y peumo de la


Regin del Biobo.
El ADN de C. alba obtenido posea la calidad y concentracin requeridas para el
procedimiento de AFLP. La integridad del ADN de las dos poblaciones, fue visualizada por
electroforesis en gel de agarosa, donde se observ una banda ntegra, sin presencia de
contaminacin (ARN) ni degradacin de ADN (Fig. 12).

Figura 12. Integridad de ADN de C. alba mediante electroforesis en gel de agarosa 1% p/v. : Marcador de
peso molecular (20 ng/L). S1 a S10 y N1 a N10 corresponden al ADN de 10 individuos, de la poblacin de
San Fabin de Alico y Reserva Nacional Nongun, respectivamente.

29
El ADN genmico de obtenido a partir de brotes de hojas de L. apiculala result ptimo, en
cuanto a calidad y concentracin, para ser utilizado en anlisis de AFLP. La integridad del ADN de
las dos poblaciones, fue visualizada por electroforesis en gel de agarosa, donde se observ una
banda ntegra, sin presencia de contaminacin ni degradacin de ADN (Fig. 13).

Figura 13. Integridad de ADN representativo para L. apiculata mediante electroforesis en gel de agarosa 1%,
10 min a 75 V. : marcador de peso (20 ng/ul). 1 a 10 corresponde a DNA genmico de 10 individuos de la
poblacin de Reserva Nongun (aproximadamente 100 pb). Se utiliz un control positivo de ARN.

Para el procedimiento de AFLP en C. alba, se obtuvo resultados satisfactorios, tanto para


la etapa de preamplificacin, donde se gener, de acuerdo a lo esperado, la migracin de
fragmentos (smear) menores a 500 pb, como para la etapa de amplificacin selectiva, donde se
consigui la correcta amplificacin de las diferentes combinaciones de partidores probadas, con
una alta reproducibilidad, observndose productos de PCR concentrados entre 100 y 700 pb, las
combinaciones 4, 6, 11 y 12 no generaron productos amplificados, por lo que fueron eliminadas
para la siguiente etapa de secuenciacin de ADN, al igual que la combinacin 7 que no fue
reproducible para las repeticiones de la poblacin de San Fabin (datos no mostrados, para
detalles ver anexo avances de memorias de titulo).

Los datos en bruto generados a partir de las combinaciones de partidores analizadas a


travs del secuenciador capilar automtico visualizas con el programa Genographer origin un
perfil de AFLP representativo para C. alba, permitiendo identificar los potenciales polimorfismos,
visualizndose como un patrn de bandeo en un gel virtual (Fig. 14).

30
Figura 14. Patrn de bandeo representativo gel virtual C. alba. Para cada combinacin de partidores, los
primeros cuatro carriles corresponden a la poblacin Reserva Nacional Nongun y los siguientes cuatro a la
poblacin San Fabin de Alico.

En el caso de L. apiculata , el nmero de individuos por poblacin no fue ptimo para la


realizacin de la prueba de seleccin de combinaciones. De las 19 combinaciones probadas, se
seleccion aquellas con amplificacin positiva, reproducibilidad, polimorfismo (en base a bandas
presentes o ausentes) y peso molecular del amplicn entre 100 y 500 pb (datos no mostrados,
para detalles ver anexo avances de memorias de titulo).

31
Figura 15. Patrn de bandeo representativo gel virtual. L. apiculata (carril 1-48). Los primeros 24 carriles
corresponden a la poblacin Reserva Nacional Nongun y los siguientes 24 a la poblacin San Fabin de
Alico.

32
Objetivo 2: Caracterizar los frutos desde poblaciones seleccionadas en tres estadios (verde,
a la cosecha y postcosecha) en relacin a sus parmetros agronmicos de maduracin en
dos temporadas

2.1.- Determinacin de parmetros agronmicos de madurez de los distintos


estadios de maduracin de los frutos.

2.1.1.- Dimetro, peso y pH.

A continuacin en la Tabla 6, se muestran los resultados obtenidos para todos los frutos en
estudio de la Regin del Biobo, respecto a su dimetro, peso y pH, segn localidad y estadio de
maduracin. La mayora de las especies muestran un aumento en el peso fresco. Arrayn present
un importante cambio en el dimetro y en el peso. Peumo tiene importantes bajas en el pH a
medida que madura en ambas localidades. El pH de lleuque es comparativamente ms bajo que
todas las especies. Este fruto presenta un importante crecimiento entre los estadios V y T en
ambas localidades. Pitao, belloto y naranjillo presentan pH de valores similares. Los frutos de
mayor peso son los de belloto.

33
Tabla 6. Valores de pH, dimetro (mm) y peso (g) durante la maduracin en frutos de arrayn, peumo, lleuque,
pitao, belloto del sur y naranjillo colectados en diversas localidades de la VIII y IX Regin. Letras diferentes, para
cada parmetro evaluado, indican diferencias significativas entre estadios en cada especie y localidad (P 0,05).

