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IMAGE J COMO FERRAMENTA PARA MEDIDA DA

REA DE PARTCULAS DE MAGNETITA EM TRS


ESCALAS NANOMTRICAS
Adriana Hannickel*a, Marcelo Henrique Prado da Silvaa, Henrique Lins De Barrosb
e Mrcio Portes de Albuquerqueb

a
Seo de Engenharia Mecnica e de Materiais (SE/4) Instituto Militar de Engenharia (IME)
Praa General Tibrcio, 80, Praia Vermelha, 22.290-270, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
b
Centro Brasileiro de Pesquisas Fsicas, Laboratrio de Difrao de Raios X
Rua Xavier Sigaud 150, Urca
ahannickel@uol.com.br

RESUMO

Um dos objetivos do processamento de imagens digitais a extrao


de informaes fornecidas por parmetros que possibilitaro a descrio, interpre-
tao ou entendimento da cena pelo computador. Neste trabalho, utilizou-se o sof-
tware de processamento e anlise de imagens digitais ImageJ como ferramenta
para medio de partculas de magnetita obtidas por trs rotas diferentes (qumica,
biolgica e fsica). Estas rotas produziram partculas em trs tamanhos distintos de
uma escala nanomtrica: nanopartculas de xido de ferro superparamagnticas
(SPION) com 10 nm, cristais de magnetita em cadeia presentes no citoplasma de
bactrias magnetotcticas com 100 nm e partculas de magnetita moda encontra-
das no pigmento de tintas comerciais com 1000 nm.

Palavras-Chave: ImageJ; Processamento de Imagens Digitais; Magnetita.

ABSTRACT

One of the objectives of digital image processing is to obtain information provided by


parameters that enable the description, interpretation or understanding of the scene
by the computer. In this study, the software for processing and analyzing digital
image, ImageJ, was chosen as a tool for measuring magnetite particles obtained by
three different routes (chemical, biological and physical). Each of these routes
produced particles in three different sizes of a nanometer scale: superparamagnetic
iron oxide nanoparticles (SPION) within 10 nm; magnetite crystals found in the
cytoplasm of magnetotactic bacteria within 100 nm; magnetite particles in pig-
ments of painting inks, within 1000 nm.

Keywords: ImageJ; Digital Image Processing; Magnetite.

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INTRODUO

O ImageJ um software para processamento e anlise de imagens,


desenvolvido por Wayne Rasband no National Institute of Mental Health, USA, em
linguagem Java. Com este software possvel exibir, editar, analisar, processar,
salvar e imprimir imagens de 8, 16 e 32 bits. Permite o processamento de diversos
formatos de imagem como TIFF, GIF, JPEG, BMP, DICOM e FITS. Suporta a
tcnica de empilhamento de imagens, isto , uma srie de imagens que
compartilham uma nica janela para animaes. Alm disso, a leitura de um arquivo
de imagem pode ser feita paralelamente a outras operaes. A janela contendo os
resultados (rea, permetro, orientao etc) permite que estes sejam exportados
para um arquivo, como por exemplo, no formato XLS (Microsoft Excel). No ImageJ,
o clculo das reas feito pela contagem de pixels das regies selecionadas pelo
usurio ou por um algoritmo especfico (RASBAND, 2011).
O ImageJ atua na imagem pela intensidade, ou nvel de cinza dos pixels. Em
vrios casos necessrio adicionar ao programa principal um plugin. Plugins so
programas de computador usado para adicionar funes a outros programas
maiores, provendo alguma funcionalidade especial ou muito especfica. Para a me-
dio das partculas deste trabalho foi utilizado o plugin Watershed [SAGE, 2008].
A transformao watershed baseada na simulao de inundao:
considerando a imagem de entrada em nveis de cinza como uma superfcie
topogrfica, o objetivo produzir linhas de diviso de guas nesta superfcie. Para
tal, um furo feito em cada mnimo regional da superfcie. Mnimo regional uma
zona plana no adjacente a nenhuma outra zona plana com menor altitude (nvel de
cinza). Uma zona plana uma rea onde todos os pixels tm o mesmo nvel de
cinza. A superfcie ento, submersa a uma taxa constante, de modo que a gua
entre pelos mnimos regionais. Quando frentes de gua, vindas de diferentes
mnimos regionais, esto prestes a se encontrar, uma barreira construda para
evitar tal encontro. Em algum momento, o processo chega a um estado tal que
somente os topos das barreiras esto visveis acima do nvel da gua,
correspondendo s linhas de watershed. Dessa forma, quando a transformao
watershed aplicada, induzimos o aparecimento de linhas de diviso de guas
sobre as bordas dos objetos, separando-os (KLAVA, 2009).
Para entender o papel desempenhado pelo watershed em toda a cadeia de
tratamento de informao no processamento de imagens, necessrio entender a
etapa de segmentao de imagens. De modo simplificado, segmentar uma imagem
significa separ-la em suas partes constituintes, diferenciando-as. A segmentao
considerada, dentre todas as etapas do processamento de imagens, a mais crtica
do tratamento da informao. na etapa de segmentao que so definidas as
regies de interesse para processamento e anlise posteriores. Como consequncia
deste fato, quaisquer erros ou distores aqui presentes refletem nas demais
etapas. Isto acarreta resultados no desejados ao final do processo que podem
contribuir de forma negativa para a eficincia de todo o processamento.
Deve ser ressaltado que no existe um modelo formal para a segmentao de
imagens. Este um processo emprico e adaptativo, procurando sempre se adequar

