Curso HPLC PDF

Facultad de Ciencias
Programa de Educacin Continua
FUNDAMENTOS DE
CROMATOGRAFIA
LIQUIDA DE ALTA
EFICIENCIA
Franklin Muoz Crdenas

2011 framunoz@starmedia.com
1
Historia
1850 Runge
Anilinas (Colorantes) 1906 Mikhail 1941 Martn y Singe
Cromatografia-Papel Tswett Posibilidad terica
Fm: Solventes Pigmentos vegetales Fm: Gas
Fe: Papel Cromatografia-Colummna
1952 Martn y
1955 Primer CG 1954 Ray 1 Publicacin James
Realidad Experimental 1941
Chroma : Color
Graphein: Escribir
1955-1967 usos de otras 1960 SFC
Fases mviles JJ kirkalnd 1960
1987 se comercializa
auge-comercializacin
2
Definicin IUPAC
Mtodo
Separacin fsica componentes
Muestra distribuye 2 fases
Migracin entre zonas
Fase Fase
Mvil Estacionari
a
Lquida
Gas Slida Lquida
Slido
Lq/gas
Gel
Modalidades de Cromatografia
Naturaleza
Fase
Estacionaria Fenmeno en
Naturaleza
Columna
Fase mvil
L iq-Sol (LSC)
Gas : C. Gaseosa GC Liq-Liq (LLC)
Gas-Liq (GLC)
Lquido: C Lquida LC Gas-Sol (GSC) 1. Afinidad
Normal/Reversa
Capa Delgada TLC Ligada
Columna Abierta Intercambio Inico
HPLC *
2. Tamano molecular
Lquido/Gas :SFC
Permeacin por gel
Filtracin por gel
Cantidad Muestra
Aplicada
Analtica: Pg Ug
Semipreparativa: ug gramos
Preparativa: gramos-
4
CG
HPLC
vS e p a r a : S u s t a n c i a s O r g n i c a s
Voltiles , NO Termolbiles, peso
molecular promedio (no alto )
vSepara: Orgnicos e inorgnicos
vLa fase el parmetro de separacin Voltiles o no, Termolbiles o no,
v20% pueden separarse sin previo vLa fm es el parmetro fundamental de

tratamiento la separacin.
vDetectores; Diferencian fm del analito, vDetectores; NO Diferencian fm del

la fm es inerte al detector analto, la fm no es inerte al detector.
vDestructivo no recupera muestra vNO Destructivo recupera muestra

Inter.
Inico
IEC
Liq-
Sol
LSC
Formas
CL
Excl.
Liq-
Tamao
Liq
SEC
LLC
Fase
ligada
BPC
6
9
12
Dnde est ? Qu se usa?
13
14
Solventes
Es el verdadero motor y una gran diferencia con CG donde
el gas es solo Carrier del analito.
Propiedades de los solventes en HPLC
Alto poder solubilizante de las muestras

Baja reactividad
Compatibilidad con el detector utilizado
Adecuado punto de ebullicin y volatilidad
Baja viscosidad
Seguridad (salud)
Alto grado de pureza
15
17
Preparacin fases mviles
Es necesario tener en cuenta;
1. Material volumtrico limpio

2. Fenmenos de contraccin de volmenes
3. Determinar uso del pH
4. Despus de preparada se debe filtrar y
desgasificar
19
Se debe filtrar por:
Partculas de la fase mvil taponan y

desgastan los filtros tuberas sellos y
rotor del inyector
Se efecta con membranas de 0.45 o

0.22 um de poro que eliminan
partculas y bacterias
Se recomienda descartar los primeros

mililitros por arrastrar partculas de la
membrana
Las muestras a inyectar tambin se

deben filtrar.
20
21
Se debe desgasificar por:
Liberacin de burbujas
bomba y celda del
detector
Eliminacin de oxigeno
Mtodos de desgasificacin:
Se pueden emplear mtodos por Temperatura, Presin y