Localidad Estadio pH Dimetro (mm) Peso (g)


ARRAYAN
RN Nongun Verde 50,04 a 7,101,08 b 0.370,07 b
Transicin 5,20,05 a 8,081,43 b 0,470,15 ab
Maduro 5,550,053 a 10,871,25 a 0,680,11 a
Sn Fabin Verde 5,350,15 b 7,750,86 b 0.25 0.12 b
Transicin 5,550,06 b 8,211,51 b 0.550,19 ab
Maduro 60,045 a 10,121,13 a 0.50.03 a
PEUMO
RN Nongun Verde 6,200,01 a 9,880,89 a 0.850.08 b
Transicin 6,120,01 b 9,280.48 a 0.800.10 ab
Maduro 5,940,01 c 10,460,55 a 1.190.21 a
Sn Fabin Verde 6,210,01 a 10,940,66 a 0.980.09 a
Transicin 6,020.02 b 10,980.70 a 0.950.11 a
Maduro 5,950,02 c 10,600,47 a 1.100.10 a
LLEUQUE
Angol Verde 3,560,008 c 12,561,12 c 2,140,17 a
Transicin 3,60,019 b 17,341,00 b 2,50,58 a
Maduro 3,690,01 a 20,441,25 a 3,300,87 a
Sn Fabin Verde 3,330,01 c 13,901,11 b 2,390,07 b
Transicin 3,400,05 b 19,521,61 a 2,670,6 b
Maduro 4,450,03 a 19,880,89 a 3,980,99 a
PITAO
Quebrada Verde 6,560,13 a 21,431,5 a 4,950,61 a
Honda
Maduro 6,470,06 a 20,891,2 a 5,190.92 a
BELLOTO DEL
SUR
Bulnes Verde 6.990.014 a 22,961,29 b 8,740,38 a
Maduro 6,680.047 b 23,131,53 a 8,521,45 a
NARANJILLO
Hualpn Verde 6,290,30 a 11,760,93 b 2,310,44 a
Maduro 6,110,09 a 13,011,087 a 1,030.28 b

34
2.1.2.- Firmeza.
A continuacin se expone la evolucin de la firmeza y el color en frutos de peumo y arrayn
analizados en CREAS-INIA (Fig. 16).

Figura 16. Evolucin de la firmeza y color de peumo y arrayan durante la maduracin de sus frutos. Firmeza
(N) en frutos de arrayan y peumo en funcin del estadio de maduracin.

En ambas especies, la firmeza del fruto se redujo significativamente a travs del proceso
de maduracin. Peumo mostr una alta firmeza en el estado maduro (P<0.05). El color del fruto
durante el periodo de maduracin, en arrayan cambi de verde a negro, mientras que en peumo
desde verde a rosado oscuro (Fig. 16).

2.1.3.- Contenido de slidos solubles (CSS).


El CSS (Brix) muestra un aumento acorde al progreso de la madurez de los diferentes
frutos en L. apiculata, C. alba y P. andina recolectados en la Regin del Biobo (Fig. 17).

35
Figura 17. Evolucin de CSS (Brix) en L. apiculata, C. alba y P. andina en diferentes localidades de la
Regin del Biobo (C=costa; SF=San Fabin). El CSS se midi en Brix en funcin del estado de maduracin
de cada especie. Letras diferentes indican diferencias significativas entre estadios en cada localidad (P<0.05).

36
Figura 18. Evolucin de CSS (Brix) durante la maduracin de frutos de naranjillo, pitao y belloto del sur.
Letras diferentes indican diferencias significativas entre estadios (P<0.05).

37
2.1.4.- Cambios en la pigmentacin de los frutos.
Se detectaron cambios importantes en los principales parmetros del color entre los
estadios de maduracin de los frutos de las especies estudiadas (Tabla 7). En el caso del lleuque
de Angol las diferencias entre los estadios T y M no son tan notorias al comparar todos parmetros.

Tabla 7. Cambios en los diferentes parmetros del color durante la maduracin en frutos de arrayn, peumo,
lleuque, belloto, naranjillo y pitao. Colectados en la VIII y IX Regin.

Localidad Estado de L* a* b* Chroma h


madurez
ARRAYAN
RN Nongun Verde 50,8 7,4 (-)6,74,9 16,110,3 21,18,7 109,611,5
Transicin 31,6 14,9 10,24,9 5,93,46 12,44,5 32,420,6
Maduro 19,53,5 1,50,8 0,70,3 1,60,9 28,313,7
Sn Fabin Verde 50,27,5 (-)9,76,2 30,80,86 32,7 8,4 105,310,5
Transicin 42,917,2 4,73,7 4,56,3 7,96,0 38,527,40
Maduro 22,34,8 2,53,3 0,70,3 2,10,8 23,713,43
PEUMO
RN Nongun Verde 54,13,2 (-)22,61,6 34,62,6 36,02,0 122,77,4
Transicin 505,8 486,9 512,2 203,1 80,24,1
Maduro 5012,7 453.1 19,92.8 154,1 708.7
Sn Fabin Verde 56,11,6 (-)20,64,2 32,51,2 35,02,7 111,73,4
Transicin 523,2 445,2 564,2 222,8 752
Maduro 32,45,3 42,76,4 21,51,9 17,33,8 657,3
LLEUQUE
Angol Verde 53,54 (-)20,71,25 42,13,4 473,1 116,32,2
Transicin 51,14,6 (-)15,23,0 35,25,4 38,45,9 113,43,4
Maduro 52,52,8 (-)13,82,6 35,53,3 38,13,7 111,12,9
Sn Fabin Verde 51,14,24 (-)19,71 37,24,0 42,13,8 118,12,2
Transicin 47,04,3 (-)15,22,5 29,05,3 32,85,7 117,832,2
Maduro 46,03,2 (-)46,91,9 24,14,7 26,94,8 114,72,8
PITAO
Quebrada Verde 51,92,3 (-)181,5 31,62,4 36,42,7 119,81,5
Honda Maduro 61,23,7 (-)8,43,8 42,92,0 43,91,9 101,11
BELLOTO
DEL SUR
Bulnes Verde 48,94,1 (-)18,01,8 33,65,25 38,25,21 118,52,9
Maduro 45,35,2 (-)15,32,8 34,35,3 37,75,07 114,35,0
NARANJILLO
Hualpn Verde 52,13,6 (-)17,61,6 33,62,6 38,02,7 117,72,4
Maduro 21,81,4 1,50,74 1,50,7 2,370.86 47,3415,35

38
2.2.- Determinacin de la tasa respiratoria.
A continuacin se expone la evolucin de la tasa respiratoria en ambas especies en las
que fue posible la determinacin: peumo y arrayan (Fig. 19). En relacin a las restantes especies,
dado su no disponibilidad no fue posible hacer la evaluacin.