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s caractersticas particulares de cada tipo de imagem e ao objetivo que se pretende
alcanar. Existe uma grande diversidade de tcnicas de segmentao de imagens e
uma delas o watershed apresentado anteriormente (ALBUQUERQUE, 2004).

MATERIAIS E MTODOS

As partculas de magnetita medidas foram obtidas como a seguir:


SPION (nanopartculas de xido de ferro superparamagnticas) - obtidas
pelo mtodo qumico de coprecipitao (CHASTELLAIN, 2004);
Cristais de magnetita em cadeia presentes no citoplasma de bactrias
magnetotcticas da Lagoa Rodrigo de Freitas (Rio de Janeiro) - biossntese
(BAZYLINSKI, 2004);
Partculas de magnetita presentes no pigmento de tintas comercias para
pintura de quadros (Grumbacher Pre-Tested P-134, Mars Black) - mtodo
fsico por moagem (COSTA RIBEIRO, 2007).

Para se obter as imagens digitais para processamento, utilizou-se a microscopia


eletrnica (MET). As solues contendo as partculas acima descritas foram gotejadas
sobre grades de cobre para microscopia eletrnica recobertas com um filme de
carbono com espessura de 20 a 30 nm (Carbon Film 200 Mesh, Cu). O Microscpio
Eletrnico de escolha foi o MorgagniTM TEM, FEITM, que opera a 80 kV, de
propriedade do Instituto de Microbiologia da Universidade Federal do Rio de Janei-
ro (UFRJ).
As Figuras 1 a 3 so exemplos das micrografias utilizadas nas medidas com
o ImageJ .

Figura 1 Micrografia de uma regio de uma amostra de SPION.

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Figura 2 Nanocristais de magnetita de bactria espalhados na amostra.

Figura 3 Micrografia de uma regio de uma amostra de tinta comercial.

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A Figura 4 mostra os recursos do software ImageJ e a FIG. 5 apresenta os passos
para medida da rea das partculas estudadas como explicado a seguir: se a
imagem original for de 16 ou 32 bits, ser necessrio sua transformao para 8 bits
(nveis de cinza entre 0-255, necessrio para o calculo da transformao watershed)
(a), para ento se obter a imagem binria (b). Em funo de diversas caractersticas
da imagem analisada (como diferenas de tonalidades dos nveis de cinza,
agrupamento dos objetos ou ainda rudos provocados pelas tcnicas de
processamento utilizadas) os contornos resultantes podem no ficar bem
delineados, sendo nestes casos necessrio apagar ou redesenhar manualmente
alguns contornos ou preenchimentos. Estes procedimentos so feitos sempre tendo
como base a imagem original. Tal alternativa pode ser realizada sem
comprometimento da qualidade da anlise, desde que os contornos originais sejam
realados. (DIAS, 2008).

Figura 4 Recursos do software Image J (http://imagej.nih.gov/ij/).

Figura 5 Imagem original em 8-bit (a); imagem binria obtida atravs do watershed (b), desenho das
partculas (c); sobreposio da imagem binria e do desenho das partculas (d).

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Com a imagem binria obtida, o prximo passo selecionar a funo Analyze
Particles. O resultado ser um desenho onde cada partcula est identificada com
um nmero. Aquelas que no estiverem correspondendo imagem original podem
ser descartadas do resultado final. Diversos atributos podem ser obtidos de cada
uma das partculas (rea, centro de gravidade, orientao, nvel de cinza mdio,
elipse de melhor ajuste regio, etc). Neste trabalho estamos interessados na rea
de cada uma das partculas, nesta etapa fornecido pela contagem dos pixels em
cada uma das regies identificadas.
Como pode ser notado, cada resultado correspondente a uma partcula do
desenho originado. O prximo passo a converso dos resultados em pixels, para
unidade de medida que dever ser utilizada. Como a imagem original possui uma
barra de escala, atravs de uma ferramenta do prprio software, realizamos a
medida deste comprimento em pixels e sua converso, que neste caso foi para nm2
e m2.