Afinidad.
Temperatura favorece o no la disolucin del gas en la

fase
N2 Disminuye en agua pero en Benceno aumenta.
Presin : Si Disminuye, se disminuye la disolucin

del gas
A finidad : Son ms solubles en donde predomine

fuerzas diferentes a las propias del gas.
Reflujo, Burbujeo gas inerte, Ultrasonido, Vaco
23
24
Bomba
Funcin : Impulsar Fase mvil desde el Reservorio Inyector y la

columna
Caractersticas
Permitir caudal 0.1 a 10 mL/m
Generar presin hasta 6000 psi ( libras/pulgada )
Exactitud de caudal alto
Ruido Bajo ( Generacin de pulsos mnimos variacin de caudal)
Deriva Baja ( Ruido que se genera por el uso en un largo tiempo)
Sistema Corte: Poder parar cuando aumente o disminuya presin del
sistema
Material
Cuerpo en acero Inoxidable
Partes en contacto fase mvil : Zafiro, Rub, tefln , Acero
Se usa TITANIO cuando el acero es incompatible con muestras
biolgicas
25
Clases Bombas
vPistn ( Reciprocantes )
Mayora equipos la poseen, las hay 1, 2, 3 pistones. Bomba Tanden.
Desplazamiento Continuo ( Jeringas )

26
27
28
29
30
Porqu usar gradientes ?
31
32
33
34
Permite : Introducir la muestra en solucin interrumpir el

caudal .
Inyectores
Caractersticas
Fcil de operar
Inerte
Soportar altas presiones 7000 psi
Preciso en la cantidad de muestra introducida
Soportar altas temperaturas ( para mantener en
solucin polietilenos )
Biocompatible con la muestra TITANIO
Clases Inyectores
Septum: Elastmero (Cromatografa de gases )
Desprenden material
Perdida de presin
Necesario vencer la presin para inyectar
Necesita flujos altos
Poca reproducibilidad en la inyeccin
36
Clases Inyectores
Vlvulas: Bucles de muestras

Cuerpo fijo con un rotor y loop (intercambiable 5 a 2000 uL)
37
Vlvula
Vlvulas posee dos posiciones:
Posicin de llenado o carga : Fm pasa directo a la

columna Via Inyeccin a Presin atmosfrica
El loop se llena con 5 veces su capacidad
RDS=0.05%
Posicin de Inyeccin : Fm arrastra muestra del

loop y la lleva a la columna
38
39
40
DUCTOS TUBERIA
Para: uniones entre la fase mvil bomba Inyector.
Caractersticas
1. Inerte
2. Resistencia a la presin (Indeformable) Acero Inoxidable (316-314),
Polmeros (Polipropileno-tefln)
Acero 316 Tefln

Mayor Presin Menor Presin
Bomba Inyector Reservorio Solvente - Bomba
Inyector Columna Frasco desperdicios.
Columna Detector
Entre detectores en serie.
Su dimetro externo es estndar 1/16 de pulgada

Su dimetro interior va desde 0.2 a 0.7 mm
42
UNIONES
Permiten conectar las tuberas y los componentes
cromatogrficos
Caractersticas
Inertes a la fase Mvil

Cierre hermtico
Evitar volmenes muertos
Son dos piezas:
Macho Hembra
Frula + Tornillo Conector
43
44
Columnas
Funcin : contribuir a la separacin de los

analitos de una muestra.
Caractersticas
Tubo de acero Inoxidable > 600 psi.

Tubo de vidrio < 600 psi
Diametro interno Uniforme
45
Clases
1 Analticas 10 a 30cm
Las hay Rectas y helicoidales (se pierde eficiencia)

Dimetro interno 4 a 10 mm
Tamao partcula 5 a 10 um
Ms usadas 25cm - 4,6mm Dint Partcula 5um
3-7cm 1-4mm Dint Partcula 3um
2 Precolumnas
Aumento vida columna

Elimina material suspensin, contaminantes fase mvil y
sustancias que se unen irreversiblemente a la columna
Saturar fase mvil con fase estacionaria.
Rellenos Pelicular y Material poroso

Detectores
Funcin : Ver y ubicar en el tiempo y espacio la posicin de
cada uno de los componentes a la salida de la columna.
Caractersticas
1. Sensible
2. Amplio rango dinmico de respuesta
3. No destruir la muestra
4. Estable a la temperatura
5. Respuesta lineal
6. Alta relacin seal /ruido
7. No contribuir al ensanchamiento de la seal (Banda
extracolumna)
8. Responder a todos los solutos
9. Constante de tiempo baja (Velocidad de respuesta rpida)
47
Clasificacin
Generales Selectivos
* Miden propiedad fsica de la fm * Sensibles a propiedad del