Figura 19. Tasa respiratoria de frutos de arrayan en funcin del estado de madurez. Los datos corresponden
a las medias ES. Se consideraron 3 repeticiones de 50 frutos de cada estado, para cada especie.

39
2.3.- Cuantificacin de polmeros de pared celular.

2.3.1.- Cuantificacin de pared celular como Residuos Insolubles en Alcohol (AIR).

El contenido de pared celular disminuy en belloto del sur y pitao a travs de la


maduracin, no as en naranjillo (Fig. 20):

Figura 20. Evolucin de la concentracin de residuos solubles en alcohol (mg de AIR por peso fresco de fruto)
a travs de la maduracin de frutos de belloto del sur, pitao y naranjillo. Las letras indican diferencias
significativas entre estadios en cada especie (P<0.05).

40
En el caso de lleuque y arrayn se produjo una disminucin en el contenido de pared
celular entre los estadios de T y M en la localidad de San Fabin, mientras que para Angol y
Concepcin esta disminucin se produjo entre los estadios verde y transicin, respectivamente
(Fig. 21). Para el caso de peumo, no hubo variaciones en el contenido de pared celular a travs de
la maduracin y entre localidades.

Figura 21 Evolucin de la concentracin de residuos solubles en alcohol (mg de AIR por peso fresco de fruto)
a travs de la maduracin de frutos de lleuque, arrayan y peumo en dos localidades. Localidades: SF=San
Fabian; C=Concepcin (RN Nonguen); A= Angol. Las letras indican diferencias significativas entre estadios de
cada localidad (P<0.05).

41
2.3.2.- Fraccionamiento de la pared celular.
2.3.2.1.- Cuantificacin de la fraccin soluble en agua (WSF):

Se cuantific la WSF de lleuque y arrayn durante la maduracin en dos localidades (Fig.


22). Se observ en todos los casos un aumento de esta fraccin a medida que avanza la
maduracin.

-1
Figura 22. Evolucin de la concentracin de cidos urnicos (AU, como ug mg AIR) en la fraccin WSF en
diferentes localidades y estadios de lleuque y arrayn (V, T y M). Las letras indican diferencias significativas
entre estadios de cada localidad (P < 0.05). Localidades: Angol, San Fabin y Concepcin (RN Nongun).

42
2.3.2.2.- Cuantificacin de la fraccin soluble en CDTA (CSF):

En relacin a la CSF de lleuque y arrayn durante la maduracin en dos localidades (Fig.


23), se apreci en todos los casos un aumento de esta fraccin a medida que avanza la
maduracin, a excepcin de lleuque en Angol donde se observa una disminucin entre los estadios
V y T.

-1
Figura 23. Evolucin de la concentracin de cidos urnicos (AU, como ug mg AIR) en la fraccin CSF en
diferentes localidades y estadios de lleuque y arrayn (V, T y M). Las letras indican diferencias significativas
entre estadios de cada localidad (P < 0.05). Localidades: Angol, San Fabin y Concepcin (RN Nongun).

43
2.3.2.3.- Cuantificacin de la fraccin soluble en Na2CO3 (NSF):

La NSF de lleuque y arrayn disminuye a entre los estadios T y M en San Fabin para
ambas especies y en Concepcin slo para arrayn (Fig. 24). Los frutos de lleuque provenientes
de Angol no experimentan una disminucin en la concentracin de NSF.

-1
Figura 24. Evolucin de la concentracin de cidos urnicos (AU, como ug mg AIR) en la fraccin NSF en
diferentes localidades y estadios de lleuque y arrayn (V, T y M). Las letras indican diferencias significativas
entre estadios de cada localidad (P < 0.05). Localidades: Angol, San Fabin y Concepcin (RN Nongun).

44
2.3.3.- Cambios en el contenido de lignina.
En el caso del belloto del sur, se observ un aumento significativo en la concentracin de
lignina durante el proceso de maduracin (Fig. 25). En el caso de pitao y naranjillo se observ una
disminucin significativa en la concentracin de lignina durante el proceso de maduracin (Figs. 26
y 27, respectivamente).

Figura 25. La concentracin de lignina en Belloto del sur (ug/gPF) fue cuantificada en funcin del estado de
maduracin de la especie. Letras diferentes indican diferencias significativas entre estadios de la localidad
(P<0.05).

Figura 26. La concentracin de lignina en pitao (ug/gPF) fue cuantificada en funcin del estado de
maduracin de la especie. Letras diferentes indican diferencias significativas entre estadios de la localidad
(P<0.05).

Figura 27. La concentracin de lignina en naranjillo (ug/gPF) fue cuantificada en funcin del estado de
maduracin de la especie. Letras diferentes indican diferencias significativas entre estadios de la localidad
(P<0.05).

45
En el caso de lleuque, arrayn y peumo se observ una disminucin significativa en la concentracin
de lignina durante el proceso de maduracin (Fig. 28).