RESULTADOS E DISCUSSO

Com as medidas acima foi possvel obter-se a distribuio de tamanho dos


trs tipos de partculas de magnetita nas amostras.
As Tabelas 1 a 3 indicam as classes da medida das reas das partculas, a
freqncia simples absoluta (fj), frequncia simples relativa (frj), a freqncia
absoluta acumulada (Fj) e a frequncia relativa acumulada (Frj) das partculas me-
didas (S, T e B). Com estes dados foi possvel a obteno dos grficos ilustrados
nas Figuras 7 a 9.
A Tabelas 1 e a Figuras 7 referem-se s nanopartculas SPION. Atravs da
anlise do grfico, possvel notar que a maior parte das nanopartculas medidas
nesta a mostragem possui uma rea de mancha na faixa entre 51 e 85 nm2. Nota-
-se tambm uma larga distribuio de tamanho. Este resultado concorda com
as anlises em MET, que revelou partculas com poucos nanmetros de dimetro.

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Tabela 1 Distribuio da rea em nm2 de 230 partculas SPION

Figura 7 Distribuio do tamanho das partculas por rea em nm2

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A Tabela 2 indica as classes de medidas da rea de 101 partculas de xido
de ferro encontradas no pigmento de tinta comercial. Atravs da anlise da Figura 8
percebe-se que a maior parte das partculas medidas possui uma rea da mancha
entre 0,07 e 0,15 m2.

Tabela 2 Distribuio da rea em m2 de 101 partculas de Tinta Comercial

Figura 8 Distribuio do tamanho das partculas por rea em m2.

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A Tabela 3 mostra as classes de medidas da rea de 170 partculas de xido
de ferro de bactrias magnetotcticas observadas. Com a Figura 9, observa-se que
as partculas possuem uma rea da mancha, em sua maioria, com tamanhos que
variam entre 9600 e 16800 nm2.

Tabela 3 Distribuio da rea em nm2 de 170 partculas do magnetossoma

Figura 9 Distribuio do tamanho das partculas por rea em nm2.

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Tendo todas as medidas tomadas, foi calculado o desvio padro das mesmas
adotando-se o mesmo procedimento de medio utilizado para todas as partculas.
Escolheu-se uma partcula de cada tipo (SPION, tinta e bactria) e mediu-se trinta
vezes cada uma. Os resultados esto indicados na Tabela 4.

Tabela 4 Desvio Padro da Mdia Aritmtica (rea das Partculas)

Com os resultados acima, conclui-se que o mtodo adotado para medio das
partculas mostrou-se confivel.

CONCLUSO

O software ImageJ mostrou-se uma ferramenta de fcil utilizao e eficaz


na obteno de medidas das diferentes partculas estudadas. Este software tem
a vantagem de ser simples, de cdigo aberto e com uma quantidade significativa
de mdulos plugins que permitem estender sua potencialidade. Ademais, como
foi desenvolvido na linguagem Java, ele tambm esta disponvel para vrias
plataformas computacionais e permite integrar cdigos dos usurios em linguagem
Macro ou mesmo em Java.
Os tamanhos das partculas encontrados neste estudo, mostraram-se
compatveis com aqueles obtidos em trabalhos anteriores, cujos mtodos adotados
para medio das mesmas foram diversos (CHASTELLAIN, 2004). Com estas
medidas, foi possvel obter os grficos com a distribuio das partculas nas
diferentes amostras e concluir que as nanopartculas SPION apresentaram tamanho
bastante regular e muito pequeno; a tinta comercial, apresentou partculas com ta-
manhos largamente distribudos; a bactria, por sua vez, apresentou as partculas
mais uniformes no s na forma, mas tambm em tamanho.

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

- ALBUQUERQUE, M.P., Rotulao e Labelizao, Livro da V Escola do CBPF, Rio de Janeiro,


2004.
- BAZYLINSKI, D.A., FRANKEL R.B., Magnetosome formation in prokaryotes. Nature Reviews Mi-
crobiology, vol.2, 217-230, 2004.
- CHASTELLAIN, A., PETRI, A., HOFMANN, H., Particle size investigation of multistep synthesis
of PVA coated superparamagnetic nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science 278:
353-360, 2004.
- COSTA RIBEIRO, P. et al., Imagens Magnticas de Pinturas Acrlicas e Imagens Sacras. Revista
Brasileira de Arqueometria, Restaurao e Conservao, vol.1, N.2, pp. 056-059, 2007.
- DIAS, F.C., Uso do Software ImageJ para Anlise Quantitativa de Imagens de Microestruturas de
Materiais, Dissertao de Mestrado, INPE, 2008.
- KLAVA, B., Segmantao interativa de imagens via transformao watershed, Dissertao de Mes-
trado, IME-USP, 2009.
- RASBAND, W., ImageJ documentation. Disponvel em: www.rsb.info.nih.gov, acesso em
01/04/2011.
- SAGE, D., Watershed Segmentation; cole Polytechnique Fdrale de Lausanne Disponvel em:
http://bigwww.epfl.csage/soft/watershed/index.html, acesso em 02/04/2011.

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