Con y sin analto analto
Ej ndice de refraccin Ej UV- visible

Conductividad
48
Detector ndice de refraccin
Funcin : Medir la diferencia de Indice de refraccin

entre Solvente puro y solvente con analito
Caractersticas:
Detector Universal porque :

improbable Ir soluto = Ir solvente
No destructivo
Poco sensible
Lo afecta la temperatura
No se pueden emplear series eluotrpicas
49
50
Funcin : Medir la cantidad de luz que absorbe el soluto o

analito a una determinada longitud de onda
Caractersticas
Ms empleado.
Buena sensibilidad
Detector Ultravioleta - Visible
Buen rango lineal
No destructivo
Puede emplearse con gradientes eluotrpicos
Estable a cambios de caudal y temperatura
190-350 nm UV
Hasta 700nm Visible
Concentracin analito cumple la ley de Beer
A=a.b.c
52
Detector Ultravioleta Visible Onda fija
Longitud de trabajo prefijada
Generalmente se emplea 254nm - Lmpara de Hg
214nm Lmpara de Zn
229nm Lmpara de Cd
53
54
Onda Variable ( Espectrofotomtrico )
Longitud de mxima absorcin para el analito motivo

de estudio.
Lmpara de Deuterio o Xenn con filamento de

Wolframio
Arreglo de diodos
55
56
58
Detector Ultravioleta - Visible
De luz dispersada tras evaporacin
Se evapora fase mvil

Formacin suspensin analto en un gas ( N o Aire )
Haz de luz laser
Medida dispersin del haz
Mide un fotodiodo de Silicio
Electroqumico
Compuestos redox
1000 veces ms sensible que UV.
Necesita fases mviles conductivas
( Buffers dePO4 0.02M)
Electrodos de Au, C, Pt, Hg
60
61
Bases de la Separacin
Serie de Interacciones de la MUESTRA Fase mvil y Fase
estacionaria
Hidrofbica
Hidroflica
Puentes de H2
Momentos dipolares
Cargas electrostticas
Todo ello define la afinidad por fm o fe
afinidad fm elucin ms rpida

afinidad fe elucin ms lenta
Cada analito crea su propio equilibrio diferente al otro ello permite

la separacin.
Si Un analito A necesita ms volumen de elucin por ende mayor

tiempo
63
Cromatograma
Volumen de Elucin, de retencin total
Volumen muerto
Lnea base
Tiempo de retencin
Tiempo de retencin neto o relativo
Velocidad lineal ( u)
Factor de capacidad ( K ), Cte , coeficiente, razn de
distribucin (IUPAC)
Factor de separacin, de selectividad, de resolucin
Ancho de pico
Platos tericos, Altura plato terico
Asimetra
Resolucin
Eficiencia
64
65
Procesos de ensanchamiento de banda
El ensanchamiento demuestra la distribucin de un analito desde el momento de la

inyeccin.
Porque se sucede el ensanchamiento?
Por las diluciones que sufre el analito a medida que atraviesa el sistema
cromatogrfico y por efectos extracolumnares.
Analitos menos retenidos producen picos ms angostos
El ensanchamiento depende de la eficiencia (N) Platos tericos y calidad de ellos
Ensanchamiento intramolecular
Segn Van Deemter las contribuciones son 4:

Proceso multipasos ( caminos mltiples)
Difusin Longitudinal
Resistencia a la transferencia de masa en la fase mvil
Resistencia a la transferencia a la fase estacionaria
73
PROCESO MULTIPASO (A)
Difusin de EDDY y contribuye al ensanchamiento basado en el

Dimetro de la Partcula y por una constante del proceso de relleno y
calidad del empaquetamiento.
Este fenmeno es determinante cuando:
Tamao de partcula irregular

Columna mal empacada
74
DIFUSION LONGITUDINAL
(B/U)
Difusin del analito en todas las direcciones de la fase mvil.
Viscosidad de la fase mvil baja