Figura 28. Evolucin de la concentracin de lignina (ug/gPF) en lleuque, arrayn y peumo a travs de la
maduracin en diferentes localidades (A=Angol; C=Concepcin (RN Nongun); SF=San Fabin). Letras
diferentes indican diferencias significativas entre estadios de la localidad (P<0.05).

46
Objetivo 3: Caracterizar componentes relacionados a propiedades saludables en frutos en
tres estadios (verde, a la cosecha y postcosecha) en dos temporadas

3.1.- Determinacin de la actividad antioxidante total determinada en frutos,


expresada segn mtodo TEAC DPPH y FRAP.
A continuacin en la Tabla 8 se exponen las actividades antioxidantes de los frutos de
arrayan y peumo, en funcin de su estado de madurez y, contrastados con un fruto tipo Berry como
es el arndano fresco.

Tabla 8. Contenido de polifenoles totales (TPC) y actividad antioxidante por tcnicas analticas de FRAP,
TEAC y DPPH en frutos de arrayn y peumo, colectados en Antuco, VIII Regin y Parque Jardn Botnico, V
Regin, respectivamente. Letras iguales, para cada parmetro evaluado no difieren significativamente entre s
(p 0,05).

ARRAYN

Estado de TPC FRAP [mM TEAC DPPH


madurez [gGA/100g] FeSO4] [Eq.Trolox/100gFW] [M]

La1.Verde 41.962.46 c 22.190.64 a 10.101.25 b 12.341.46 d


La2. Semiverde 54.361.98 b 23.681.16 a 12.323.12 b 14.350.30 c
La3.Semimaduro 85.331.83 a 23.641.08 a 16.241.10 a 16.061.04 b
La4. Maduro 83.643.26 a 23.811.50 a 18.002.10 a 19.160.60 a
PEUMO
Verde 23.231.64 c 8,440.73 c 5.120.48 b 18.050.80 a
Semiverde 42.504.88 b 8,881.21 b 8.320.58 a 17.730.95 b
Maduro 51.692.43 a 9.850.38 a 9.461.12 a 14.380.48 b
ARANDANO FRESCO
Maduro 48.861.60 10.232.45 9.942.27 17.360.83

Se aprecia un incremento en el contenido de polifenoles totales que se correlaciona con su


actividad antioxidante en las tres tcnicas analticas efectuadas. Al comparar su riqueza en
antioxidantes en relacin a un fruto comercial como es arndano, cv. Brigitta, se aprecia que
arrayn muestra una riqueza superior en casi un 50%, mientras que peumo muestra resultados
muy cercanos a arndano. Al analizar su capacidad antioxidante se vuelve a reflejar que la primera
especie (arrayan) muestra la misma tendencia en mediciones de TEAC, y FRAP, mientras que
para peumo se aprecia que en el estado maduro sus valores son similares a los obtenidos por
arndano. Arrayn es un fruto que resalta por su riqueza en antioxidantes por sobre peumo. En
base a lo anterior y buscando la proyeccin tecnolgica es que para frutos de arrayn se efectu
un anlisis de correlacin entre las determinaciones de color del fruto y el contenido de polifenoles
totales y capacidad antioxidante, resultados que es exponen a continuacin.

3.1.1.- Anlisis de correlacin


A continuacin se muestran la tendencia de correlacin para arrayn. La correlacin de
color con respecto a polifenoles fue directamente proporcional con un valor del 79 %, indicando
que hay otros pigmentos que determinan el color adems de los polifenoles totales. La correlacin

47
de los polifenoles totales respecto a la capacidad antioxidante fue del 90 %, indicando que si bien
los polifenoles aportan a esta capacidad antioxidante habran otras molculas que pueden aportar
a esta capacidad (Fig. 29).

Figura 29. Anlisis de correlacin. (A) Correlacin entre el contenido de polifenoles totales y croma; (B)
correlacin entre en contenido de polifenoles totales y la capacidad antioxidante determinada por TEAC.

3.2.- Determinacin de compuestos bioactivos en frutos y hojas.

3.2.1.- Determinacin de cido ascrbico (AA) en frutos


Se puso a punto el mtodo de determinacin de vitamina C en frutos, no obstante, se
obtuvieron resultados confusos al respecto, por lo que se decidi no incluir dichos resultados
debido a su alta variabilidad. Se sugiere incrementar el nmero de rplicas por estado de madurez
para cada especie. Es importante destacar que esta actividad no estaba considerada dentro de la
planificacin inicial.

3.2.2.- Determinacin de la actividad antimicrobiana


Es importante destacar que esta actividad no estaba considerada dentro de la planificacin
inicial, junto con la caracterizacin funcional de los frutos evaluados, no obstante y dado el
potencial detectado en dos de las especies evaluadas (arrayn y peumo) es que se incluyeron en
detalle.

3.2.2.1.- Determinacin de contenido de agua y actividad de agua del material vegetal.

A continuacin, se exponen los detalles del procesamiento y caractersticas de las


muestras frescas que se sometieron al estudio de actividad antimicrobiana. Las muestras
evaluadas se caracterizaron por un contenidos de agua cercanos al 80%, lo que se vio reflejado en
actividades de agua entre 0.67 a 0.85 unidades (Tabla 9). Al momento de realizar extractos
metanlicos, los extractos de frutos presentaron los mayores rendimientos de extraccin en
comparacin con los extractos de hojas que presentaron rendimientos menores a 6% (Tabla 9).

48
Tabla 9. Contenido de humedad, actividad y rendimiento de extraccin de muestras frescas de las especies
en estudio
Parmetro Hojas Frutos
Arrayn Lleuque Peumo Arrayn Lleuque Peumo
Humedad (%) 82.0 0.9 76.9 4.1 72.9 4.2 84.5 0.1 84.1 2.1 73.9 0.2
Actividad de 0.84 0.01 0.72 0.01 0.67 0.01 0.85 0.01 0.83 0.01 0.7 0.01
agua, aw

Rendimiento de 5.18 0.1 5.34 0.1 5.90 0.1 30.8 0.1 28.9 0.1 28.1 0.1
extraccin (%)
Los valores representan la media desviacin estndar de tres replicas y dos ensayos independientes.

Los extractos de frutos presentaron una amplia capacidad antimicrobiana, mientras que
nicamente los extractos de hojas de arrayn y peumo mostraron actividad antimicrobiana mnima
contra dos cepas de S. aureus (Tabla 10). En general los extractos de fruto de arrayn mostraron
actividad antimicrobiana superiores y significativamente mayores que los extractos de fruto de
peumo y lleuque. Esto puede estar relacionada con el alto contenido fenlico y la capacidad
antioxidante de estos frutos. De particular inters es la capacidad que tienen estos extractos de
inhibir el crecimiento de S. aureus, incluyendo una cepa resistente a los antibiticos (Tabla 10).

49
Tabla 10. Actividad antimicrobiana de extractos de plantas nativas (arrayn, peumo, lleuque) contra bacterias patognicas mediante el mtodo de difusin de disco.

Cepas Zona de inhibicin (mm)


bacterianas
Extracto de hojas Extracto de frutos CN CP
(MeOH)
Arrayn Peumo Lleuque Arrayn Peumo Lleuque Ampicilina (10 Estreptomicina (10
g/disco) g/disco)

S. aureus 25923 ND ND ND 12.3 0.11c,c 9.33 0.31b,d 7.83 1.18e,e ND 19.5 0.58c,b 21.0 4.83a

S. aureus MRSA 8.00 8.00 0.10a,d ND 14.7 0.12a,a 8.32 0.35c,c 8.67 0.47a,c ND 10.2 0.96e,b 11.2 2.06e,b
a,d
0.10

S. aureus ST-2011 8.00 7.5 0.10a,e ND 15.0 0.11a,b 12.7 0.19a,c 8.50 0.24a,d ND 32.2 2.63a 14.0 0.82C,b
a,e
0.10
E. coli O157:H7 ND ND ND 12.0 0.10c,c 8.21 0.19c.d ND ND 19.5 1.73c,a 14.7 0.96c,b

E. coli (non- ND ND ND 10.3 0.10d,c 7.85 0.21c,d ND ND 16.5 0.58d,a 12.7 0.96d,b
toxigenic)

b,b c,c b,c b,a d,b


S. typhimurium ND ND ND 13.3 0.10 8.32 0.10 8.00 0.94 ND 20.2 0.50 12.5 1.29

S. enteritidis ND ND ND 14.3 0.12a,c 8.00 0.11c,d 7.00 1.41d,d ND 20.7 0.96b,a 18.0 1.83b,b

S. newport ND ND ND 14.0 0.11a,b 8.00 0.10c,c 8.33 1.89b,c ND 20.7 0.50b,a 13.5 1.29c,b
L. monocytogenes ND ND 6.00 0.00a,d 13.3 0.09b,b ND 8.17 0.24b,c ND 19.7 0.50c,a 13.5 1.29c,b

L. innocua ND ND 6.00 0.00a,c 13.0 0.11b,b ND 7.83 0.24c ND 20.2 0.50b,a 13.5 0.58c,b

CN: Control negativo, disco blanco estril impregnado con 20 L de Metanol


CP: Control positivo (Discos antibitico estndar 10 g/disco)
Los valores representan el promedio desviacin estndar de seis rplicas y dos ensayos independientes.
Valores seguidos por una letra mayscula diferente entre columnas son significativamente diferentes (p < 0.05).
Valores seguidos por una letra minscula diferente entre filas son significativamente diferentes (p < 0.05).

50
Las infecciones causadas por bacterias de la familia Staphylococcus generalmente estn
relacionadas con infecciones de piel, por lo que la capacidad de los extractos de arrayn abre una
potencial aplicacin de stos para uso tpico. Ms cuando la concentracin mnima de inhibicin
de estos microorganismos se encuentra en el orden de menor a 500 g/mL (Tabla 11). De inters
sera evaluar posteriormente la capacidad de los extractos contra levaduras, que son clnicamente
conocidas por causar enfermedades drmicas. El control de bacterias de las familias de
Salmonella, Escherichia y Listeria abre la posibilidad de emplear extractos de fruto de arrayn en
pelculas biocomestibles por ejemplo. De esta manera sera posible proteger alimentos frescos y
procesados contra actividades de deterioro (capacidad antioxidante de los extractos) e inhibir el
crecimiento de microorganismos patognicos y deteriorantes. Se estima que es necesario
profundizar la investigacin en este mbito, ampliando el nmero de ensayos para evaluar esta
aplicacin en funcin del microorganismo objetivo a controlar y su potencial uso mediante la
inclusin en diversas matrices tanto alimenticias como farmacolgicas.

Tabla 11. Mnima concentracin inhibitoria (CMI) de extractos metanlicos de plantas nativas (arrayn,
peumo, lleuque) contra microorganismos patognicos.