Flujo de la fase mvil lenta
Coeficiente de difusin del analito es alto
75
RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA DE
MASA (C*U)
En la fase mvil
En la fase estacionaria
Flujos rpidos Porque entre menor volumen de flujo se efecta el

equilibrio fm= fe en ese menor volumen y por tanto se generan
picos ms pequeos
76
77
78
79
Ensanchamiento Extracolumnar
En condiciones normales los ensanchamientos solo se producen por efectos

columnares
Se sucede por: Desajustes en Inyeccin Tuberas, uniones y detector
Como los analitos ms retenidos generan picos ms anchos que los menos
retenidos este fenmeno afecta mas a los picos menos retenidos que son ms
agudos (Se nota mas)
Tuberias: A medida que aumenta su longitud , dimetro

Inyeccin: Demasiado volumen inyectado
Detector : Volumen geometra y tubera de conexin asi como la
velocidad de respuesta si es lenta se pueden unir picos y ensancharse
81
82
Material relleno columna
1. Morfologa: Esfrico o Irregular con tamao de 2 a 60 um de diametro
2. Porosidad: Relacin entre el volumen interno de los poros y el

volumen de la partcula
Poro: cavidades de mayor profundidad que dimetro, pueden ser abiertos o

cerrados
Area Superficial: Determina la capacidad de retencin de la fase

estacionaria
A menor dimetro del poro mayor rea superficial y mayor retencin
83
84
Estructura Qumica
La columna se conforma por una estructura

interna y una externa ( responsable de los
procesos de retencin )
La estructura EXTERNA se constituye por

grupos activos
Naturales
Productos de modificacin inducida
Productos de modificacin permanente
85
Estructura Qumica
La estructura INTERNA generalmente es SILICAGEL
Oxido de silicio hidratado

Slido amorfo y poroso de gran rea superficial( 30 a 500 )
Alto volumen de poro ( 0.4 a 1.2 mL/g) con un dimetro de 60 y 300 A
Es fuertemente higroscpico
La humedad bloquea y hace perder actividad
A 200C pierde agua y se condensan los grupos silinoles formando
puentes siloxanos volviendo la silica inactiva
Es insoluble en solventes apolares
Soluble en agua 100ppm a pH Neutro y Temp ambiente
La solubilidad aumenta con el pH (>7.5)
Preparacin fase ligada
Silicagel , almina, agarosa, copolmeros, divinilbenceno +

Compuesto con grupo funcional determinado.
1. Tipo ester (Si-OR)

2. Tipo Amino (Si-NR2)
3. Tipo Carbono (Si-CR3)
4. Tipo Siloxano (Si-O-SiR3)
88
89
90
91
Cromatografa Fase Reversa
Fase Estacionaria APOLAR

Fase mvil POLAR
VENTAJAS:
Compuestos ionicos , no ionicos e ionizables pueden separarse
en la misma columna, con la misma fase mvil
La fuerza de atraccin superficial es dbil
La adsorcin irreversible raramente ocurre
La fase mvil predominante es agua
El modificador orgnico es etanol o metanol
El orden de elucin es predecible en funcin hidrofobicidad
Los equilibrios del sistema se alcanzan rpido.
92
Fase Mvil (Reversa)
Es un solvente polar
Mezcla de Agua y un modificador orgnico

Se pueden agregar aditivos, sales, Boffers
A mayor proporcin de modificador orgnico menor retencin
(Menor K)
A mayor cantidad de agua Mayor retencin ( Mayor K)
Los solventes de mayor uso son:
Agua
Metano
Acetonitrilo Por Transparencia al UV y Viscocidad
Tetrahidrofurano
La selectividad es dada por los modificadores orgnicos
93
Fase Mvil(Reversa)
AGUA Es el carrier.
METANOL Modificador Orgnico ms utilizado por
Alto poder disolvente de sales y reactivos de apareamiento ionico

Poco txico , fcil adquisicin y purificacin
Bajo costo
DESVENTAJA Avido por el Oxigeno y genera mayor presin que los otros solventes
ACETONITRILO
Se almacena en el oscuro y bien cerrado por ser higroscpico

Ideal para longitudes de onda cortas 190nm
Solvente caro
TETRAHIDROFURANO
Forma facilmente peroxidos y se comercializa con antioxidantes que absorben al UV
DIOXANO Muy viscoso se usa en pocas proporciones
94
95
Mecanismo de Retencin Fase Reversa
96
97
Mecanismo de Retencin Fase