CMI (g/mL)
Cepas
bacterianas Extracto de hojas Extracto de frutos
Arrayn Peumo Lleuque Arrayn Peumo Lleuque
S. aureus
25428 NE NE NE 424 0.06d,c 611 1.14b,b 1000 0.35a,a
S. aureus
MRSA 454 1.00a 1039 0.75a NE 474 1.11d,c 965 1.12a,b 1031 1.01a,a
S. aureus ST-
2011 440 0.99a 1050 1.12a NE 435 0.98d,b 454 0.98a,b 1039 1.14a,a
b,a a,b
E. coli O157:H7 NE NE NE 611 1.12 450 1.12 NE
E. coli (non-
toxigenic) NE NE NE 531 1.12c,b 890 1.14a,a NE
a,a
S. typhimurium NE NE NE 890 0.38 615 1.14a,b 857 1.05b,a
d,c a,b a,a
S. enteritidis NE NE NE 454 1.35 965 1.12 1019 1.13
a,a b,c b,b
S. newport NE NE NE 965 1.14 675 0.87 860 1.17
L.
monocytogenes NE NE NE 450 1.14d,c 965 1.12a,a 798 1.69c,b
L. innocua NE NE NE 531 0.78c,b NE 724 1.17c,a
Los valores representan el promedio desviacin estndar de seis rplicas y dos ensayos independientes.
Valores seguidos por una letra mayscula diferente entre columnas son significativamente diferentes (p < 0.05).
Valores seguidos por una letra minscula diferente entre filas son significativamente diferentes (p < 0.05).
NE: No evaluado. Solo extractos que mostraron actividad antimicrobiana mediante el mtodo de difusin de discos
fueron evaluados para CMI.

51
3.2.3.- Ensayos funcionales en aorta de rata.
Para ello, se utilizaron tres extractos: (1) hoja de Peumo (Peumo-H), (2) hoja de Arrayn
(Arrayan-H) y (3) fruto de Arrayn (Arrayan-F). Para cada extracto se evala su capacidad para
proteger la relajacin dependiente de endotelio, de anillos de aorta de rata pre-incubados con alta
glucosa (HG, D-glucosa 25 mM)
Como lo muestran en las Figura 30, cuando los anillos articos fueron pre-incubados por 3
h con HG, el efecto vasodilatador mximo (Emax) tpico de ACh se redujo drsticamente desde
87,69 2,59% (N = 6) a 40,54 1,78% (N = 6).

Figura 30. Relajacin inducida por ACh en anillos de aorta de rata pre-contrados con fenilefrina (PE, 10-7 M)
y pre-incubados con HG y extractos. Curva concentracin-respuesta acumulativa de ACh (10-10 - 10-5 M) en
anillos de aorta de pre-incubados durante 3 h en presencia de D-glucosa 5 mM (control), D-glucosa 25 mM
(HG), y HG ms cada extracto a tres concentraciones (0.1, 1 y 10 mg/ml). Los resultados (promedio + SEM)
se expresan como porcentaje de inhibicin (% Relajacin) de la contraccin inducida por PE (10-7 M). Los
valores de Emax (%) y pD2 se muestran en la Tabla 1 del Informe Anexo (ver anexo).

52
El efecto negativo de HG sobre la relajacin dependiente de endotelio en aorta, se revirti
parcialmente en los vasos co-incubados con los extractos, siendo significativo en las
concentraciones de 1 y 10 mg/ml en hoja de peumo, concentracin de 10 mg/ml en hoja de
Arrayan y en todas las concentraciones para frutos de arrayan. A partir de lo anterior se observa un
efecto protector de los extractos, dependiente de su concentracin. Por su parte, la proteccin
otorgada por fruto de arrayan fue casi 100 veces mayor en trminos de eficacia, respecto de las
hojas. Se concluye que todos los extractos muestra un efecto protector, dependiente de
concentracin, respecto de la relajacin dependiente de endotelio, inducida por ACh en anillos de
aorta de rata pre-tratados con altos niveles de glucosa. Estos resultados sugieren que estos
extractos pueden tener un importante uso en la prevencin de daos vasculares producidos por
enfermedades como la diabetes o hipertensin arterial.

53
4.- Divulgar hacia la comunidad los resultados y conclusiones obtenidos (ver
anexo Difusin por detalles).
-Asistencia a congresos cientficos: durante los dos aos de proyecto se presentaron trabajos tanto
en reuniones cientficas nacionales como internacionales. Se presentaron 9 trabajos a congresos
nacionales (destacable presencia en el Tercer Congreso Nacional de Flora Nativa) y 2 a
internacionales (ver anexo).

-Publicaciones cientficas: se tiene un manuscrito avanzado en donde se describe el potencial


saludable y alimenticio del fruto del arrayn a travs de la maduracin de ste. Est pronto a ser
enviado a revista ISI. Por otra parte, se piensa elaborar otros manuscritos cientficos en torno a los
resultados de las propiedades saludables de los frutos; relacionados a propiedades de la pared
celular; y a protocolos de micropropagacin.

-Publicaciones de divulgacin: se realiz dos publicaciones de divulgacin del tema general del
proyecto. Una en la revista del INIA Tierra Adentro (Frutos Nativos: Fuente de Ingredientes
Bioactivos para la Creacin de los Nuevos Alimentos Saludables) y otra en la revista agroindustrial
Indualimentos (Potencial Agroalimentario de Especies Nativas Un Camino hacia el Manejo
Sustentable de nuestra Flora Nativa?)

-Realizacin de Seminarios: Cabe destacar la realizacin de dos actividades de difusin del tema
del proyecto a la comunidad general. El 2 de agosto de 2013 se realiz el seminario Valorizacin
de rboles frutales nativos con potencial productivo en la Regin del Biobo, realizado en la
comuna de San Fabin de Alico, VIII Regin, con presencia de estudiantes secundarios,
agricultores, y autoridades locales de la comuna. Por otra parte, el 29 de agosto de 2013 se
organiz el Seminario Flora chilena como fuente de antioxidantes: una alternativa para reforzar la
agroindustria nacional realizado en INIA, La Cruz, V Regin.

-Charlas a la comunidad estudiantil: realizacin de dos charlas a liceos de la comuna de Lota, VIII
Regin, en relacin a la importancia de la biodiversidad de nuestro pas y el valor de los frutos
nativos. Adems, se ha contemplado, realizar dos charlas el 7 de octubre de 2013 a travs del
programa Explora de Conicyt titulada: Bosque nativo, una fuente de beneficios para la salud.

-Divulgacin del marco general del proyecto y algunos resultados a travs de portales
institucionales y otros de Internet: es importante sealar que se cre la pgina web Frutos Nativos
(www.frutosnativos.udec.cl) para divulgar a la comunidad en general sobre el tema del proyecto.

-Entrevista en TVU al Investigador responsable del proyecto: en entrevista canal regional TVU (11
de mayo de 2013), sobre lnea de investigacin en frutos nativos, se incluy el tema del proyecto
CONAF 064/2011. Ver entrevista en: https://www.youtube.com/watch?v=52JXpw67AlE

54
-Adems, el proyecto en general, los resultados y la importancia de la flora nativa fue difundida a
travs de distintos medios de comunicacin impresos y portales. En la siguiente tabla se muestra la
lista de portales donde se difundi el proyecto:

Nombre del portal Link


Pgina Creas http://www.creas.cl/?p=1965
Pgina PUCV http://ucv.altavoz.net/prontus_unidacad/site/artic/20110619/pags/2011061
9213306.html
Diario El Observador http://www.diarioelobservador.cl/68-
Proyecto_busca_caracterizar_potencial_saludable_y_agroalimentario_de
_especies_arboreas
Programa Agro TV http://www.mediafire.com/?ffqnu6rq9b2716p
Pgina CONICYT http://www.conicyt.cl/regional/2013/08/19/seminario-creas-%E2%80%93-
inia-la-cruz-%E2%80%9Cflora-chilena-como-fuente-de-antioxidantes-una-
alternativa-para-fortalecer-la-agroindustria-nacional%E2%80%9D/
Red Ciencia http://www.redciencia.net/archives/113525
Revista Tierra Adentro http://www.inia.cl/wp-content/uploads/revista_tierra_adentro/TA100.pdf
Pgina CREAS http://www.creas.cl/?p=2193

55
IV. PRINCIPALES CONCLUSIONES

1.- AREA GENTICA


-La tcnica AFLP permite detectar los polimorfismos a nivel del genoma de la especie C. alba bajo
estudio, convirtindola en un mtodo fiable para calcular la variabilidad gentica de sta. Este
estudio sienta las bases para una posterior investigacin que abarque el total de la distribucin
natural de la especie y otras nativas.

-Mediante la tcnica de AFLP es posible detectar potenciales polimorfismos en L. apiculata, a nivel


de ADN genmico, en base a la visualizacin de los geles de agarosa y el gel virtual. Sin embargo
debido al bajo nmero de individuos por poblacin en estudio, es complejo seleccionar aquellas
bandas que realmente son polimrficas, por lo que un aumento del nmero de estos, permitira
aumentar la fiabilidad de los resultados.

2.- AREA PROPAGACIN


-Se logr establecer el cultivo in vitro de peumo, arrayn y lleuque, hasta la fase de multiplicacin
de microtallos, generando un protocolo de asepsia, establecimiento y multiplicacin para las 3
especies antes mencionadas.

- Belloto del sur y naranjillo, sus yemas vegetativas no lograron reaccionar para su establecimiento
en el cultivo in vitro, bajo las condiciones ensayadas.

-De acuerdo a los resultados obtenidos a la fecha, el establecimiento del cultivo in vitro de material
adulto de las especies en estudios depende del estado de desarrollo ontognico (grado de
lignificacin de los tejidos caulinares) y poca del ao.

-Es necesario suplementar los medios de cultivo con dosis bajas de giberelinas para lograr
elongacin de yemas vegetativas en lleuque.

3.- AREA CARACTERIZACION DE FRUTOS Y POTENCIAL ALIMENTARIO


- Se logr determinar que existen, con excepcin del pitao y belloto del sur, diferencias
significativas en relacin a los parmetros color, peso y dimetro de los frutos estudiados. En el
caso particular del pitao, se logr determinar que slo el color es un buen parmetro para
caracterizar su maduracin puesto que el dimetro, peso y pH no presentan una tendencia
concreta. En el caso de B. berteroana debido a las caractersticas fisiolgicas y los pocos estudios
realizados en este tipo de frutos, los anlisis resultaron complejos y no lograron determinar
diferencias marcadas entre los estadios.

- Arrayn y peumo presentan un aumento progresivo en el peso conforme avanza la madurez del
fruto. En cuanto a las dimensiones, peumo es un fruto que principalmente crece en longitud,
mientras arrayn crece en dimetro, hacindose ms redondo en la madurez. El fruto de arrayn
es un fruto ms bien neutro de baja acidez.

- Los frutos de naranjillo y peumo, mostraron sus mayores diferencias en relacin al color durante
la maduracin, pasando de un color verde en su estado inmaduro a un color negro y rojo en su
estado final de maduracin, respectivamente. Por otra parte, arrayn y lleuque presentaron la
mayor cantidad de diferencias organolpticas durante la maduracin, en especial la concentracin
de slidos solubles (CSS) aumenta notoriamente hacia la maduracin, teniendo ambas especies
valores relativamente altos, indicando que sus frutos al estado de madurez presentan altos

56
contenidos de azcar.