Reversa
Puede ser de 3 tipos
Particin entre fase mvil y estacionaria

Adsorcin sobre la fase estacionaria
Proceso mixto Particin- adsorcin
Teora Solvofbica: fuerzas intrasolvente ms fuertes que las generadas con el soluto obligando
al soluto a interactuar con la fase estacionaria
ACCION DE LA CADENA CARBONADA ( FASE LIGADA )
La ms empleada son cadenas alquilicas de 18 y 8 carbonos respectivamente

A mayor longitud de la cadena ms retencin
A mayor cobertura mayor retencin
A mayor hidrofobicidaad del soluto mayor retencin.
Ir de c1 a c22 la retencin aumenta 10 veces. 10% de modificador orgnico reduce la
retencin en 2 a 3 veces por tanto la fase mvil sobre la selectividad afecta ms que
la fase estacionaria.
Cadenas cortas producen picos ms simtricos ( por menor tiempo de retencin)
Ensanchamientos intracolumnnares y porque los silinoles libres interaccionan con la
fase mvil permitiendo equilibrios ms rpidos
98
Formas de cromatografa en fase reversa
1. Regular o de particin Simple La fase mvil son mezclas de agua y un modificador

orgnico ( hasta cuaternarias)
La retencin la gobierna la hidrofobicidad del soluto a Mayor polaridad menor retencin
( Fase mvil Polar)
A mayor proporcin de agua mayor retencin

A mayor proporcin de modificador menor retencin
Fuerza elutiva decrece asi THC> AcN> MeOH> AGUA
2 Control de ionizacin ( Supresin Inica )

Los solutos ionizables dan picos con baja retencin y baja simetra fenmeno que no se
corrige con un modificador orgnico;
3. De apareamiento ionico
4. Complejacin con iones metlicos Argentacin de la silicagel ( Cu, Cd, Ni, Zn. Ag )
Excelente para resolucin de isomeros geomtricos ( cis- Trans)
5. En medio no acuoso ( para aceites, grasas, Hidrocarburos )

Con solventes de muy baja polaridad pero polares frente a la fase estacionaria
99
100
101
102
103
Cromatografa Fase Normal
Fase Estacionaria POLAR

Fase mvil APOLAR
VENTAJAS :
Unico modo en HPLC que permite separar ismeros

posicionales con sustituyenyes polares.
MATERIALES DE RELLENO
Silica Proceso de adsorcin gobernado por los grupos

silinol ( vecinal ,geminal y aislado ) formando ptes de
hidrogeno.
Alumina carcter bsico
Fase ligada
104
Fase Mvil ( Normal )
Es un solvente apolar
Mezcla solventes
Se pueden agregar aditivos que actuan sobre sitios de fuerte
retencines causantes de irregularidades en la fase estacionaria
(Agua o solvente altamente polar)
A mayor proporcin de modificador menor retencin

(Menor K) aumentar la fuerza eluotropica del solvente en 0.05
disminuye k en 3 a 4 unidades
A mayor cantidad de agua menor retencin ( Menor K)
CUIDADO silica soluble en agua
105
Mecanismo de Retencin Fase

Normal
Competencia fase mvil - Superficie adsorbente

Competencia analito - Superficie adsorbente
Interacciones dipolo- dipolo

Puentes de hidrogeno
Transferencias de carga
Formacin de complejos Pi
106
107
Cromatografa Intercambio Inico
Fase Estacionaria GRUPOS FUNCIONALES IONICOS

Fase mvil SOLUCION ACUOSA DE pH
CLASES :
Aninica
Cationica
UTILIDAD
Solutos ionicos, ionizables y neutros con capacidad de

formar complejos ionicos. Generalmente Acidos, Bases y sus
sales
Esta cromatografia ha sido desplazada por cromatografia en

fase reversa ( Apareamiento ionico, Supresin ionica)
108
109
Mecanismo de Retencin
Intercambio Inico
Reacciones irreversibles entre soluto y fase estacionaria

Distribucin del soluto entre fase estacionaria y fase mvil
Competencia analito- Superficie adsorbente.
Ph = Pka forma ionica y no ionica coexistes 50%