-Los resultados de concentracin de AIR informan que, al igual que en lignina, existe una
disminucin en el contenido de pared celular a medida que transcurre la maduracin. Dichas
respuestas pueden estar asociadas a la despolimerizacin y solubilizacin de los componentes de
la pared celular. En el caso de arrayn y lleuque se observ cambios drsticos en el contenido de
AIR de las localidades prospectadas. El arrayn muestra disminuciones de un 50% entre el estadio
verde y maduro, mientras que el lleuque slo disminuye un 25% entre estadios, indicando que este
fruto no sufre tantos cambios en la estructura de su pared a medida que madura.

-El anlisis de las fracciones pcticas (CSF y NSF) indica que el lleuque y arrayn presentan una
mayor concentracin de pectinas a medida que maduran. Esta acumulacin de pectinas durante la
maduracin puede estar dada por sntesis de componentes pcticos de la pared celular
(probablemente de interaccin covalente) lo que podra potenciar a estas especies en la
produccin de agentes gelificantes y/o espesantes.

- El contenido de lignina de los frutos mostr una tendencia decreciente durante el transcurso de la
maduracin. Esta baja en la concentracin de lignina puede estar asociada al proceso de
ablandamiento que ocurre durante la maduracin del fruto. Durante la investigacin fue posible
establecer diferencias comparativas entre los diferentes estadios de cada especie. En el caso de
peumo, arrayan y lleuque se logr determinar que existen diferencias entre las distintas
localidades muestreadas. Estos cambios pueden tener una explicacin dadas las condiciones
climticas propias de cada sector, y los efectos de estas en la maduracin.

4.- AREA POTENCIAL SALUDABLE Y FARMACOLGICO


-En frutos de arrayn y peumo tanto la capacidad antioxidante como el contenido de polifenoles
totales, aumenta conforme progresa la madurez del fruto. Se observ una buena correlacin entre
el contenido de polifenoles y la capacidad antioxidante indicando que esta capacidad dependiendo
en forma importante del contenido de estas molculas. Por otro lado al comparar ambos frutos con
uno comercial, arndano se observ que peumo presenta valores similares al comercial, siendo el
contenido de polifenoles y la capacidad aintioxidante de arrayan superior a arndano.

-Los extractos metanlicos de frutos son significativamente ms eficientes que los extractos de
hojas en la inhibicin de microorganismos patognicos. Dentro de estos, los extractos de fruto de
arrayn demostraron capacidades muy interesantes contra microorganismos conocidos por iniciar
enfermedades cutneas (S. aureus). Ms an, la concentracin mnima de inhibicin de estas
bacterias, se encuentra dentro las ms bajas en el estudio. Estos resultados abren posibilidades de
uso de los extractos en formulaciones de uso tpico.

-Adicionalmente, los mismos extractos demostraron ser eficientes en el control de bacterias


patognicas comnmente encontradas en alimentos listos para su consumo (L. monocytogenes),
por lo que una aplicacin de los mismos en pelculas comestibles puede presentar alternativas
interesantes para el control de estos patgenos, lo que sumado a la capacidad antioxidante
contenida en los extractos pueden favorecer en general la manutencin de la calidad de alimentos
listos para su consumo.

-Respecto a los anlisis funcionales de relajacin de aorta de rata. Los extractos de hoja y frutos
de peumo y frutos de arrayn mostraron ser capaces de relajar los anillos de aorta. Las muestras
de frutos de arrayan y las muestras de hojas de peumo mostraron una actividad a concentraciones
bajas de extracto 0,1 mg/ml y 1 mg/ml respectivamente. Estos resultados indican que los extractos
de ambas especies pueden tener un uso en la prevencin de hipertensin.

57
V. RECOMENDACIONES
Las especies arrayn, lleuque y peumo son las especies ms promisorias de acuerdo a los
resultados obtenidos en este proyecto. Por ejemplo, es posible recomendar tanto a lleuque como
arrayn para el desarrollo de la industria agroalimentaria debido a que presentan caractersticas
interesantes (principalmente color atractivo, dulzor, contenido de pectinas). Adems, arrayn posee
una propiedades antioxidantes notables, un potencial antimicrobiano para la industria de proteccin
drmica y para inocuidad alimentaria. Por otra parte, tanto arrayn como peumo podran tener un
uso en la prevencin de hipertensin como indican los resultados de bioactividad en aorta de rata.
A todo esto se suma que para estas tres especies se gener un protocolo de asepsia,
establecimiento y multiplicacin in vitro, lo que ayudara a propagar material vegetal y proveer del
material gentico necesario para un futuro programa de mejoramiento de estas especies.

Estos recursos fitogenticos nativos pueden ser la base de innovacin en la industria de los
frutos saludables y bioactivos de Chile con impacto en la industria alimentaria y farmacolgica. En
relacin a las otras especies, aun no es posible descartar su potencial, pues todava falta
profundizar en la investigacin de sus propiedades y potenciales beneficios. Se recomienda a la
Coorporacin Nacional Forestal implementar una lnea de investigacin permanente en el Fondo
de Investigacin del Bosque Nativo que apoye el financiamiento de proyectos destinados a la
investigacin y desarrollo en base a productos forestales no madereros, en especial frutos.

58
VI. BIBLIOGRAFIA
AOAC. 2011. International guidelines for laboratories performing microbiological and chemical
analyses of food and pharmaceuticals : an aid to interpretation of ISO/IEC 17025:2005. AOAC
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