Ph+2UNIDADES por encima del Pka 99% ionizado
Ph-2 UNIDADES por debajo del Pka 99% no ionizado por tanto
se pueden emplear modificadores organicos en este caso
110
Material relleno columna
Polmeros orgnicos
Intercambiadores fase ligada
Oxidos inorgnicos
Intercambiadores peliculares
Fase Mvil
Es un solucin acuosa de pH y fuerza ionica controlada por un
buffer.
111
Cromatografa Exclusin
Fase Estacionaria GELES BLANDOS, RIGIDOS

Fase mvil SOLVENTES Y AGUA
CLASES :
De filtracin por gel (Hidrosolubles)

De permeacion por gel ( Insolubles en agua )
UTILIDAD
Solutos de peso mayor a 2000 que presentan
problemas en otros metodos
112
Caractersticas Generales
Picos angostos (por Volumen elucin pequeo)

Tiempo de separacin cortos
Orden elucin predecible (por tamao)
No hay perdida de muestra
La resolucin no puede manipularse (Diferencia peso 10%)

Mecanismo de Retencin Exclusin
Tamao efectivo en solucin (Dimensin molecular)
Exclusin esterica
Mayor peso mayor tiempo
Menor tamao mayor tiempo
114
115
116
117

Curso HPLC PDF

Enviado por

Dados do documento

Descrição original:

Título original

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Curso HPLC PDF

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Facultad de Ciencias

Programa de Educacin Continua

Franklin Muoz Crdenas

Migracin entre zonas

v20% pueden separarse sin previo vLa fm es el parmetro fundamental de

vDetectores; Diferencian fm del analito, vDetectores; NO Diferencian fm del

vDestructivo no recupera muestra vNO Destructivo recupera muestra

Dnde est ? Qu se usa?

Propiedades de los solventes en HPLC

Alto poder solubilizante de las muestras

Preparacin fases mviles

Es necesario tener en cuenta;

1. Material volumtrico limpio

Se debe filtrar por:

Partculas de la fase mvil taponan y

Se efecta con membranas de 0.45 o

Se recomienda descartar los primeros

Las muestras a inyectar tambin se

Se debe desgasificar por:

Se pueden emplear mtodos por Temperatura, Presin y

Temperatura favorece o no la disolucin del gas en la

Presin : Si Disminuye, se disminuye la disolucin

A finidad : Son ms solubles en donde predomine

Reflujo, Burbujeo gas inerte, Ultrasonido, Vaco

Funcin : Impulsar Fase mvil desde el Reservorio Inyector y la

Desplazamiento Continuo ( Jeringas )

Porqu usar gradientes ?

Permite : Introducir la muestra en solucin interrumpir el

Septum: Elastmero (Cromatografa de gases )

Vlvulas: Bucles de muestras

Vlvulas posee dos posiciones:

Posicin de llenado o carga : Fm pasa directo a la

Posicin de Inyeccin : Fm arrastra muestra del

Acero 316 Tefln

Su dimetro externo es estndar 1/16 de pulgada

Inertes a la fase Mvil

Funcin : contribuir a la separacin de los

Tubo de acero Inoxidable > 600 psi.

Las hay Rectas y helicoidales (se pierde eficiencia)

Aumento vida columna

Rellenos Pelicular y Material poroso

* Miden propiedad fsica de la fm * Sensibles a propiedad del

Ej ndice de refraccin Ej UV- visible

Detector ndice de refraccin

Funcin : Medir la diferencia de Indice de refraccin

Detector Universal porque :

Funcin : Medir la cantidad de luz que absorbe el soluto o

Detector Ultravioleta Visible Onda fija

Longitud de trabajo prefijada

Generalmente se emplea 254nm - Lmpara de Hg

Onda Variable ( Espectrofotomtrico )

Longitud de mxima absorcin para el analito motivo

Lmpara de Deuterio o Xenn con filamento de

Detector Ultravioleta - Visible

De luz dispersada tras evaporacin

Se evapora fase mvil

Todo ello define la afinidad por fm o fe

afinidad fm elucin ms rpida

Cada analito crea su propio equilibrio diferente al otro ello permite

Si Un analito A necesita ms volumen de elucin por ende mayor

Procesos de ensanchamiento de banda

El ensanchamiento demuestra la distribucin de un analito desde el momento de la